熊秋迎，熊 欣，胡秀華，涂露霞，熊振芳△

(1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，南昌 330006；2.江西省南昌市洪都中醫(yī)院急診科 330038)

K-ras基因狀態(tài)及ras蛋白表達(dá)在胃印戒細(xì)胞癌免疫表型分類中的意義*

熊秋迎1，熊 欣1，胡秀華2，涂露霞1，熊振芳1△

(1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，南昌 330006；2.江西省南昌市洪都中醫(yī)院急診科 330038)

目的 探討K-ras基因狀態(tài)及ras蛋白表達(dá)在胃印戒細(xì)胞癌免疫表型分類中的意義。方法 應(yīng)用組織芯片免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)180例胃印戒細(xì)胞癌組織中ras蛋白的表達(dá)；PCR擴(kuò)增和DNA直接測(cè)序法檢測(cè)癌組織中K-ras基因12、13密碼子的突變情況。結(jié)果 ras蛋白陽(yáng)性50例(27.8%)，ras蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在腸型印戒細(xì)胞癌中顯著高于胃型和混合型印戒細(xì)胞癌(P<0.05)。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組織中， ras蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織(P<0.05)；隨著腫瘤侵襲、演進(jìn)及臨床分期的升高，ras蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯增高(P<0.05)。K-ras基因突變型22例(12.2%)。所有突變位點(diǎn)均位于12密碼子，突變類型包括：GGT→AGT 1例，GGT→TGT 1例，GGT→GCT 2例，GGT→GTT 8例，GGT→GAT 10例。13密碼子未發(fā)現(xiàn)突變。腸型印戒細(xì)胞癌K-ras基因突變率顯著高于胃型和混合型印戒細(xì)胞癌(P<0.05)。K-ras基因突變型病例ras蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于K-ras基因野生型病例(P<0.05)。Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示， ras蛋白表達(dá)與K-ras基因突變呈正相關(guān)(r=0.61，P<0.05)。結(jié)論 ras蛋白的過(guò)表達(dá)可能與胃印戒細(xì)胞癌侵襲潛能、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，ras蛋白表達(dá)和K-ras基因突變與腫瘤的免疫表型變化存在相關(guān)性，它們?cè)诎┘?xì)胞表型轉(zhuǎn)化過(guò)程中可能起到一定作用。

胃腫瘤；基因，ras；蛋白質(zhì)；印戒細(xì)胞癌；K-ras基因；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；靶向治療

胃印戒細(xì)胞癌是胃腺癌中特殊的組織學(xué)亞型，細(xì)胞含豐富黏液，該類型主要呈彌漫侵襲性生長(zhǎng)，進(jìn)展迅速，預(yù)后差。本研究前期資料顯示胃印戒細(xì)胞癌的胃腸免疫標(biāo)記表達(dá)模式可能反映腫瘤的演進(jìn)潛能，說(shuō)明可能存在不同的分子遺傳學(xué)背景[1]。K-ras基因?qū)儆赗as基因超家族，是重要的癌基因，第12、13密碼子點(diǎn)突變是其常見(jiàn)的突變位點(diǎn)，可導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。ras蛋白是表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)傳導(dǎo)通路中關(guān)鍵的信號(hào)分子，當(dāng)K-ras基因突變后，ras發(fā)生構(gòu)象變化，從而失去細(xì)胞傳導(dǎo)作用，刺激細(xì)胞分裂、增殖，導(dǎo)致細(xì)胞癌變[2]。目前，K-ras基因已成為結(jié)直腸癌分子靶向治療靶點(diǎn)之一。因此，本研究對(duì)腸型印戒細(xì)胞癌是否存在K-ras基因突變，并對(duì)其生物學(xué)行為及個(gè)體化治療有關(guān)的問(wèn)題進(jìn)行研究。本研究通過(guò)檢測(cè)K-ras基因狀態(tài)及ras蛋白在不同免疫表型胃印戒細(xì)胞癌中表達(dá)差異，探討ras蛋白和K-ras基因與印戒細(xì)胞癌的胃、腸分型的關(guān)系及其作為分子治療靶點(diǎn)在靶向治療中的可能性，為制訂個(gè)性化治療方案和評(píng)估預(yù)后提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2004年10月至2010年12月手術(shù)切除的180例胃印戒細(xì)胞癌組織，術(shù)前未行放、化療。其中，男74例，女106例；年齡16～84歲，中位年齡47歲；黏膜內(nèi)癌57例，早期黏膜下浸潤(rùn)癌 40 例，進(jìn)展期癌 83 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移77例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移103例；有脈管浸潤(rùn)74例，無(wú)脈管浸潤(rùn)106例；有神經(jīng)浸潤(rùn)60例，無(wú)神經(jīng)浸潤(rùn)120例；TNM分期中，Ⅰ期91例，Ⅱ期10例，Ⅲ期33例，Ⅳ期46例。胃印戒細(xì)胞癌免疫表型分型：本組前期研究[1]根據(jù)胃印戒細(xì)胞癌胃、腸免疫表型標(biāo)記[胃免疫表型特異性標(biāo)記物：黏液素(MUC)1、MUC5AC、MUC6；腸免疫表型特異性標(biāo)記物：MUC2、果蠅相關(guān)同源異形框轉(zhuǎn)錄因子(CDX2)]表達(dá)差異，將其分為3型：胃型印戒細(xì)胞癌(只表達(dá)胃免疫表型標(biāo)記物)67例，腸型印戒細(xì)胞癌(只表達(dá)腸免疫表型標(biāo)記物)42例，混合型印戒細(xì)胞癌(胃、腸免疫表型標(biāo)記物均表達(dá))71例。

