王幫國(guó),林 琳,余振宇,李 洋,姜紹通

(合肥工業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工研究院,合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽合肥 230009)

白鰱魚(yú)肌肉脂肪氧合酶提取條件優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究

王幫國(guó),林 琳,余振宇,李 洋,姜紹通*

(合肥工業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工研究院,合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽合肥 230009)

本文以白鰱魚(yú)肌肉為原料,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)白鰱魚(yú)肌肉脂肪氧合酶(LOX)提取條件進(jìn)行優(yōu)化;用圓二色譜法和熒光光譜法對(duì)其貯藏穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、最適pH進(jìn)行研究;探討磷酸鹽緩沖液pH、離子強(qiáng)度、二硫蘇糖醇(DTT)和乙二胺四乙酸(EDTA)添加量對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX提取工藝的影響。結(jié)果表明,白鰱魚(yú)肌肉LOX適宜提取條件為磷酸鹽緩沖液pH7.8、離子強(qiáng)度50 mmol/L、EDTA和DTT添加量均為2 mmol/L,在此條件下提取白鰱魚(yú)肌肉LOX的酶液濃度為(1.98±0.037) mg/mL,活力為(244.44±5.93) U。通過(guò)對(duì)LOX酶學(xué)性質(zhì)研究可知,白鰱魚(yú)肌肉LOX在常溫條件下0～2 d內(nèi)酶活性較為穩(wěn)定,最適作用溫度為40 ℃,最適pH為7.8。

白鰱魚(yú),脂肪氧合酶,提取條件,酶學(xué)性質(zhì)

我國(guó)是世界淡水漁業(yè)第一大國(guó),2015年我國(guó)淡水產(chǎn)品產(chǎn)量3290.04萬(wàn)t,占我國(guó)水產(chǎn)品總產(chǎn)量的49.11%。白鰱生長(zhǎng)周期短、抗病能力強(qiáng)、產(chǎn)量高,而且肉質(zhì)鮮嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富,養(yǎng)殖產(chǎn)量位居淡水魚(yú)類(lèi)第二,是四大家魚(yú)之一[1-3]。近年來(lái)白鰱魚(yú)主要以鮮銷(xiāo)為主,工業(yè)化加工發(fā)展緩慢,其中土腥味是制約鰱魚(yú)加工發(fā)展的重要因素之一[4]。

白鰱魚(yú)在貯藏與加工過(guò)程中,會(huì)出現(xiàn)腥味明顯增強(qiáng)的現(xiàn)象,大大影響了消費(fèi)者對(duì)白鰱魚(yú)及其制品的喜愛(ài)。據(jù)已有報(bào)導(dǎo),導(dǎo)致白鰱魚(yú)在貯藏和加工過(guò)程中腥味增加的原因主要是有兩個(gè)方面,一是由于自身不飽和脂肪酸嚴(yán)重氧化生成的揮發(fā)性成分,二是來(lái)源于白鰱魚(yú)養(yǎng)殖過(guò)程中飲食和周?chē)h(huán)境中物質(zhì)在體內(nèi)的堆積[5]。目前認(rèn)為導(dǎo)致白鰱魚(yú)腥味加重主要是因?yàn)榘做桇~(yú)體內(nèi)的脂肪氧合酶催化降解不飽和脂肪酸產(chǎn)生的各種醛類(lèi)物質(zhì)引起的,不同種魚(yú)的特征性風(fēng)味物質(zhì)均是由其體內(nèi)的LOX所決定的。Fu等[6-7]研究表明,白鰱魚(yú)體內(nèi)主要含有12-LOX,其能快速催化分解不飽和脂肪酸,產(chǎn)生和鰱魚(yú)腥味密切相關(guān)的醛類(lèi)物質(zhì)。

