時燦燦，于明明，張先平，陳麗剛，王乾興

(1遵義醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，貴州遵義 563003；2婁底市中心醫(yī)院)

生理性孕酮撤退過程中小鼠子宮角組織蛋白激酶 B、糖原合成激酶3β 的表達(dá)觀察

時燦燦1，于明明1，張先平2，陳麗剛1，王乾興1

(1遵義醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，貴州遵義 563003；2婁底市中心醫(yī)院)

目的 觀察生理性孕酮撤退小鼠子宮角組織中蛋白激酶 B(Akt)及糖原合成激酶3β(GSK3β)的表達(dá)變化。方法 90只未交配健康成年雌性C57BL/6J小鼠，制作生理性孕酮撤退模型，分別在孕酮撤退0、8、12、16、20、24、32、40、48 h(48 h為小鼠生理性孕酮撤退周期)時處死10只小鼠，收集子宮角組織。采用real-time PCR法檢測孕酮撤退各時點小鼠子宮角組織Akt、GSK3β mRNA，采用Western blotting法檢測孕酮撤退各時點小鼠子宮角組織總蛋白激酶 B(t-Akt)、磷酸化蛋白激酶 B(Akt)及3βp-Akt及磷酸化糖原合成激酶(p-GSK3β)。結(jié)果 隨孕酮撤退時間延長，Akt mRNA及蛋白相對表達(dá)量逐漸降低，孕酮撤退20 h時達(dá)到最低值，后隨孕酮撤退時間逐漸延長，Akt mRNA及蛋白相對表達(dá)量逐漸升高。孕酮撤退8 h 時GSK mRNA及蛋白相對表達(dá)量高于孕酮撤退0 h時(P<0.05)；隨孕酮撤退時間延長，GSK mRNA及蛋白相對表達(dá)量逐漸降低，孕酮撤退24 h時達(dá)到最低值，后隨孕酮撤退時間逐漸延長， GSK mRNA及蛋白相對表達(dá)量逐漸增加。孕酮撤退20 h小鼠子宮角組織 Akt 、GSK3β mRNA表達(dá)量低于孕酮撤退后0、48 h(P均<0.05)。與孕酮撤退0 h比較，孕酮撤退20 h時小鼠子宮角組織p-Akt、p-GSK3β的相對表達(dá)量均降低(P均<0.05)。與孕酮撤退8 h比較，孕酮撤退20 h時小鼠子宮角組織p-GSK3β的相對表達(dá)量降低(P<0.05)。與孕酮撤退20 h比較，孕酮撤退48 h時小鼠子宮角組織p-Akt、p-GSK3β的相對表達(dá)量均升高(P均<0.05)。結(jié)論 生理性孕酮撤退小鼠子宮角組織中存在Akt表達(dá)隨時間下降后上調(diào)，GSK3β表達(dá)隨時間上調(diào)后下降后再次上調(diào)。 Akt/GSK-3β信號通路可能在鼠孕酮撤退過程中起重要作用。