1.2 方法

1.2.1 ras蛋白檢測(cè) 采用Envision-IHC法檢測(cè)組織芯片中ras蛋白的表達(dá)情況，ras蛋白多克隆抗體購(gòu)自Novocastra公司，即用型工作液。以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒判定為陽(yáng)性。

1.2.2 PCR擴(kuò)增和DNA直接測(cè)序法檢測(cè)K-ras基因突變 石蠟包埋腫瘤組織DNA提取、PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物在測(cè)序儀(ABI PRISM310)上完成測(cè)序，測(cè)序試劑為Big Dye terminator v2.0,采用DNA Star軟件進(jìn)行序列分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)、Fisher精確檢驗(yàn)和 Spearman等級(jí)相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ras蛋白表達(dá)與印戒細(xì)胞癌免疫表型分類及臨床病理參數(shù)的關(guān)系 180例胃印戒細(xì)胞癌中，ras蛋白陽(yáng)性50例，表達(dá)率為27.8%。腸型病例ras蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于胃型和混合型病例，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例中，ras蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著腫瘤侵襲、演進(jìn)及臨床分期的升高，ras蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯增高，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1、圖1。

2.2 K-ras基因突變與印戒細(xì)胞癌免疫表型分類及臨床病理參數(shù)的關(guān)系 180例癌組織中，K-ras基因突變22例，突變率為12.2%。所有突變位點(diǎn)均位于K-ras基因12密碼子，突變類型包括：GGT→AGT 1例，GGT→TGT 1例，GGT→GCT 2例，GGT→GTT 8例，GGT→GAT 10例。13密碼子未發(fā)現(xiàn)突變。腸型病例K-ras基因突變率顯著高于胃型和混合型病例，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而K-ras基因突變率與臨床病理參數(shù)之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1、圖2。

表1 不同免疫表型組K-ras基因狀態(tài)及ras蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

續(xù)表1 不同免疫表型組K-ras基因狀態(tài)及ras蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

圖1 腫瘤細(xì)胞ras蛋白陽(yáng)性圖(EnVision法，×200)

2.3 K-ras基因突變與ras蛋白表達(dá)的關(guān)系 22例K-ras基因突變型病例中，ras蛋白陽(yáng)性表達(dá)13例，陽(yáng)性率為59.1%。在158例K-ras基因野生型病例中， ras蛋白陽(yáng)性表達(dá)37例，陽(yáng)性率為23.4%。K-ras基因突變型病例ras蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于K-ras基因野生型病例，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，ras蛋白表達(dá)與K-ras基因突變呈正相關(guān)(r=0.61，P<0.05)。

A:GGT→GAT；B:GGT→GTT；C：GGT→AGT；D：GGT→TGT；E：GGT→GCT。

圖2 K-ras基因12密碼子突變類型

3 討 論

胃印戒細(xì)胞癌發(fā)病率在胃腺癌中占3.4%～39.0%[3-5]。它起源于黏膜固有層內(nèi)腺頸部未分化的干細(xì)胞，細(xì)胞富含黏液[6]。與其他類型腺癌比較，印戒細(xì)胞癌具有分化差、侵襲性強(qiáng)、進(jìn)展迅速、預(yù)后差等特點(diǎn)，是胃腺癌中最特殊的組織病理學(xué)類型。

K-ras基因是重要的原癌基因，編碼相對(duì)分子質(zhì)量為21×103的ras蛋白,而ras蛋白是EGFR傳導(dǎo)通路中關(guān)鍵的信號(hào)分子，當(dāng)K-ras基因突變后，ras蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，不受上游EGFR信號(hào)通路的控制，不斷刺激細(xì)胞無(wú)休止地分裂、增殖[7-8]。