脂(肪)氧合酶(LOX,EC1.13.11.12)是一種氧化還原蛋白酶,能催化含順,順-1,4-戊二烯結(jié)構(gòu)的不飽和脂肪酸,生成具有共軛雙鍵的不飽和脂肪酸的氫過(guò)氧化物[8-9],目前普遍認(rèn)為L(zhǎng)OX的催化中心與Fe離子有關(guān),其活化態(tài)為高自旋的氧化型Fe3+,非活化態(tài)為高自旋的還原型Fe2+[10-13]。白鰱魚(yú)肌肉LOX氧化會(huì)造成不飽和脂肪酸含量下降,降低魚(yú)肉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,大大影響鰱魚(yú)肉在貯藏和加工過(guò)程中的品質(zhì),為了更好地研究白鰱腥味物質(zhì)的產(chǎn)生機(jī)理和途徑,研發(fā)新型脫腥工藝,保持白鰱魚(yú)加工過(guò)程中的品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,本文以白鰱魚(yú)肉為原料,從中提取LOX,對(duì)酶的提取條件進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)LOX的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究,為白鰱的土腥味控制和精深加工提供技術(shù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活白鰱魚(yú) 合肥市馬鞍山路家樂(lè)福超市,條重(1100±200) g。磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、DTT、EDTA、硫酸銨、亞油酸、硼酸、硼砂、吐溫20 分析純?cè)噭?/p>

JJ-2型組織搗碎機(jī) 江蘇省金壇市城西崢嶸實(shí)驗(yàn)儀器廠;HC-3018R高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市白塔新寶儀器廠;Jasco-810-CD圓二色譜儀 日本Jasco公司;SHIMADZU RF-5301PC熒光分光光度計(jì) 島津(香港)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白鰱魚(yú)肌肉LOX的提取 參照Gata等[14]方法稍加修改,將鮮活白鰱魚(yú)宰殺,于冰袋中帶回實(shí)驗(yàn)室,然后置于裝滿(mǎn)冰的冰盒中去頭尾和內(nèi)臟,用冷水洗凈,去脊骨和魚(yú)皮,手工采集背部白色肌肉;將新鮮肌肉置于組織搗碎機(jī)中,添加4倍體積的50 mmol/L pH7.4 磷酸緩沖液(含1 mmol/L DTT、1 mmol/L EDTA,4 ℃),12000 r/min勻漿1.5 min;勻漿后緩沖液進(jìn)行冷凍離心(10000×g,60 min),上清液加入13.4 g/100 mL研碎無(wú)水硫酸銨,冷凍離心(10000×g,30 min),取上清液加入14.3 g/100 mL研碎無(wú)水硫酸銨冷凍離心,沉淀等量溶于磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L,pH7.4)中,即粗酶液。

1.2.2 白鰱魚(yú)肌肉LOX酶活、酶液濃度的測(cè)定 采用紫外分光光度法[3]測(cè)定酶活:用Tween-20(最終濃度0.1 mL/100 mL)做為乳化劑,將亞油酸(最終濃度10 mmol/L)分散在10 mmol/L硼酸緩沖液(pH9.0)中,置于4 ℃冰箱中備用。250 μL上述底物和50 μL LOX酶液添加到1.7 mL磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L,pH7.4),立刻計(jì)時(shí),測(cè)定其在234 nm吸光度的增加值。吸光度增加0.001/min定義為1酶活力單位。

酶液濃度采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白質(zhì)濃度,標(biāo)準(zhǔn)品選用牛血清蛋白。

1.2.3 白鰱魚(yú)肌肉LOX圓二色譜檢測(cè)方法 采用圓二色譜法(CD)對(duì)LOX的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定。以磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L,pH7.8)作為空白對(duì)照,先將LOX粗酶液稀釋至0.1～0.2 mg/mL,CD光譜掃描范圍190～250 nm,樣品池光程1 mm,掃描速度100 nm/min,常溫(25 ℃)下重復(fù)掃描4次,得到LOX粗酶液CD光譜,用平均摩爾橢圓率[θ]表示CD色性,單位deg·cm2/mol。

1.2.4 白鰱魚(yú)肌肉LOX熒光強(qiáng)度的檢測(cè) 蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸具有內(nèi)源熒光性,此類(lèi)蛋白在外加光源激發(fā)情況下會(huì)發(fā)射內(nèi)源熒光,熒光光譜會(huì)隨著芳香族氨基酸基團(tuán)位置和微環(huán)境的變化而發(fā)生改變,所以通過(guò)熒光光譜的變化可以用來(lái)分析蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化趨勢(shì)[15-16]。以磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L,pH7.8)作為空白對(duì)照,先將LOX粗酶液稀釋至0.01～0.05 mg/mL,用熒光光譜儀進(jìn)行掃描,激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm,掃描波長(zhǎng)為220～700 nm,速度240 nm/min,常溫(25 ℃)下重復(fù)掃描3次。

