周白云，郭永利，王卓，王文琴

(黔西南州人民醫(yī)院，貴州黔西南州562400)

·基礎(chǔ)研究·

長(zhǎng)鏈非編碼RNA CCAT1對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株HeLa增殖的影響及其機(jī)制

周白云，郭永利，王卓，王文琴

(黔西南州人民醫(yī)院，貴州黔西南州562400)

目的 觀(guān)察長(zhǎng)鏈非編碼RNA (LncRNA)CCAT1對(duì)宮頸癌細(xì)胞株HeLa增殖的影響，并探討其可能作用機(jī)制。方法 ①過(guò)表達(dá)、抑制CCAT1表達(dá)對(duì)HeLa增殖的影響：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞分為1、2、3、4組，分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1- CCAT1過(guò)表達(dá)慢病毒、pcDNA3.1對(duì)照慢病毒、siRNA、CCAT1-siRNA，別于轉(zhuǎn)染0、24、48 h時(shí)采用 CCK8法觀(guān)察各組細(xì)胞增殖情況。②HeLa細(xì)胞CCAT1互補(bǔ)microRNA分子分析：采用核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)分析CCAT1的細(xì)胞定位，網(wǎng)站預(yù)測(cè)并分析與CCAT1互補(bǔ)配對(duì)的microRNA分子。③LncRNA CCAT1靶向microRNA分子分析：取HeLa細(xì)胞分為A、B、C組，分別轉(zhuǎn)染亂序無(wú)意義序列、CCAT1-siRNA、pcDNA3.1- CCAT1過(guò)表達(dá)的慢病毒。轉(zhuǎn)染48 h采用熒光定量PCR方法檢測(cè)各組細(xì)胞miR-181a-5p、miR-181b-5p、miR-4295、miR-130a-5p、miR-148b-3p、miR-543 。④細(xì)胞RASSF1A 、cyclin D1 mRNA檢測(cè)：取HeLa細(xì)胞，分為甲、乙、丙、丁、戊組，分別轉(zhuǎn)染亂序無(wú)意義序列、CCAT1-siRNA、CCAT1-siRNA+ miR-181a-5p inhibitor(miR-181a-5p抑制劑)、pcDNA3.1- CCAT1過(guò)表達(dá)的慢病毒、pcDNA3.1- CCAT1過(guò)表達(dá)的慢病毒+ miR-181a-5p mimic(miR-181a-5p類(lèi)似物)。轉(zhuǎn)染48 h采用熒光定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞RASSF1A 、cyclin D1 的RNA表達(dá)。結(jié)果 轉(zhuǎn)染24、48 h時(shí)，1組細(xì)胞增殖OD值小于2組,3組細(xì)胞增殖OD值高于4組(P均<0.05)。與CCAT1互補(bǔ)的前6位microRNA分別為miR-181a-5p、miR-181b-5p、miR-4295、miR-130a-5p、miR-148b-3p、miR-543。轉(zhuǎn)染48 h時(shí)B組miR-181a-5p、miR-181b-5p、miR-4295、miR-130a-5p相對(duì)表達(dá)量均高于A、C組，C組miR-181a-5p、miR-181b-5p、miR-4295相對(duì)表達(dá)量均低于A組(P均<0.05)。轉(zhuǎn)染48 h時(shí)，乙組RASSF1A相對(duì)表達(dá)量低于、cyclin D1 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于甲組，丁組RASSF1A相對(duì)表達(dá)量高于、cyclin D1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于甲組(P均<0.05)；丙、丁、戊組RASSF1A相對(duì)表達(dá)量高于、cyclin D1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于乙組(P均<0.05)；丁組RASSF1A相對(duì)表達(dá)量高于、cyclin D1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于丙組(P均<0.05)；戊組RASSF1A相對(duì)表達(dá)量低于、cyclin D1 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于丁組(P均<0.05)。結(jié)論 CCAT1可抑制HeLa細(xì)胞的增殖。其機(jī)制可能為CCAT1上調(diào)RASSF1A表達(dá)、抑制cyclin D1轉(zhuǎn)錄。CCAT1通過(guò)與miR-181a-5p互補(bǔ)配對(duì)調(diào)控RASSF1A、cyclin D1的表達(dá)。