月經(jīng)；孕酮撤退；蛋白激酶 B;糖原合成激酶3β；動物實驗

在晚分泌期由于黃體功能的下降導(dǎo)致體內(nèi)孕酮水平的降低成為孕酮撤退，孕酮撤退導(dǎo)致子宮內(nèi)膜經(jīng)歷一系列生化和細(xì)胞水平上的變化，最后發(fā)生凋亡和崩解，造成子宮內(nèi)膜出血、脫落，即月經(jīng)發(fā)生。孕酮撤退導(dǎo)致子宮內(nèi)膜快速崩解、脫落是月經(jīng)的顯著特征。月經(jīng)是一個由于孕酮撤退而引發(fā)的涉及到內(nèi)分泌和局部免疫系統(tǒng)相互作用的一個組織損傷過程[1]。目前關(guān)于子宮內(nèi)膜崩解和修復(fù)過程所涉及分子機制并不明確。蛋白激酶 B/糖原合成激酶3β(Akt/ GSK3β)信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移、新陳代謝和血管生成等機體生理活動中具有重要作用。最新研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化-蛋白激酶 B (p-Akt)及磷酸化-糖原合成激酶3β(p-GSK3β)在正常月經(jīng)周期增殖期和分泌期子宮內(nèi)膜中的表達(dá)呈周期性變化[2,3]，但關(guān)于其在孕酮撤退過程中的表達(dá)變化尚未見報道。本研究建立小鼠生理性孕酮撤退模型(即月經(jīng)模型)，模擬子宮內(nèi)膜崩解和修復(fù)過程，觀察Akt/GSK-3β信號通路在子宮內(nèi)膜崩解和修復(fù)過程中的表達(dá)變化,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 未交配健康成年(8～12周齡)雌性C57BL/6J小鼠90只購自重慶第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物研究所，SPF Ⅱ級；光周期調(diào)控為6∶00～18∶00光照，18∶00～6∶00黑暗。溫度(21 ±1)℃，自由進(jìn)食和攝水。雌二醇(E2,Alfa Aesar公司，英國)；孕酮(P4,Sigma公司，美國)；所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.2 小鼠生理性孕酮撤退模型建立方法 小鼠生理性孕酮撤退模型建立方法參照文獻(xiàn)[4]稍作修改。主要步驟為：取90只小鼠乙醚麻醉下行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，術(shù)后適應(yīng)性恢復(fù)7 d以清除體內(nèi)內(nèi)源性激素，以術(shù)后第7天記為實驗第0天。分別于實驗第1～3天上午9∶30對小鼠皮下注射E2 100 ng；實驗第4～6天不做任何處理；實驗第7天上午9∶30于小鼠背部皮下埋植孕酮皮埋管，同時皮下注射P4 50 ng和E25 ng；實驗第8、9天的上午9∶30分別皮下注射E25 ng；實驗第9天上午11∶30取小鼠，在一側(cè)子宮角注射20 μL過濾除菌花生油誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜蛻膜化，誘導(dǎo)蛻膜化49 h后取出孕酮皮埋管，此點記為孕酮撤退0 h。分別在孕酮撤退0、8、12、16、20、24、32、40、48 h(48 h為小鼠生理性孕酮撤退周期)時隨機頸椎脫臼處死10只小鼠，收集子宮角組織，迅速放于液氮中冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 生理性孕酮撤退模型小鼠子宮角組織Akt、GSK3β mRNA檢測 采用real-time PCR法。取生理性孕酮撤退模型小鼠子宮角組織，根據(jù)TRIzol試劑盒說明書提取總RNA，使用紫外分光光度計測定總RNA純度和濃度，所用樣品RNA的260/280比值在1.8～2.0。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA后進(jìn)行real-time PCR實驗。擴增條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。Akt基因上游引物序列5′-CCCTTCTACAACCAGGACCA -3′,下游引物5′-CATGATCTCCTTGGCATCCT-3′； GSK3β基因上游引物序列5′-TGGCGTGTGATGTCAGGTAT -3′,下游引物5′-TAAGCTGGCATCTGCAACAC-3′；β-actin上游引物5′-AGGTATCCTGACCCTGAAGT-3′，下游引物5′-AGGTCTCAAACATGATCTGG-3′。以β-actin為內(nèi)參。Akt及GSK3β mRNA的相對表達(dá)量以2-ΔΔCt表示。

1.4 生理性孕酮撤退模型小鼠子宮角組織總蛋白激酶 B(t-Akt)、磷酸化蛋白激酶 B(Akt)及3βp-Akt及磷酸化糖原合成激酶(p-GSK3β)蛋白檢測 采用Western blotting法。取生理性孕酮撤退模型小鼠子宮角組織，提取小鼠子宮組織總蛋白后通過二喹啉甲酸( BCA) 法測定蛋白濃度，將40 μg蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，常規(guī)轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，兔抗鼠一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。TBST洗滌，加入辣根過氧化酶( HRP) 標(biāo)記的羊抗兔二抗( 1∶2 000) 室溫孵育1 h，TBST洗滌，ECL 發(fā)光檢測， 凝膠圖象分析各條帶的光密度值。以GAPDH為內(nèi)參，以t-Akt、p-Akt及p-GSK3β的光密度與GAPDH光密度之比表示t-Akt、p-Akt及p-GSK3β的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 孕酮撤退各時點小鼠子宮角組織Akt、GSK3β mRNA相對表達(dá)量比較 孕酮撤退各時點小鼠子宮角組織Akt、GSK3β mRNA相對表達(dá)量比較見表1。

表1 孕酮撤退各時點小鼠子宮角組織Akt、GSK3β mRNA相對表達(dá)量比較

注：與孕酮撤退0 h比較，*P<0.05；與孕酮撤退8 h比較，☆P<0.05；與孕酮撤退20 h比較，#P<0.05。

2.2 孕酮撤退各時點小鼠子宮角組織t-Akt、p-Akt及p-GSK3β相對表達(dá)量比較 孕酮撤退各時點小鼠子宮角組織t-Akt、p-Akt及p-GSK3β 相對表達(dá)量比較見表2。