1.3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.3.1 白鰱魚(yú)肌肉LOX提取條件優(yōu)化 緩沖液pH對(duì)酶的提取至關(guān)重要,首先應(yīng)保證在蛋白質(zhì)穩(wěn)定的范圍內(nèi),即選擇在偏離等電點(diǎn)兩側(cè),以增大蛋白質(zhì)的溶解度,提高提取效果,另外選擇合適的pH可以使蛋白質(zhì)在緩沖液中的共穩(wěn)定性及溶解度均有所增加[17]。緩沖液離子強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)提取同樣重要,離子強(qiáng)度較低時(shí),鹽析作用不明顯,會(huì)造成蛋白質(zhì)無(wú)法充分溶解到緩沖液中,較高時(shí)則會(huì)造成大量雜蛋白提取到緩沖液中[18]。

EDTA作為金屬離子螯合劑,能和堿金屬、稀土元素和過(guò)渡金屬等形成穩(wěn)定的水溶性絡(luò)合物,可以有效消除蛋白質(zhì)提取過(guò)程中金屬離子對(duì)蛋白質(zhì)的影響,減少因?yàn)榻饘匐x子存在而引起的變性;但是濃度過(guò)高時(shí),會(huì)影響蛋白質(zhì)的溶解性,并抑制酶的活性[17-18]。DTT是一種很強(qiáng)的還原劑,可以保持蛋白質(zhì)中-SH的還原態(tài),對(duì)于活性中心含有-SH的酶有保護(hù)作用,同時(shí)防止體系內(nèi)氧化類(lèi)物質(zhì)氧化作用對(duì)酶的影響。但是DTT的作用是還原cys上被氧化的SH,可以把二硫橋拆開(kāi),影響蛋白質(zhì)三級(jí)構(gòu)象,從而影響酶的活性[19-20]。

因此以磷酸緩沖液pH、離子強(qiáng)度以及EDTA添加量和DTT的添加量作為單因素,研究不同因素水平下對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX提取的影響,然后選取合適的因素水平,得到白鰱魚(yú)肌肉LOX提取的最佳條件,以LOX酶活、酶液濃度作為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。

固定離心速率為10000×g、60 min,分別設(shè)定pH為6.6、7.0、7.4、7.8、8.2、8.6,離子強(qiáng)度為0、25、50、75、100 mmol/L,EDTA和DTT濃度均為0、1、2、4、8 mmol/L;離心后上清液在4 ℃下收集無(wú)水硫酸銨20%～40%飽和度組分,然后重溶于磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L,pH7.4),得到白鰱魚(yú)肌肉LOX酶液,對(duì)其酶活、濃度測(cè)定,研究不同單因素對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX提取的影響。

白鰱魚(yú)肌肉LOX提取工藝流程圖：新鮮白鏈魚(yú)→手工采集背部肌肉→加入磷酸鹽緩沖液攪碎勻漿→冷凍離心→加入無(wú)水硫酸氨收集20%～40%飽和組分→沉淀重溶于磷酸鹽緩沖液→粗酶液

1.3.2 白鰱魚(yú)肌肉LOX酶學(xué)特性 對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX的貯藏穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性進(jìn)行研究;貯藏穩(wěn)定性:將酶液分別在常溫(25±3) ℃下貯藏1～7 d,熱穩(wěn)定性:在4、20、30、40、50、60、70、80、90、100 ℃下分別恒溫水浴加熱20 min；pH穩(wěn)定性:將LOX分別溶于6.6、7.0、7.4、7.8、8.2、8.6的磷酸緩沖液(50 mmol/L)中,分別測(cè)定其酶活、二級(jí)構(gòu)象、三級(jí)構(gòu)象變化,研究白鰱魚(yú)肌肉LOX酶學(xué)性質(zhì)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三組平行實(shí)驗(yàn),所有數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel進(jìn)行整理分析,測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,圓二色譜圖和熒光光譜圖采用Origin9.0作圖軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 白鰱魚(yú)肌肉LOX提取條件優(yōu)化

2.1.1 磷酸鹽緩沖液pH對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX提取的影響 由圖1可知,其在pH7.8提取條件下酶活最高,當(dāng)pH7.4～pH8.2之間時(shí),LOX酶液濃度較高,說(shuō)明此時(shí)緩沖液pH偏離白鰱魚(yú)肌肉LOX等電點(diǎn),LOX酶液較為穩(wěn)定。酸性條件不利于白鰱魚(yú)肌肉LOX的提取。因此得出白鰱魚(yú)肌肉的適宜提取pH為7.8。