宮頸腫瘤；宮頸癌；長(zhǎng)鏈非編碼RNA；長(zhǎng)鏈非編碼RNA CCAT1

宮頸癌是常見(jiàn)的婦科生殖道腫瘤之一，HPV持續(xù)感染被認(rèn)為是宮頸癌的主要危險(xiǎn)因素[1，2]。隨著宮頸癌篩查技術(shù)的進(jìn)步及普及，全球?qū)m頸癌病死率持續(xù)下降，但發(fā)展中國(guó)家的病死率仍位居女性癌癥病死率首位[3]。宮頸癌發(fā)病的具體機(jī)制尚不清楚，手術(shù)及放化療是其常用的治療方法，但效果均不佳。個(gè)體化治療是一種新興的腫瘤治療方法，使腫瘤基因、治療靶點(diǎn)成為目前的研究熱點(diǎn)。非編碼基因[4，5]主要分為microRNA、piRNA、tRNA、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)等[6，7]。目前關(guān)于宮頸癌相關(guān)的microRNA相關(guān)研究較多[8～10]，但關(guān)于LncRNA在宮頸癌中的相關(guān)報(bào)道較少。CCAT1是一種LncRNA，位于8號(hào)染色體8q24.21區(qū)，且在物種間具有較好的保守性，該區(qū)域具有眾多的染色體變異位點(diǎn)，并與前列腺癌[11～14]、結(jié)腸癌、淋巴系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中CCAT1低表達(dá)，但其在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制尚不明確。我們觀(guān)察了CCAT1對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響，并探討其可能作用機(jī)制?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 人宮頸癌HeLa細(xì)胞株購(gòu)自上海中科院生化細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)基為DMEM basic 培養(yǎng)基+10%胎牛血清+雙抗，pcDNA3.1- CCAT1過(guò)表達(dá)慢病毒的啟動(dòng)子采用CMV，由澤恒生物技術(shù)有限公司構(gòu)建，CCAT1-siRNA由廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成。 siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染均采用Invitrogen公司的Lipofectamine3000包裹。細(xì)胞CO2培養(yǎng)箱購(gòu)Forma Scientific，熒光定量PCR的熒光染料采用TAKAT SYBR Green，熒光定量PCR儀采用Bio-Rad公司CFX96。Ki67抗體(abcam公司ab15580)，CCK8試劑盒(日本同仁公司JE603)，CCK8檢測(cè)酶標(biāo)儀采(Bio-Rad公司Model 550)，核質(zhì)分離試劑盒(碧云天核蛋白提取試劑盒P0028)，RNA提取采用TaKaRa公司TRIzol試劑，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。microRNA、inhibitor由廣州銳博公司合成。

1.2 CCAT1對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響

1.2.1 促進(jìn)CCAT1表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響觀(guān)察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞株分為1、2組，培養(yǎng)至細(xì)胞密度約70%時(shí)換為無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓2 h, 1、2組分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1- CCAT1過(guò)表達(dá)慢病毒、pcDNA3.1空載體慢病毒。將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于轉(zhuǎn)染0、24、48 h時(shí)采用 CCK8法檢測(cè)兩組細(xì)胞增殖情況，采用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處光密度(OD)值。

1.2.2 抑制CCAT1表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響觀(guān)察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞株分為3、4組，培養(yǎng)至細(xì)胞密度約70%時(shí)換為無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓2 h, 3、4組分別轉(zhuǎn)染CCAT1-siRNA、siRNA對(duì)照亂序。將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于轉(zhuǎn)染0、24、48 h時(shí)采用 CCK8法檢測(cè)兩組細(xì)胞增殖情況，采用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處光密度(OD)值。

1.3 HeLa細(xì)胞CCAT1互補(bǔ)microRNA分子分析 采用核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)[15]分析CCAT1的細(xì)胞定位，所有操作均嚴(yán)格按照使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用starbase V2.0(http://starbase.sysu.edu.cn/)網(wǎng)站分析與CCAT1互補(bǔ)配對(duì)的microRNA分子。