表2 孕酮撤退各時點小鼠子宮角組織t-Akt、p-Akt及p-GSK3β相對表達(dá)量比較

注：與孕酮撤退0 h比較，*P<0.05；與孕酮撤退8 h比較，☆P<0.05；與孕酮撤退20 h比較，#P<0.05。

3 討論

子宮內(nèi)膜在雌激素和孕激素作用下，經(jīng)歷了增殖、分化以及在分泌晚期孕酮撤退情況下的子宮內(nèi)膜周期性的崩解、脫落和其后的再生修復(fù)過程。孕酮撤退后引起子宮螺旋動脈收縮，導(dǎo)致組織缺氧而引起長時間小動脈松弛和組織缺血再灌注，這又進(jìn)一步引起了螺旋動脈的收縮，引起子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致子宮內(nèi)膜崩解和出血[5]。研究表明子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡是月經(jīng)發(fā)生的原因，人子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡主要發(fā)生在晚分泌期，在月經(jīng)期達(dá)到最高[6]。提示孕酮撤退后上調(diào)炎性介質(zhì)引起的炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞凋亡是子宮內(nèi)膜組織崩解、壞死和脫落(即月經(jīng)發(fā)生)的主要生理事件之一[7～9]。但究竟是什么信號來調(diào)控子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡目前尚未見報道，且子宮內(nèi)膜修復(fù)過程中的分子機制也還不清楚。

Akt/GSK3β信號通路為經(jīng)典的抗細(xì)胞凋亡途徑，同時可能參與缺血再灌注性組織損傷的修復(fù)[10]。最新研究表明，該通路參與子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)和血管生成，對維持子宮內(nèi)膜規(guī)律、周期性變化具有重要作用。蛋白激酶B(PKB/Akt)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其激酶催化結(jié)構(gòu)域與蛋白激酶A和蛋白激酶C具有較高的相似性。Akt激酶催化結(jié)構(gòu)域蘇氨酸殘基(Thr308)位點磷酸化是活化Akt所必需的，其調(diào)節(jié)區(qū)域含有的第二個磷酸化位點(Ser473)磷酸化則可使Akt獲得最高活性。生理條件下，Akt以低活性狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞受到胞外刺激(如缺血或缺氧)時，首先活化磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)，使其催化產(chǎn)生PIP3并與含有PH結(jié)構(gòu)域的Akt結(jié)合，從而使其被激活成為磷酸化Akt(p-Akt)。p-Akt轉(zhuǎn)位到胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)，通過磷酸化GSK-3β的N-端ser-9位點而使之失活，促使下游的促存活、促細(xì)胞周期轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)增加以及負(fù)調(diào)控caspase活性，最終抑制凋亡[11]。本實驗結(jié)果顯示，孕酮撤退后子宮內(nèi)膜組織中總Akt蛋白在各時間點表達(dá)量無明顯差異，而Akt mRNA和p-Akt蛋白表達(dá)量從8 h開始緩慢降低，到20 h達(dá)最低點，隨后又逐漸增加，至48 h恢復(fù)到一定水平；GSK3β mRNA和p-GSK3β蛋白在孕酮撤退后8 h表達(dá)最高,隨后時間點表達(dá)趨勢與Akt mRNA和p-Akt蛋白表達(dá)趨勢一致。提示其機制可能為：①小鼠子宮內(nèi)膜組織中總的Akt和GSK3β在月經(jīng)周期中未出現(xiàn)周期性改變，與p-Akt和p-GSK3β的周期性變化不符。在人正常月經(jīng)周期中的研究中也證實了這一點，即子宮內(nèi)膜功能層中總Akt和GSK3β表達(dá)量在月經(jīng)周期各階段無明顯差異，而p-Akt及p-GSK3β表達(dá)呈周期性變化[3,12]。這說明Akt和GSK3β的活性調(diào)節(jié)不是在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行，而是通過非轉(zhuǎn)錄機制進(jìn)行蛋白質(zhì)磷酸化而實現(xiàn)的信號分子的快速激活[13,14]。②在孕酮撤退后的月經(jīng)發(fā)生過程(0～24 h)中，孕酮撤退12 h以前為小鼠月經(jīng)發(fā)生的可逆轉(zhuǎn)時期，主要進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)以誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞凋亡；孕酮撤退16 h以后為不可逆時期，主要進(jìn)行白細(xì)胞、上皮細(xì)胞等引發(fā)的組織崩解事件[4]。本研究結(jié)果顯示，p-Akt在0 h表達(dá)最高，而p-GSK3β則在孕酮撤退8 h表達(dá)量增加，且都在隨后時間點逐漸下降，至孕酮撤退20 h達(dá)到最低。說明隨著孕酮撤退后小鼠體內(nèi)孕酮水平的下降，Akt/GSK3β信號通路受抑制，即首先p-Akt水平下降，從而減少對GSK-3β的磷酸化作用使其活性增加，進(jìn)而調(diào)控下游信號分子的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其可能機制有：激活p53表達(dá)而抑制Bcl-2、激活Bax,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]； GSK3β磷酸化水平的降低，可以解除p-GSK3β對NF-κB的競爭性抑制作用，一方面上調(diào)促炎性細(xì)胞因子生成，另一方面促使NF-κB p65轉(zhuǎn)位入核與MMP-9啟動子結(jié)合，從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜組織崩解[16]。③在孕酮撤退后的子宮內(nèi)膜再生和修復(fù)過程(24～48 h)中，p-Akt和p-GSK3β從孕酮撤退24 h開始表達(dá)量增加，至48 h時達(dá)到高峰，這與人子宮內(nèi)膜研究結(jié)果相吻合[2]，即p-Akt在分泌早期和中期表達(dá)較增殖期降低，分泌晚期又逐漸增加，但均低于蛻膜組織。說明Akt/GSK3β信號通路的激活也參與了子宮內(nèi)膜再生和修復(fù)過程。其可能機制是：可競爭性抑制NF-κB活性，抑制促炎性細(xì)胞因子生成，利于修復(fù)[17]；促進(jìn)一氧化氮合酶(eNOS)的表達(dá)，增加子宮內(nèi)膜腺體和基質(zhì)細(xì)胞中的NO水平，從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜增殖、血管擴張和血流灌注[17]；通過促血管生成素和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)激活A(yù)kt，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，啟動一氧化氮合酶(eNOS)，反過來促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、血管生成[18]。

