王娟，付文廣

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州 646000)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中長(zhǎng)鏈非編碼RNA MINCR、CDK2 mRNA的表達(dá)變化及其意義

王娟，付文廣

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州 646000)

目的 觀察原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)組織中長(zhǎng)鏈非編碼RNA MINCR(LncRNA-MINCR)與周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)mRNA的表達(dá)變化，并探討其意義。方法 41例HCC患者，手術(shù)治療中均留取癌組織和癌旁組織，采用Real-time PCR法檢測(cè)癌、癌旁組織中l(wèi)ncRNA-MINCR和CDK2 mRNA，采用 Pearson相關(guān)性方法分析HCC組織中l(wèi)ncRNA-MINCR與CDK2 mRNA相關(guān)性，并分析lncRNA-MINCR、CDK2 mRNA的表達(dá)與原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果 HCC癌組織及癌旁組織lncRNA-MINCR的相對(duì)表達(dá)量分別為5.20±4.50、1.32±1.18，二者比較，P<0.001。HCC癌組織及癌旁組織CDK2的相對(duì)表達(dá)量分別為4.90±4.62、1.71±1.98，二者比較，P<0.001。相關(guān)性分析顯示，HCC患者癌組織lncRNA-MINCR與CDK2 mRNA水平呈正相關(guān)(R2=0.260 1，P<0.001)。lncRNA-MINCR的表達(dá)與HCC患者腫瘤直徑、有無肝硬化有關(guān)(P均<0.05)，CDK2 mRNA的表達(dá)與HCC患者腫瘤直徑、AFP水平有關(guān)(P均<0.05)。結(jié)論 HCC癌組織中存在lncRNA-MINCR、CDK2 mRNA高表達(dá)，二者在HCC的發(fā)生、發(fā)展中起協(xié)同作用。

肝腫瘤；肝細(xì)胞癌；長(zhǎng)鏈非編碼RNA；lncRNA-MINCR；周期蛋白依賴性激酶2

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制目前仍不明確，臨床尚無有效治療方法，目前HCC患者五年生存率仍較低。研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)在基因表達(dá)調(diào)控中具有重要作用[1,2]。MINCR是一個(gè)新近發(fā)現(xiàn)的lncRNA，既往研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子MYC不僅可促進(jìn)lncRNA-MINCR高表達(dá)，lncRNA-MINCR可反向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子MYC的功能，在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中起協(xié)同驅(qū)動(dòng)作用[3]。周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)是關(guān)鍵的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)與包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤的惡性增殖有關(guān)[4,5]。轉(zhuǎn)錄因子MYC可通過調(diào)節(jié)CDK/Rb/E2F通路影響CDK2的表達(dá)[6]。目前l(fā)ncRNA-MINCR、CDK2 在HCC中的研究報(bào)道較少。本研究觀察了HCC癌組織中l(wèi)ncRNA-MINCR與CDK2 mRNA的表達(dá)變化，分析其與HCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年1月～2015年12月間我院診治的41例HCC患者，其中男29例、女12例，年齡42～74歲，中位年齡56歲；術(shù)前均未行任何放化療或其他抗腫瘤治療，手術(shù)中均留取癌組織和距離腫瘤組織5 cm以外的癌旁正常組織，液氮保存?zhèn)溆?，術(shù)后病理學(xué)均確認(rèn)為HCC。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 癌組織及癌旁組織lncRNA-MINCR、CDK2 mRNA檢測(cè)方法 采用Real-time PCR法檢測(cè)癌、癌旁組織中l(wèi)ncRNA-MINCR和CDK2 mRNA。應(yīng)用TRIzol(Invitrogen)抽提組織總RNA，對(duì)所得的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。采用SYBR Green染料法，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad)檢測(cè)lncRNA-MINCR與CDK2 mRNA的表達(dá)。每個(gè)樣本設(shè)置復(fù)孔3個(gè)。以GAPDH為內(nèi)參。引物由Sangon Biotech合成。lncRNA-MINCR上游引物：5′-AGACTTGAATGGAGACATCAGC-3′，下游引物：5′-CCAGAGAAACAGAACCAATGA-3′；CDK2上游引物：5′-GTGGTACCGAGCTCCTGAAA-3′，下游引物：5′-AAAGATCCGGAAGAGCTGGT-3′；GAPDH上游引物：5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′；下游引物：5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。lncRNA-MINCR、CDK2 mRNA的的相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt表示。ΔCt=Ct靶基因-CtGAPDH；ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組。以lncRNA-MINCR、CDK2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)及其以上水平判為高表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 癌組織及癌旁組織lncRNA-MINCR、CDK2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 癌組織及癌旁組織lncRNA-MINCR的相對(duì)表達(dá)量分別為5.20±4.50、1.32±1.18，二者比較，P<0.001。癌組織及癌旁組織CDK2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為4.90±4.62、1.71±1.98，二者比較，P<0.001。

2.2 HCC組織lncRNA-MINCR表達(dá)與CDK2 mRNA表達(dá)的相關(guān)性 相關(guān)性分析顯示，HCC患者癌組織lncRNA-MINCR與CDK2 mRNA水平呈正相關(guān)(R2=0.260 1，P<0.001)。

2.3 lncRNA-MINCR、CDK2 mRNA表達(dá)與HCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 lncRNA-MINCR的表達(dá)與HCC患者腫瘤直徑、有無肝硬化有關(guān)(P均<0.05)，CDK2 mRNA的表達(dá)與HCC患者腫瘤直徑、AFP水平有關(guān)(P均<0.05)。見表1。

表1 lncRNA-MINCR、CDK2 mRNA表達(dá)與HCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