1.4 LncRNA CCAT1靶向microRNA分子分析 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞，分為A、B、C組，每組5個(gè)復(fù)孔。A組為空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染亂序無(wú)意義序列，B組轉(zhuǎn)染CCAT1-siRNA，C組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1- CCAT1過(guò)表達(dá)的慢病毒。轉(zhuǎn)染48 h采用熒光定量PCR方法檢測(cè)各組細(xì)胞miR-181a-5p、miR-181b-5p、miR-4295、miR-130a-5p、miR-148b-3p、miR-543 表達(dá)(“1.3”中與CCAT1互補(bǔ)配對(duì)的microRNA前6位),所有操作均嚴(yán)格按照使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 各組細(xì)胞的RASSF1A 、cyclin D1 的mRNA表達(dá)檢測(cè) 補(bǔ)救實(shí)驗(yàn)證實(shí)CCAT1與miR-181a-5p存在互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，既往研究證實(shí)miR-181a-5p可通過(guò)靶向抑癌基因RASSF1A從而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[16]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞，分為甲、乙、丙、丁、戊組，每組5個(gè)復(fù)孔。甲組為空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染亂序無(wú)意義序列，乙組采用Lipofectamine 3000TM包裹CCAT1-siRNA轉(zhuǎn)染，丙組轉(zhuǎn)染CCAT1-siRNA+ miR-181a-5p inhibitor(miR-181a-5p抑制劑)，丁組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1- CCAT1過(guò)表達(dá)的慢病毒，戊組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1- CCAT1過(guò)表達(dá)的慢病毒+ miR-181a-5p mimic(miR-181a-5p類(lèi)似物)。轉(zhuǎn)染48 h采用熒光定量PCR法檢測(cè)各組RASSF1A 、cyclin D1 的mRNA表達(dá)，所有操作均嚴(yán)格按照使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用2-ΔΔCt表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。以GAPDH為內(nèi)參，RASSF1A上游引物5′-GACCTCTGTGGCGACTTCAT-3′；下游引物5′-CTCCACAGGCTCGTCGC-3′；cyclin D1上游引物5′-TGAGGGACGCTTTGTCTGTC-3′；下游引物5′-GCCTTTGGCCTCTCGATACA-3′； GAPDH上游引物5′-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3′；下游引物5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′。20 μL體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為：37 ℃、30 min，85 ℃、5 s,4 ℃。PCR體系為：10 μL SYBR染液，上下游引物各0.8 μL，模板1 μL，其余采用DEPC水補(bǔ)齊。反應(yīng)條件：92 ℃、3 min預(yù)變性，92 ℃、30 s,58 ℃、15 s，39個(gè)循環(huán)，72 ℃、1 min,4 ℃。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖情況比較 轉(zhuǎn)染0、24、48 h各組細(xì)胞增殖情況比較見(jiàn)表1。

表1 轉(zhuǎn)染0、24、48 h各組細(xì)胞OD值比較

注：與2組比較，*P<0.05；與4組比較，#P<0.05。

2.2 HeLa細(xì)胞CCAT1細(xì)胞定位及互補(bǔ)microRNA分子分析 核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)提示 約70%CCAT1位于細(xì)胞質(zhì)中，30%位于細(xì)胞核中，主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。互補(bǔ)microRNA分子分析結(jié)果見(jiàn)表2。與CCAT1互補(bǔ)的前6位microRNA分別為miR-181a-5p、miR-181b-5p、miR-4295、miR-130a-5p、miR-148b-3p、miR-543。

表2 與CCAT1互補(bǔ)的microRNA分子分析結(jié)果

2.3 各組細(xì)胞miR-181a-5p、miR-181b-5p、miR-4295、miR-130a-5p、miR-148b-3p、miR-543相對(duì)表達(dá)量比較 各組細(xì)胞miR-181a-5p、miR-181b-5p、miR-4295、miR-130a-5p、miR-148b-3p、miR-543相對(duì)表達(dá)量比較見(jiàn)表3。

2.4 各組細(xì)胞RASSF1A 、cyclin D1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 各組細(xì)胞RASSF1A 、cyclin D1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，見(jiàn)表4。

3 討論

非編碼RNA是一大類(lèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不翻譯成蛋白質(zhì)的核酸分子，主要包括tRNA、piRNA、microRNA、LncRNA等。其中microRNA的研究相對(duì)較多，其發(fā)揮作用的主要方式是負(fù)性調(diào)控，LncRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度超過(guò)200 bp的轉(zhuǎn)錄本，具有來(lái)源豐富、組織特異性好、部分序列保守等特點(diǎn)[17]。相較于micorRNA，LncRNA的作用方式更為復(fù)雜，具有順勢(shì)(cis)調(diào)控作用和反式調(diào)控(trans)等多種調(diào)控方式，其既能位于細(xì)胞核中，也能分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；既可以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，也可以抑制轉(zhuǎn)錄；既能通過(guò)分子支架作用結(jié)合蛋白質(zhì)，也能通過(guò)海綿作用吸附microRNA分子[11～13]。既可以修飾蛋白質(zhì)，也可以影響mRNA的成熟和穩(wěn)定；既可以結(jié)合核酸，也可以結(jié)合蛋白。例如HotAir可以與PRC2復(fù)合體互作，影響組蛋白H3K27表觀(guān)遺傳學(xué)改變[18]，在肝癌、食管癌、乳腺癌、胰腺癌等疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用；Xist同樣也可以通過(guò)募集PRC2復(fù)合體，介導(dǎo)X染色體失活[19]；而H19則可以作為分子篩發(fā)揮“海綿作用”吸附microRNA分子，最終影響對(duì)應(yīng)microRNA的靶mRNA分子[20]。然而，宮頸癌相關(guān)的LncRNA研究，卻知之甚少。