綜上所述，孕酮撤退可能通過非轉(zhuǎn)錄機制而調(diào)控Akt磷酸化程度，負(fù)性調(diào)節(jié)GSK3β活性，進(jìn)而通過其下游相關(guān)效應(yīng)分子調(diào)控月經(jīng)期子宮內(nèi)膜炎性細(xì)胞浸潤、蛻膜化基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡崩解以及后期組織重塑。

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Expression of protein kinase B and glycogen synthase kinase 3β in mouse uterine horn during the process of physiological progesterone withdrawal

SHICancan1,YUMingming,ZHANGXianping,CHENLigang,WANGQianxing

(1DepartmentofCellBiology,ZunyiMedicalUniversity,Zunyi563003,China)

Objective To observe the expression of protein kinase B (Akt) and glycogen synthase kinase 3β (GSK3β) in the uterine tissues of mouse models in the process of physiological progesterone withdrawal.Methods We selected 90 non-mating healthy adult female C57BL/6J mice to make the physiological progesterone withdrawal models. Ten mice were killed at 0, 8, 12, 16, 20, 24, 32, 40, and 48 h (The physiological progesterone withdrawal cycle in mice is 48 h) to collect uterine horns. The gene expression levels of Akt and GSK3β were detected by real-time PCR. The protein expression levels of total Akt, phosphorylated AKT and phosphorylated GSK-3β were detected by Western blotting.Results Over the time of progesterone withdrawal, the expression of Akt mRNA and protein gradually decreased (reached the minimum at 20 h) and then gradually increased. The expression of GSK3β mRNA and protein at 8 h was higher than that at 0 h (P<0.05). Over the time of progesterone withdrawal, the expression of GSK mRNA and protein decreased (reached the minimum at 24 h) and then gradually increased. The expression of Akt and GSK3β mRNA at 20 h was lower than that at 0 and 48 h (bothP<0.05). The expression of p-Akt and p-GSK-3β at 20 h decreased as compared with that at 0 h (bothP<0.05). The expression of p-GSK-3β protein in mouse uterine tissues at 20 h decreased as compared with that at 8 h (P<0.05). The expression of p-Akt and p-GSK3β protein at 48 h increased as compared with that at 20 h (allP<0.05).Conclusions Over the time of progesterone withdrawal, the expression of Akt gradually decreases and then increases in the uterine tissues of mouse models. Meanwhile, the expression of GSK3β first increases, then decreases, and finally increases again. Akt/GSK3β signal pathway may play an important role in the process of progesterone withdrawal.

menstruation; progesterone withdrawal; protein kinase B; glycogen synthase kinase 3β; animal experiment

貴州省科技廳聯(lián)合基金項目(黔科合J字LKZ-2010-33號)；貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項目(黔科合J字-2011-2282)。

時燦燦(1987-)，女，碩士研究生，主要研究方向為生殖醫(yī)學(xué)。E-mail: 915939832@qq.com

王乾興(1974-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向為生殖醫(yī)學(xué)。E-mail: 317002641@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.19.003

R711.3

A

1002-266X(2017)19-0009-04

2016-11-18)