圖1 磷酸鹽緩沖液pH對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX酶活、濃度的影響Fig.1 The influence of phosphate buffer pH on the activity,concentration of silver carp muscle LOX

2.1.2 磷酸鹽緩沖液離子強(qiáng)度對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX提取的影響 由圖2可知,當(dāng)離子強(qiáng)度低于50 mmol/L時(shí),隨著緩沖液離子強(qiáng)度的增加,鹽析作用逐漸增強(qiáng),酶液濃度不斷增大,酶活也逐漸升高;當(dāng)離子強(qiáng)度大于50 mmol/L時(shí),鹽析作用進(jìn)一步增強(qiáng),酶液濃度不斷增大,但酶活保持在較高水平,變化較小,此時(shí)會(huì)有部分雜蛋白被提取到酶液中,影響酶液純度,因此LOX提取緩沖液適宜的離子強(qiáng)度為50 mmol/L。

圖2 離子強(qiáng)度對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX酶活、濃度的影響Fig.2 The influence of phosphate buffer lonic strength on the activity,concentration of silver carp muscle LOX

2.1.3 EDTA和DTT添加量對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX提取的影響 由圖3可知,當(dāng)EDTA濃度低于2 mmol/L時(shí),酶活呈上升趨勢(shì),當(dāng)濃度在2～8 mmol/L時(shí),酶活變化較小,呈略微下降趨勢(shì);DTT濃度為2 mmol/L時(shí),酶活最高,大于2 mmol/L時(shí),酶活明顯降低。由于EDTA和DTT濃度均較小,所以對(duì)LOX酶液濃度影響較小,無(wú)決定作用。因此,白鰱魚(yú)肌肉LOX提取適宜的EDTA和DTT濃度均為2 mmol/L。

圖3 EDTA、DTT添加量對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX酶活、濃度的影響Fig.3 The influence of added amount of EDTA, DTT on the activity,concentration of silver carp muscle LOX

在最優(yōu)提取條件磷酸緩沖液pH7.8、離子強(qiáng)度50 mmol/L、EDTA和DTT添加量均為2 mmol/L下,白鰱魚(yú)肌肉LOX酶活為(244.44±5.93) U、酶液濃度為(1.98±0.037) mg/mL。

2.2 白鰱魚(yú)肌肉LOX酶學(xué)特性研究

2.2.1 白鰱魚(yú)肌肉LOX貯藏穩(wěn)定性 將白鰱魚(yú)肌肉LOX酶液在常溫條件下放置1～7 d,每天對(duì)LOX進(jìn)行酶活、CD光譜、熒光光譜測(cè)定,結(jié)果如圖4～圖6所示。

由圖4可知,隨著時(shí)間增加,LOX酶活不斷降低,在0～2 d時(shí),下降趨勢(shì)比較小,2 d過(guò)后,急劇下降,6 d時(shí),基本完全失活。

圖4 貯藏時(shí)間對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX酶活的影響Fig.4 The influence of storage time on the activity of silver carp muscle LOX

圓二色譜光譜法(CD)作為分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)最常用簡(jiǎn)便的方法,可以有效分析計(jì)算白鰱魚(yú)肌肉LOX的α-螺旋和β-折疊等各組分的含量,進(jìn)一步研究白鰱魚(yú)肌肉LOX在不同條件下的二級(jí)構(gòu)象變化[21]。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中主要的光活性基團(tuán)是肽鏈骨架中的肽鍵,一般認(rèn)為α-螺旋特征吸收峰在208 nm和222 nm左右,其在208 nm處橢圓率能夠反映蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)變化;典型β-折疊在214 nm左右有一特征吸收負(fù)峰;無(wú)規(guī)則卷曲在220 nm左右有一小而寬的正峰[22-23]。由圖5可知,LOX的CD光譜在208 nm和222 nm處均有明顯的負(fù)峰,在214 nm處有一負(fù)峰,還在220 nm左右有一很微弱正峰,說(shuō)明白鰱魚(yú)肌肉LOX中包含有α-螺旋、β-折疊、無(wú)規(guī)則卷曲等蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu);隨著貯藏時(shí)間增加,LOX的CD光譜在208 nm處的負(fù)峰和214 nm處的負(fù)峰強(qiáng)度都有所下降,在2 d以后下降尤為明顯,說(shuō)明LOX在貯藏過(guò)程中二級(jí)結(jié)構(gòu)不斷變化,在0～2 d,二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)較穩(wěn)定,2 d以后變化較大。