表3 各組細(xì)胞miR-181a-5p、miR-181b-5p、miR-4295、miR-130a-5p、miR-148b-3p、miR-543相對(duì)表達(dá)量比較

注：與A組比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05。

表4 各組細(xì)胞RASSF1A 、cyclin D1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與甲組比較，*P<0.05；與乙組比較，#P<0.05，與丙組比較，△P<0.05；與丁組比較，##P<0.05。

本研究發(fā)現(xiàn)CCAT1抑制人HeLa細(xì)胞增殖，其發(fā)揮作用可能是通過(guò)與miR-181a-5p互補(bǔ)配對(duì)，抑制miR-181a-5p表達(dá)從而上調(diào)miR-181a-5p靶分子RASSF1A表達(dá)，進(jìn)而抑制cyclin D1轉(zhuǎn)錄，最終抑制HeLa細(xì)胞增殖。為研究CCAT1在宮頸癌中的是否具有作用，我們首先在HeLa細(xì)胞針對(duì)CCAT1進(jìn)行了敲降，發(fā)現(xiàn)HeLa細(xì)胞的增殖能力顯著上調(diào)，而過(guò)表達(dá)CCAT1將抑制HeLa細(xì)胞增殖。核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CCAT1主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，而hotair、NEAT1主要位于細(xì)胞核中，這提示CCAT1可能與某些microRNA分子具有互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合的可能，由此我們通過(guò)starbase V2.0網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)，CCAT1與miR-181b-5p、miR-181a-5p、miR-4295、miR-130a-3p、miR-148b-3p等microRNA分子具有序列互補(bǔ)配對(duì)，提示存在結(jié)合的可能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，敲降CCAT1后，miR-181b-5p、miR-181a-5p、miR-4295、miR-130a-3p表達(dá)均上調(diào)，而過(guò)表達(dá)CCAT1則抑制miR-181b-5p、miR-181a-5p、miR-4295、miR-130a-3p的表達(dá)，也即CCAT1與以上microRNA分子具有趨勢(shì)相反的表達(dá)。其中miR-181b-5p的變化最為顯著，遠(yuǎn)超于其余三個(gè)microRNA分子，這提示CCAT1可能主要通過(guò)影響miR-181b-5p的分子功能，發(fā)揮抑癌作用。序列互補(bǔ)分析提示CCAT1與miR-181b-5p具有13個(gè)堿基的互補(bǔ)配對(duì)，強(qiáng)烈提示存在直接結(jié)合的可能。既往研究表明，miR-181b-5p可以通過(guò)與抑癌基因RASSF1A的mRNA 3′UTR結(jié)合[16]，下調(diào)其mRNA表達(dá)水平，反之促進(jìn)RASSF1A下游基因周期蛋白cyclin D1轉(zhuǎn)錄，加速細(xì)胞增殖。為研究CCAT1是否通過(guò)miR-181b-5p發(fā)揮抑癌基因作用，我們通過(guò)補(bǔ)救實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證猜想。結(jié)果提示：敲降CCAT1導(dǎo)致的RASSF1A下調(diào)和cyclin D1上調(diào)，在給予miR-181a-5p inhibitor后，均可得到逆轉(zhuǎn)；而過(guò)表達(dá)CCAT1導(dǎo)致的RASSF1A上調(diào)和cyclin D1下調(diào)，在給予miR-181a-5p mimic后，同樣得到了逆轉(zhuǎn)。

綜上所述，CCAT1可抑制HeLa細(xì)胞的增殖。其機(jī)制可能為CCAT1上調(diào)RASSF1A表達(dá)、抑制cyclin D1轉(zhuǎn)錄。CCAT1通過(guò)與miR-181a-5p互補(bǔ)配對(duì)調(diào)控RASSF1A、cyclin D1的表達(dá)。

[1] Hammer A, Rositch A. Age-specific prevalence of HPV16/18 genotypes in cervical cancer: A systematic review and meta-analysis [J]. Int J Cancer， 2016，138(12):2795-2803.

