曹衛(wèi)平，馬青，師偉，劉少玲，李霞，王東梅

(1 山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，濟南250014；2 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；3 煙臺市中醫(yī)醫(yī)院；4 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所)

香延止痛方對寒凝血瘀證原發(fā)性痛經(jīng)大鼠的治療效果及其作用機制

曹衛(wèi)平1，2，馬青1，師偉2，劉少玲3，李霞4，王東梅2

(1 山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，濟南250014；2 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；3 煙臺市中醫(yī)醫(yī)院；4 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所)

目的 探討香延止痛方對寒凝血瘀證原發(fā)性痛經(jīng)大鼠的治療效果及其作用機制。方法 選擇大鼠50只，隨機分為空白組、模型組、西藥組及中藥低、高劑量組，模型組、西藥組及中藥低、高劑量組建立寒凝血瘀證原發(fā)性痛經(jīng)模型，造模第7天，空白組和模型組予蒸餾水2 mL/只灌胃，西藥組予布洛芬按每日0.002 g灌胃2 mL/只，中藥低劑量組給予香延止痛方水煎劑2 mL/只(含生藥2.38 g)，中藥高劑量組給予香延止痛方水煎劑2 mL/只(含生藥11.9 g)。各組均連續(xù)灌胃6天。末次灌胃30 min，除空白組外，其余各組腹腔注射縮宮素，觀察大鼠扭體潛伏時間及30 min內(nèi)扭體反應(yīng)次數(shù)。采用ELISA法檢測各組子宮組織上清液INF-γ、IL-4水平，RT-PCR法檢測子宮組織上清液INF-γ、IL-4 mRNA表達。結(jié)果 中藥低、高劑量組30 min內(nèi)扭體次數(shù)明顯少于模型組(P均<0.05)，扭體潛伏時間有延長趨勢(P均>0.05)。與空白組比較，模型組子宮組織上清液IFN-γ水平降低、IL-4水平升高，IFN-γ/IL-4降低，TNF-α mRNA表達降低，IL-4 mRNA表達升高(P均<0.05)；與模型組比較，中藥低、高劑量組IFN-γ含量升高，IL-4含量降低，IFN-γ/IL-4升高，TNF-α mRNA表達升高，IL-4 mRNA表達降低(P均<0.05)；但中藥低、高劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論 寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)大鼠存在Th1/Th2平衡漂移，香延止痛方可能通過調(diào)節(jié)Th1/Th2的平衡狀態(tài)緩解痛經(jīng)癥狀。

原發(fā)性痛經(jīng)；寒凝血瘀證；香延止痛方；中藥；大鼠

原發(fā)性痛經(jīng)臨床常見,長期嚴(yán)重的原發(fā)性痛經(jīng)可導(dǎo)致經(jīng)血逆流，明顯增加子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌病的發(fā)生率，使不孕癥風(fēng)險增加。據(jù)統(tǒng)計，大約10%的原發(fā)性痛經(jīng)患者可發(fā)展為繼發(fā)性痛經(jīng)，繼而引起子宮內(nèi)膜異位癥[1]。原發(fā)性痛經(jīng)以寒凝血瘀證最為常見[2]，本研究參照相關(guān)文獻[3，4]建立了寒凝血瘀證型原發(fā)性痛經(jīng)大鼠模型，觀察香延止痛方的治療效果，并對其可能的作用機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年雌性Wistar大鼠50只，清潔級，2～3月齡，體質(zhì)量180～200 g，由山東魯抗動物飼料經(jīng)銷中心提供，動物合格證號：SCXK(魯)20120002。所有大鼠于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實驗動物中心分籠飼養(yǎng)，每籠5只，室溫23～25 ℃，相對濕度50%～60%，通風(fēng)及光照良好，標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料常規(guī)喂養(yǎng)，自由攝食、飲水。香延止痛方，由醋香附、醋延胡索、肉桂、當(dāng)歸、赤芍、白芍、鹽小茴香、干姜、陳皮、蒲黃、川芎、沒藥、肉豆蔻、甘草組成，由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供；布洛芬緩釋膠囊(批號：H10900089，規(guī)格0.3 g/粒)，中美天津史克制藥有限公司；所有引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成。大鼠血清IFN-γ和IL-4 ELISA試劑盒，美國R&D公司。