3 討論

HCC是一種高病死率的惡性腫瘤，每年超過100萬患者死亡[7]。肝癌發(fā)生、進(jìn)展與轉(zhuǎn)移的機(jī)制十分復(fù)雜，目前臨床尚未發(fā)現(xiàn)可靠治療靶點(diǎn)。研究[8]發(fā)現(xiàn)，單純DNA改變并不能解釋HCC的復(fù)雜進(jìn)程。對(duì)基因在不同水平參與表達(dá)調(diào)控的機(jī)制進(jìn)行深入而廣泛的探討是目前HCC診斷和治療的研究熱點(diǎn)。

myc基因是較早發(fā)現(xiàn)的一組癌基因，與之同源的病毒癌基因存在于MC29及其它一些具有高度致癌性的猿逆轉(zhuǎn)錄病毒中。myc基因高水平表達(dá)時(shí)可轉(zhuǎn)化嚙齒類成纖維細(xì)胞。MYC家族是一類具有轉(zhuǎn)錄因子效應(yīng)的核蛋白類調(diào)控基因，其可以通過靶向調(diào)節(jié)Bcl-2、CDK4、CDC25A、CCND1等蛋白，在細(xì)胞增殖、分化與凋亡等方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用[8]。MYC作為原癌基因，在多數(shù)腫瘤中異常擴(kuò)增，驅(qū)動(dòng)腫瘤惡性轉(zhuǎn)化，并導(dǎo)致患者預(yù)后不良。但目前關(guān)于調(diào)節(jié)MYC表達(dá)與功能的分子機(jī)制還尚不清楚。lncRNA是一類長(zhǎng)度大于200 nt不具有蛋白編碼能力的轉(zhuǎn)錄本。近年，lncRNA參與基因表達(dá)調(diào)控的作用越來越受到人們的重視，但絕大多數(shù)的lncRNA的功能仍然知之甚少[1]。Doose等[3]發(fā)現(xiàn)MYC過表達(dá)的細(xì)胞系與MYC基因變異擴(kuò)增的B淋巴細(xì)胞瘤患者中，一個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA異常高表達(dá)，具有原癌基因的功能，且與MYC的表達(dá)存在正相關(guān)性，并命名為MINCR。同樣，Wang等[9]發(fā)現(xiàn)lncRNA-MINCR在膽囊癌中異常過表達(dá)，并促進(jìn)了膽囊癌的進(jìn)展，導(dǎo)致更差的總體的幸存。本研究發(fā)現(xiàn)，HCC癌組織中存在lncRNA-MINCR高表達(dá)，與HCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系顯示，lncRNA-MINCR的表達(dá)與HCC患者腫瘤直徑、有無肝硬化有關(guān)。腫瘤直徑增大與癌細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)有關(guān)，另外，肝硬化的發(fā)生與廣泛肝細(xì)胞、結(jié)締組織過度再生與重建關(guān)系密切。因此可猜測(cè)，lncRNA-MINCR在HCCF癌組織的異常表達(dá)將導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖，但lncRNA-MINCR調(diào)節(jié)HCC癌細(xì)胞增殖的具體機(jī)制還需要深入探討。

CDK2是細(xì)胞周期依賴性蛋白家族成員，其主要是通過與周期蛋白結(jié)合形成活化狀態(tài)的蛋白激酶復(fù)合物，催化RB磷酸化，驅(qū)動(dòng)周期進(jìn)程并促進(jìn)細(xì)胞分裂[10]。大量研究發(fā)現(xiàn)CDK2在肺癌、黑色素瘤、骨肉瘤、乳腺癌與惡性膠質(zhì)瘤等腫瘤過度表達(dá)與活化[11，12]。本研究發(fā)現(xiàn)，HCC癌組織中CDK2 mRNA異常高表達(dá)；與HCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系顯示，CDK2 mRNA的表達(dá)與HCC其表達(dá)量與血清AFP水平、腫瘤直徑有關(guān)。Mizejewski等[13]研究表明，AFP與一些細(xì)胞周期依賴性蛋白存在相互作用并參與調(diào)控細(xì)胞周期。肝細(xì)胞癌組織中存在CDK2異常過表達(dá)，并可促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)[14]。

本研究還發(fā)現(xiàn)， HCC患者癌組織lncRNA-MINCR與CDK2 mRNA水平呈正相關(guān)，這提示lncRNA-MINCR與CDK2 mRNA間可能存在正性調(diào)控機(jī)制，過表達(dá)的lncRNA-MINCR可能促進(jìn)CDK2 mRNA的表達(dá)，從而促進(jìn)HCC癌細(xì)胞的惡性增殖。早在1999年，Mateyak等[17]就發(fā)現(xiàn)MYC的缺失將抑制Cyclin E-CDK2復(fù)合物形成，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程。但MYC是通過何種機(jī)制調(diào)節(jié)Cyclin E-CDK2復(fù)合物的形成尚不清楚。lncRNA-MINCR是MYC誘導(dǎo)表達(dá)的一個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA分子，作為MYC的下游分子，MYC可能通過lncRNA-MINCR途徑直接參與調(diào)節(jié)CDK2的表達(dá)。Doose等[3]發(fā)現(xiàn)，干涉lncRNA-MINCR表達(dá)之后，MYC作為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合于CDK2啟動(dòng)子區(qū)域的能力大大減弱，從而引起CDK2表達(dá)的降低。但目前研究仍沒有揭示lncRNA-MINCR是通過何種作用影響MYC的功能。lncRNA-MINCR在肝細(xì)胞癌中調(diào)控CDK2表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖的機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

綜上所述，HCC癌組織中存在lncRNA-MINCR、CDK2 mRNA高表達(dá)，二者在HCC的發(fā)生、發(fā)展中起協(xié)同作用。

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