在實(shí)際工作中，K-ras基因已成為結(jié)直腸癌分子靶向治療的標(biāo)靶之一，隨著對(duì)胃癌基因分子分型研究的不斷深入，其治療的分子標(biāo)靶逐漸成為研究的熱點(diǎn)?；诖?，本課題組前期研究即根據(jù)胃印戒細(xì)胞癌胃、腸免疫表型標(biāo)記表達(dá)差異，將其分為胃型、腸型和混合型3個(gè)不同類型，發(fā)現(xiàn)這3個(gè)類型預(yù)后存在差異[1]。而本研究結(jié)果顯示，ras蛋白表達(dá)和K-ras基因突變狀態(tài)于3組間亦存在差異。腸型病例中ras蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于胃型和混合型病例，這說(shuō)明ras蛋白可能與腫瘤的胃、腸免疫表型變化存在相關(guān)性，在癌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化過(guò)程中可能起到一定作用。Gimori等[9]研究顯示，ras蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間無(wú)相關(guān)性；Atkar等[10]資料表明， ras蛋白表達(dá)程度與腫瘤的分化程度有關(guān)；Okumura等[11]的結(jié)果則說(shuō)明ras蛋白可能增強(qiáng)腫瘤的浸潤(rùn)進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。本研究結(jié)果顯示，隨著ras蛋白表達(dá)升高，瘤組織更易進(jìn)展、浸潤(rùn)，且更易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，說(shuō)明ras蛋白表達(dá)與差的腫瘤生物學(xué)行為及腫瘤演進(jìn)有一定相關(guān)性， ras蛋白可能參與腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和擴(kuò)散，在一定程度上能夠反映腫瘤的生物學(xué)行為。有文獻(xiàn)報(bào)道ras蛋白的高表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞溶解細(xì)胞外基質(zhì)和膠原纖維，使細(xì)胞獲得較強(qiáng)的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移潛能[12]，這是否能促進(jìn)癌細(xì)胞的血道、淋巴道及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，尚待進(jìn)一步研究。

近年來(lái)研究者發(fā)現(xiàn)，胃腺癌中也存在一定比例K-ras基因突變，與胃癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是胃癌發(fā)生的早期事件[13-15]。本研究顯示在胃印戒細(xì)胞癌中，K-ras基因突變率僅為12.2%，突變率較其他胃腺癌類型偏低，且突變位點(diǎn)集中在12密碼子，13密碼子未發(fā)現(xiàn)突變，說(shuō)明在印戒細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中，K-ras基因突變不起主導(dǎo)作用，突變位點(diǎn)較其他類型胃腺癌也存在差異。與胃型和混合型病例相比，腸型病例有較高的K-ras基因突變率，這表明K-ras基因突變對(duì)胃、腸表型變化有重要作用，證實(shí)了這種免疫表型分型存在不同的分子遺傳學(xué)背景。本研究還顯示，K-ras基因突變與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度、臨床分期等均無(wú)顯著相關(guān)性，因此進(jìn)一步研究參與胃印戒細(xì)胞癌侵襲、轉(zhuǎn)移的信號(hào)傳導(dǎo)通路，闡明腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，尋找新的分子治療靶點(diǎn)具有十分重要的意義。

由于腸型印戒細(xì)胞癌存在較高的ras蛋白表達(dá)和K-ras基因突變率，對(duì)其個(gè)體化治療有無(wú)價(jià)值，需要對(duì)ras及相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)一步研究。

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Significance of K-ras gene status and ras protein expression in immunophenotypic classification of gastric signet ring cell carcinoma*

XiongQiuying1,XiongXin1,HuXiuhua2,TuLuxia1,XiongZhenfang1△

(1.DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China; 2.DepartmentofEmergencyWard,HongduChineseMedicineHospital,Nanchang,Jiangxi330038,China)

Objective To investigate the significance of K-ras gene status and ras protein expression in immunophenotypic classification of gastric signet ring cell carcinoma.Methods The expression of ras protein in 180 cases of gastric signet-ring cell carcinoma was detected by tissue microarray immunohistochemistry.Meanwhile,the mutation in codon 12,13 of K-ras gene was determined by using PCR-based DNA direct sequencing analysis.Results The rate of ras protein expression was 27.8%.The rate of ras protein expression in intestinal phenotype was significantly higher than those in gastric and gastrointestinal phenotypes(P<0.05).The rate of ras protein expression in cases with lymph node metastasis was significantly higher than those in cases without nodal involvement(P<0.05).The rate of ras protein expression was significantly higher in cases with deeper invasion(P<0.05).The frequency of K-ras gene mutation was 22(12.2%).All of them were found in codon 12.The types of mutation included GGT→AGT(1 case)，GGT→TGT(1 case)，GGT→GCT (2 cases),GGT→GTT (8 cases) and GGT→GAT(10 cases).K-ras mutation was significantly associated with intestinal phenotype(P<0.05).The rates of ras protein expression in cases with mutational type of K-ras gene was higher than those in cases with wild type(P<0.05).The ras protein expression was positively associated with K-ras gene mutation(r=0.61,P<0.05).Conclusion The ras protein expression is correlated with nodal involvement and invasion.K-ras gene mutation and expression of ras protein is related to phenotypic classification,and they might influence the phenotypic transformation in gastric signet ring cell carcinoma.

stomach neoplasms；genes,ras；proteins；signet ring cell carcinoma;K-ras gene;lymph node metastasis;targeting therapy

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.15.004

江西省衛(wèi)生計(jì)生委科技計(jì)劃項(xiàng)目(20155179)。 作者簡(jiǎn)介：熊秋迎(1976-)，主管技師，本科，主要從事腫瘤分子病理學(xué)及病理技術(shù)方面研究?！?/p>

，E-mail:xiongzhenfang0408@126.com。

R735.2

A

1671-8348(2017)15-2027-03

2016-11-20

2017-01-08)