1.2 動物模型制備及處理 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按隨機數(shù)字表法將其分為空白組、模型組、西藥組及中藥低、高劑量組，每組10只。除空白組外，其余各組參照文獻[3，4]建立寒凝血瘀證原發(fā)性痛經(jīng)大鼠模型：每天定時置于冰塊上20 min，連續(xù)12天，以寒冷刺激誘導(dǎo)形成寒凝血瘀證模型；同時，每天皮下注射苯甲酸雌二醇注射液0.4 mg/只，第1天及第12天為0.8 mg/只(首、末次加倍以保證其血藥濃度保持在一定水平)以使大鼠子宮同步化，并可提高大鼠子宮對催產(chǎn)素的敏感性，在第12天腹腔注射縮宮素2 U/只，使大鼠子宮產(chǎn)生強烈收縮，以制造寒凝血瘀證原發(fā)性痛經(jīng)模型。寒凝血瘀證原發(fā)性痛經(jīng)模型判定：大鼠出現(xiàn)寒戰(zhàn)，蜷縮少動，反應(yīng)遲鈍，爪尾部紫暗，耳色暗紅，呼吸弱，喜扎堆，被毛無光澤，舌質(zhì)紫暗，舌下脈絡(luò)增粗增長，并出現(xiàn)扭體反應(yīng)。根據(jù)人與大鼠體表面積換算方法計算給藥劑量，造模第7天開始，空白組和模型組給予蒸餾水2 mL/只，西藥組給予布洛芬按每日0.002 g灌胃2 mL/只，中藥低劑量組給予香延止痛方水煎劑2 mL/只(含生藥2.38 g)，中藥高劑量組給予香延止痛方水煎劑2 mL/只(含生藥11.9 g)。各組均連續(xù)灌胃6天。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 扭體潛伏時間及扭體次數(shù) 除空白組外，其余各組末次給藥30 min，腹腔內(nèi)注射縮宮素2 U/只，記錄自注射縮宮素開始至出現(xiàn)扭體的潛伏時間及30 min內(nèi)扭體次數(shù)。

1.3.2 子宮組織上清液IFN-γ、IL-4含量 各組大鼠麻醉后固定于手術(shù)板上，取出子宮，剪碎，200目銅網(wǎng)研磨過濾，1×PBS沖洗，400 g離心6 min，取上清。采用ELISA試劑盒說明加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品于反應(yīng)孔內(nèi)，溫育，洗滌；加入酶標(biāo)試劑50 μL，溫育，洗滌；加入底物，37 ℃避光顯色15 min，加入終止液，采用酶標(biāo)儀測定各孔光密度(OD)值，利用CurveExpert1.3軟件計算子宮組織上清液IFN-γ、IL-4水平，并計算IFN-γ/IL-4。

1.3.3 子宮組織IFN-γ、IL-4 mRNA表達 采用RT-PCR法。取部分子宮組織，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離子宮組織單個核細胞，制成細胞懸液。提取細胞總RNA，采用oligo dT為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)引物，取2.5 μg總RNA按RT試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄cDNA 20 μL。引物序列：TNF-α上游引物：5′-GCACCCCCAACCTATGAAGA-3′，下游引物：5′-CGGGAGCACTTGTCTACCTC-3′，擴增產(chǎn)物471 bp；IL-4上游引物：5′-CCTTGCTGTCACCCTGTTCT-3′，下游引物：5′-TCATTCACGGTTGCAGCTTCT-3′，擴增產(chǎn)物336 bp?？偡磻?yīng)體系為25 μL，包含RT產(chǎn)物5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，上下游引物各0.25 μL(25 pmol)，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，Taq DNA聚合酶 0.5 μL，DEPC水14 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 1 min，58 ℃～60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共26個循環(huán)，最后70 ℃延伸10 min。1.5 %凝膠(EB染色)水平電泳，采用Alpha凝膠成像系統(tǒng)分析圖像。以β-actin為內(nèi)參照，TNF-α、IL-4 mRNA條帶灰度值與同步β-actin條帶灰度值比值作為TNF-α、IL-4 mRNA的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組扭體潛伏時間及30 min內(nèi)扭體次數(shù)比較 實驗過程中，空白組、中藥低劑量組和中藥高劑量組各死亡1只，模型組死亡2只。各組扭體潛伏時間及30 min內(nèi)扭體次數(shù)比較見表1。

表1 各組扭體潛伏時間及30 min內(nèi)扭體次數(shù)比較

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與西藥組比較，#P<0.05。

2.2 各組子宮組織上清液IFN-γ、IL-4水平及IFN-γ/IL-4比較 見表2。

表2 各組子宮組織上清液體IFN-γ、IL-4水平及IFN-γ/IL-4比較

注：與空白組比較，△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05；與西藥組比較，#P<0.05。

2.3 各組子宮組織TNF-α、IL-4 mRNA表達比較 見表3。

表3 各組子宮組織TNF-α、IL-4 mRNA相對表達量比較

注：與空白組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.01。

3 討論

原發(fā)性痛經(jīng)屬中醫(yī)學(xué)“月經(jīng)來腹痛”、“經(jīng)行腹痛”“經(jīng)痛”范疇，其病位在沖任、子宮，變化在氣血，病機為不通則痛或不榮則痛[5]，常見證型為氣滯血瘀、寒凝血瘀、濕熱瘀阻、氣血虛弱、肝腎虧損。有研究表明，寒邪是其主要病因，寒邪所致寒凝血瘀是最常見病機[6]。《素問·舉痛論》所言：寒氣入經(jīng)而稽遲，泣而不行，客于脈外則血少，客于脈中則氣不通，故卒然而痛，即不通則痛。