圖5 貯藏時(shí)間對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX二級(jí)構(gòu)象的影響Fig.5 The influence of storage time on the secondary conformation of silver carp muscle LOX

圖6 貯藏時(shí)間對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX三級(jí)構(gòu)象的影響Fig.6 The influence of storage time on the tertiary conformation of silver carp muscle LOX

在295 nm激發(fā)波長(zhǎng)下,含有芳香族氨基酸殘基如色氨酸(tryptophan,Trp)、酪氨酸(tyrosine,Tyr)和苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)殘基的蛋白質(zhì)會(huì)產(chǎn)生熒光,稱(chēng)為內(nèi)源性熒光。其中Trp的熒光強(qiáng)度最大,因而內(nèi)源熒光分析的主要對(duì)象為T(mén)rp,通常被用來(lái)研究蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)[24-25]。圖6是常溫下貯藏不同時(shí)間的LOX內(nèi)源熒光光譜圖,在344 nm處有很強(qiáng)的Trp熒光峰,隨著貯藏時(shí)間的增加熒光峰形狀及出峰未知無(wú)變化,但貯藏時(shí)間增加后,熒光強(qiáng)度受到很大影響,這與LOX中Trp所處的微環(huán)境有很大關(guān)系;隨著時(shí)間增加,Trp的熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng),說(shuō)明LOX中的Trp因?yàn)榈鞍踪|(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變不斷由分子內(nèi)部非極性環(huán)境逐漸暴露在分子外部極性環(huán)境中,因此可以說(shuō)明,隨著時(shí)間的推移,LOX的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。

圖7 不同溫度對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX酶活的影響Fig.7 The influence of temperatures on the activity of silver carp muscle LOX

2.2.2 白鰱魚(yú)肌肉LOX熱穩(wěn)定性 由圖7可知,LOX在4～40 ℃時(shí),隨著溫度升高,脂肪氧合酶的溶解度增大,分散度上升,增加了脂肪氧合酶的活化分子數(shù),與底物的親和力也逐漸增強(qiáng),酶活也逐漸增大;40 ℃時(shí)酶活最高,當(dāng)溫度大于40 ℃時(shí),高溫導(dǎo)致脂肪氧合酶變性,在酶液中的溶解度降低,分散度下降,使酶活迅速降低,70 ℃基本完全失活。圖8為白鰱魚(yú)肌肉LOX經(jīng)不同溫度處理后CD光譜圖。由圖8可知,在4～40 ℃時(shí),208 nm和214 nm處負(fù)峰均呈微弱變化,40 ℃以后,208 nm和214 nm處負(fù)峰強(qiáng)度急劇降低,至70 ℃以后,208 nm和214 nm特征吸收峰基本消失;因此說(shuō)明在4～40 ℃之間,LOX二級(jí)結(jié)構(gòu)呈微弱變化,40 ℃以后,LOX二級(jí)結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞,α-螺旋、β-折疊含量急劇下降,70 ℃后,LOX中α-螺旋、β-折疊已基本被完全破壞,LOX完全失活。圖9為白鰱魚(yú)肌肉LOX經(jīng)不同溫度處理后熒光光譜圖。當(dāng)溫度低于40 ℃時(shí),Trp熒光強(qiáng)度變化較小,說(shuō)明此時(shí)蛋白質(zhì)中Trp仍處在分子內(nèi)非極性環(huán)境中,LOX的三級(jí)構(gòu)象相對(duì)穩(wěn)定;高于40 ℃時(shí),Trp熒光強(qiáng)度快速增強(qiáng),說(shuō)明此時(shí)分子內(nèi)Trp暴露在外部極性環(huán)境中,LOX的三級(jí)構(gòu)象破壞,因此可知LOX在溫度低于40 ℃的條件下,能保持較高的活性。

圖8 不同溫度對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX二級(jí)構(gòu)象的影響Fig.8 The influence of temperatures on the secondary conformation of silver carp muscle LOX

圖9 不同溫度對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX三級(jí)構(gòu)象的影響Fig.9 The influence of temperatures on the tertiary conformation of silver carp muscle LOX

2.2.3 白鰱魚(yú)肌肉LOX pH穩(wěn)定性 結(jié)果如圖10～圖12所示。

圖10 不同pH對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX酶活的影響Fig.10 The influence of different pH on the activity of silver carp muscle LOX

圖11 不同pH對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX二級(jí)構(gòu)象的影響Fig.11 The influence of different pH on the secondary conformation of silver carp muscle LOX