[2] 張珊,洪穎,馬莉,等.宮頸細(xì)胞學(xué)陰性HPV陽(yáng)性婦女的HPV分型檢測(cè)[J].山東醫(yī)藥,2015,55(43) : 5-7.

[3] Duval M. A systematic study on dysregulated microRNAs in cervical cancer development[J].Int J Cancer， 2016，138(6):1312-1327.

[4] Sullenger BA, Nair S. From the RNA world to the clinic[J].Science, 2016,352(6292):1417-1420.

[5] Zhang C, Gao L, Xu EY. LncRNA, a new component of expanding RNA-protein regulatory network important for animal sperm development[J]. Semin Cell Dev Biol, 2016,(16)30175-30176.

[6] Stuwe E, Tóth KF, Aravin AA. Small but sturdy: small RNAs in cellular memory and epigenetics[J]. Genes Dev, 2014,28(5):423-431.

[7] Chen LL. Linking Long Noncoding RNA Localization and Function[J]. Trends Biochem Sci, 2016,41(9):761-772.

[8] Ferrari D, Bianchi N. MicroRNAs Modulate the Purinergic Signaling Network[J]. Trends Mol Med, 2016,22(10):905-918.

[9] Piletia K, Kunej T. MicroRNA epigenetic signatures in human disease[J]. Arch Toxicol, 2016,90(10): 2405-2419.

[10] Logan M, Hawkins SM. Role of microRNAs in cancers of the female reproductive tract: insights from recent clinical and experimental discovery studies[J].Clin Sci (Lond), 2015,128(3):153-180.

[11] Xu S, Wang H. ANRIL lncRNA triggers efficient therapeutic efficacy by reprogramming the aberrant INK4-hub in melanoma[J]. Cancer Lett, 2016,381(1):41-48.

[12] Thomson DW, Dinger ME. Endogenous microRNA sponges: evidence and controversy[J].Nat Rev Genet, 2016,17(5):272-283.

[13] Sauvaget C, Nishino Y, Konno R, et al. Challenges in breast and cervical cancer control in Japan[J].Lancet Oncol, 2016,17(7): 305-312.

[14] Mizrahi I, Mazeh H. Colon Cancer Associated Transcript-1 (CCAT1) Expression in Adenocarcinoma of the Stomach[J].J Cancer, 2015,6(2):105-110.

[15] Yuan JH, Yang F. A long noncoding RNA activated by TGF-β promotes the invasion-metastasis cascade in hepatocellular carcinoma[J].Cancer Cell, 2014,25(5):666-681.

[16] Briuer-Hartmann D, Hartmann JU. PML/RARα-Regulated miR-181a/b Cluster Targets the Tumor Suppressor RASSF1A in Acute PromyelocyticLeukemia[J].Cancer Res，2015,75(16):3411-3424.

[17] Quinn JJ, Chang HY. Unique features of long non-coding RNA biogenesis and function[J].Nat Rev Genet, 2016,17(1):47-62.

[18] Li L, Liu B. Targeted disruption of Hotair leads to homeotic transformation and gene derepression[J].Cell Rep, 2013,5(1):3-12.

[19] Sarma K, Cifuentes-Rojas C. ATRX directs binding of PRC2 to Xist RNA and Polycombtargets[J].Cell, 2014，159(4):869-883.

[20] Kallen AN, Zhou XB. The imprinted H19 lncRNA antagonizes let-7 microRNAs[J].Mol Cell，2013,52(1):101-112.

·作者·編者·讀者·

文后參考文獻(xiàn)的著錄方法

按GB/T7714-2005《文后參考文獻(xiàn)著錄規(guī)劃》采用順序編碼制著錄，依照其在文中出現(xiàn)的先后順序用阿拉伯?dāng)?shù)字加方括號(hào)標(biāo)出。參考文獻(xiàn)中的作者1～3名全部列出，3名以上只列前3名，后加“，等”或其他與之相應(yīng)的文字。外文期刊名稱(chēng)用縮寫(xiě)，以《Index Medicus》中的格式為準(zhǔn)；中文期刊用全名。論文題目后加文獻(xiàn)類(lèi)型及標(biāo)識(shí)，如專(zhuān)著[M]、期刊文章[J]等。每條參考文獻(xiàn)均須著錄起止頁(yè)。作者必須認(rèn)真核對(duì)參考文獻(xiàn)原文，無(wú)誤后將其按引用順序(用阿拉伯?dāng)?shù)字)排列于文末。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.19.009

R737.33

A

1002-266X(2017)19-0033-04

2016-10-26)