Th1和Th2細胞均屬于輔助T細胞。未受抗原刺激的初始CD4+T細胞為Th，受到不同性質(zhì)的抗原或細胞因子等因素的調(diào)控，可向不同譜系分化。在正常機體內(nèi)，Th1細胞和Th2細胞通過分泌細胞因子參與不同的免疫反答，可互相調(diào)節(jié)或產(chǎn)生交叉調(diào)節(jié)作用，一般處于相對平衡的狀態(tài)。但當(dāng)人體發(fā)生功能異常時，機體免疫系統(tǒng)選擇某一亞群為主的應(yīng)答，這種Th細胞就會正反饋地增強自身優(yōu)勢，壓制另一亞群的發(fā)展，即表現(xiàn)出Th1/Th2平衡偏向其中一方，即Th1/Th2平衡漂移現(xiàn)象。

目前已有研究報道，原發(fā)性痛經(jīng)患者體內(nèi)存在Th1/Th2平衡漂移現(xiàn)象。張茜薇等[7]研究認(rèn)為，內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)失調(diào)是原發(fā)性痛經(jīng)的發(fā)病原因之一，表現(xiàn)為Th2過度表達。而抑制Th2細胞因子過度表達，促使Th1/Th2趨于平衡可改善原發(fā)性痛經(jīng)患者內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)失調(diào)的內(nèi)環(huán)境達到治療目的。蔣競等[8]研究發(fā)現(xiàn)，雌二醇(E2)水平可影響體內(nèi)Th1/Th2平衡，過高的E2引起Th1/Th2平衡向Th2漂移。E2及其受體表達水平升高，可引致相關(guān)致痛物質(zhì)如PGF2α、TXB2、ET等含量過高，致使子宮肌痙攣、缺血進而產(chǎn)生疼痛[9]。此外，Th1和Th2亞群相關(guān)細胞因子亦與前列腺素的分泌密切相關(guān)[10]，其中TNF可刺激子宮內(nèi)膜巨噬細胞產(chǎn)生PGE2，而IL-4可抑制PGE2的產(chǎn)生[11]。

香延止痛方是王東梅教授在長期臨床實踐中總結(jié)、提煉出來用于治療痛經(jīng)的有效方劑，具有溫經(jīng)散寒、化瘀止痛之效，臨床療效確切。前期動物實驗表明，香延止痛方可顯著延長痛經(jīng)模型小鼠的扭體反應(yīng)潛伏期，減少扭體反應(yīng)次數(shù)，降低痛經(jīng)模型大鼠子宮組織PGF2α含量，提高PGE2含量[12]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究也證實，香延止痛方中組藥具有明顯的鎮(zhèn)痛作用。如陳運等[13]研究發(fā)現(xiàn)，香附揮發(fā)油0.1 g/kg灌胃能夠顯著減少醋酸引起的小鼠15、30 min內(nèi)扭體次數(shù)，與0.03 g/kg阿司匹林效果相當(dāng)；白芍總苷可顯著降低醋酸引起的小鼠扭體次數(shù)，亦具有較好的鎮(zhèn)痛效果[14]。

本研究顯示，模型組、西藥組及中藥低、高劑量組扭體潛伏時間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但較模型組有延長趨勢；而30 min扭體次數(shù)西藥組及中藥低、高劑量組較模型組明顯降低，且中藥低、高劑量組效果更好。說明香延止痛方可緩解寒凝血瘀證原發(fā)性痛經(jīng)大鼠痛經(jīng)癥狀。本研究還發(fā)現(xiàn)，模型組存在Th1/Th2失衡，平衡向Th2亞群漂移，即子宮組織IFN-γ降低、IL-4升高；西藥組及中藥低、高劑量組子宮組織IFN-γ均較模型組升高，IL-4含量均較模型組降低，以西藥組效果最好，而中藥低、高劑量組比較無統(tǒng)計學(xué)差異，說明香延止痛方能誘導(dǎo)Th1/Th2平衡向Th1亞群漂移。本研究還發(fā)現(xiàn)，西藥組及中藥低、高劑量組子宮組織上清液IFN-γ mRNA升高，IL-4 mRNA降低，與子宮組織IFN-γ、IL-4變化趨勢一致，說明香延止痛方可通過調(diào)節(jié)IFN-γ、IL-4 mRNA表達維持Th1/Th2亞群處于平衡狀態(tài)，進而改善痛經(jīng)癥狀。 綜上所述，香延止痛方能明顯改善寒凝血瘀證原發(fā)性痛經(jīng)大鼠的癥狀，其作用機制可能與調(diào)節(jié)Th1/Th2亞群的平衡狀態(tài)有關(guān)。但其具體機制和作用靶點還需在以后的課題中進一步深入研究。

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山東省重點研發(fā)計劃項目(2015GSF119010)。

王東梅(E-mail: 214693067@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.19.011

文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1002-266X(2017)19-0040-03

2016-12-19)