圖12 不同pH對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX三級(jí)構(gòu)象的影響Fig.12 The influence of different pH on the tertiary conformation of silver carp muscle LOX

由圖10可知,當(dāng)緩沖液過(guò)酸或者過(guò)堿時(shí),都會(huì)使脂肪氧合酶分子側(cè)鏈上極性基團(tuán)的狀態(tài)改變,分子活性中心結(jié)構(gòu)變化,發(fā)生變性失活,影響底物與脂肪氧合酶之間的結(jié)合與解離,進(jìn)而影響酶的活性,因此當(dāng)pH小于7.4或者大于7.8時(shí),酶活都會(huì)明顯受到抑制。圖11為白鰱魚(yú)肌肉LOX在不同pH條件下CD光譜圖。由圖11可知,白鰱魚(yú)肌肉LOX在不同pH條件下的CD光譜變化較小,呈微弱變化趨勢(shì),在pH7.8時(shí)208 nm和214 nm處負(fù)峰強(qiáng)度最大,pH6.6時(shí)最小;因此說(shuō)明,不同pH對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX二級(jí)結(jié)構(gòu)變化影響較小,pH的變化不會(huì)造成LOX中α-螺旋、β-折疊含量出現(xiàn)較大變化。圖12為白鰱魚(yú)肌肉LOX在不同pH條件下熒光光譜圖。當(dāng)pH為7.8時(shí),Trp熒光強(qiáng)度最小,說(shuō)明此時(shí)蛋白質(zhì)中Trp仍處在分子內(nèi)非極性環(huán)境中,LOX的三級(jí)構(gòu)象相對(duì)穩(wěn)定,因此可以得到pH7.8為L(zhǎng)OX的最適pH。

3 結(jié)論

白鰱魚(yú)中LOX對(duì)白鰱魚(yú)魚(yú)腥味生成至關(guān)重要,因此針對(duì)白鰱魚(yú)體內(nèi)LOX的研究對(duì)于白鰱魚(yú)產(chǎn)業(yè)特別是白鰱加工的發(fā)展很有意義。本文得到白鰱魚(yú)LOX的最優(yōu)提取條件為磷酸緩沖液pH7.8、離子強(qiáng)度50 mmol/L、EDTA和DTT添加量均為2 mmol/L,此時(shí)白鰱魚(yú)肌肉LOX酶活為(244.44±5.93) U、酶液濃度為(1.98±0.037) mg/mL。通過(guò)對(duì)LOX酶學(xué)性質(zhì)研究可知,白鰱魚(yú)肌肉LOX最適pH為7.8,最適溫度為40 ℃,在常溫和低溫環(huán)境中仍保持較高酶活,常溫條件下0～2 d內(nèi)較為穩(wěn)定。

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Optimization of lipoxygenase extraction conditions in silver carp muscle and the study on its enzymatic properties

WANG Bang-guo,LIN Lin,YU Zhen-yu,LI Yang,JIANG Shao-tong*

(Institute of Agricultural Processing,School of Food Science and Engineering,Key Laboratory for Agriculture Processing Product of Anhui Province,Hefei University of Technology,Hefei 230009,China)

The extraction process and enzymatic properties of Lipoxygenase(LOX)from silver carp muscle were evaluated. The extraction conditions of LOX were optimized by single-factor experiment and the storage stability,thermal stability,optimum pH of LOX were studied by circular dichroism and fluorescence spectroscopy. The effects of pH,ionic strength and the addition of EDTA,DTT on the enzyme activity and concentration of LOX were studied respectively. The results showed that the suitable extraction condition parameters were:pH7.8,ionic strength 50 mmol/L,EDTA 2 mmol/L and DTT 2 mmol/L,the enzyme concentration of LOX was(1.98±0.037) mg/mL and the activity was (244.44±5.93) U under that condition. Our present work showed that the enzyme activity of LOX was stable within 0～2 d under room temperature,the optimum pH was 7.8 and the optimum temperature was 40 ℃.

silver carp;lipoxygenase;extraction conditions;enzymatic properties

2016-10-08

王幫國(guó)(1992-)，男，碩士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工，E-mail： wang_bangguo@163.com。

*通訊作者:姜紹通(1954-)，男，碩士，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工，E-mail：jstxsgj@163.com。

安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(JZ2014AKSY0401)。

TS254.1

A

1002-0306(2017)09-0113-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.013