李漾超，李云，李姝，楊寧

(1大理大學(xué)附屬醫(yī)院，云南大理671000 ；2大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院)

腦卒中后抑郁大鼠額葉、海馬、杏仁核神經(jīng)元數(shù)量變化

李漾超1，李云1，李姝，楊寧2

(1大理大學(xué)附屬醫(yī)院，云南大理671000 ；2大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院)

目的 觀察腦卒中后抑郁(PSD)大鼠大腦情感障礙相關(guān)腦區(qū)額葉、海馬、杏仁核神經(jīng)元數(shù)量變化。方法 將20只健康成年雌性SD大鼠隨機分為抑郁組、卒中組、PSD組和對照組，每組5只。抑郁組采用孤養(yǎng)法加以慢性不可預(yù)見的中等強度應(yīng)激刺激(CUMS)制作抑郁模型。卒中組用線栓法建立腦卒中模型。PSD組先用線栓法建立腦卒中模型，然后用孤養(yǎng)法加以CUMS制作PSD模型。對照組大鼠正常飼養(yǎng)。給予CUMS后第29天處死各組大鼠，取額葉、海馬、杏仁核區(qū)腦組織行神經(jīng)元特異性核蛋白(NeuN)免疫熒光組織染色，光鏡下計數(shù)并比較各組大鼠額葉、海馬、杏仁核中神經(jīng)元(NeuN陽性細胞)的數(shù)量。結(jié)果 PSD組大鼠情感障礙相關(guān)腦區(qū)額葉、海馬、杏仁核中神經(jīng)元數(shù)量分別為(98.20±1.78) 、(43.00±7.87) 、(93.00±3.53) 個/視野，均低于其他三組(P均<0.05) 。結(jié)論 PSD組大鼠情感障礙相關(guān)腦區(qū)額葉、海馬和杏仁核神經(jīng)元數(shù)量減少。

腦卒中后抑郁；額葉；海馬；杏仁核；神經(jīng)元；神經(jīng)元特異性核蛋白

腦卒中是當(dāng)今危害人類健康的最主要的疾病之一，具有高死亡率和高致殘率的特點。抑郁癥是腦卒中常見的并發(fā)癥，常與卒中后殘疾、認知障礙和較高的病死率相關(guān)。腦卒中后抑郁(PSD)表現(xiàn)為卒中后情緒低落、悲觀厭世、煩躁、缺乏主動性、食欲不振、睡眠障礙及全身疲勞等癥狀。抑郁癥并非完全是功能性的精神障礙，患者存在腦形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，發(fā)生結(jié)構(gòu)改變的部位可涉及額葉、顳葉以及與其相聯(lián)系的紋狀體、皮層和丘腦。邊緣系統(tǒng)的海馬和杏仁核參與了情感和行為的形成過程，與抑郁癥關(guān)系密切。有研究發(fā)現(xiàn)PSD大鼠杏仁核神經(jīng)元出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象[1]。提示PSD大鼠大腦情感障礙相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)元數(shù)量可能發(fā)生了變化，但尚未見相關(guān)文獻報道。NeuN是神經(jīng)元的一種敏感、特異的標(biāo)記物，腦組織中的NeuN陽性染色細胞即為神經(jīng)元[2]。本研究觀察了PSD大鼠情感障礙相關(guān)腦區(qū)額葉、海馬、杏仁核區(qū)神經(jīng)元數(shù)量的變化，明確PSD大鼠情感相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)元存活情況?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇清潔級健康成年雌性SD大鼠20只，體質(zhì)量200～250 g。大鼠由昆明醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，動物質(zhì)量合格證號：SYXK(滇)2005-0004。實驗過程中對動物處置符合大理大學(xué)實驗動物處置的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。小鼠抗神經(jīng)核單克隆抗體(一抗)購自 Millipore公司；DylightTM488標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(二抗)購自KPL公司。

1.2 動物分組及處理 將20只大鼠按隨機數(shù)字表法分為抑郁組、卒中組、PSD組、對照組，每組5只。卒中組采用線栓法[3]建立局灶性腦缺血模型，制備后置于同一籠內(nèi)飼養(yǎng)，正常飲食、飲水。抑郁組每籠1只單獨飼養(yǎng)，采用慢性不可預(yù)見的中等應(yīng)激刺激(CUMS)結(jié)合孤養(yǎng)法建立慢性應(yīng)激抑郁模型，共刺激28 d。PSD組：采用線栓法建立局灶性腦缺血模型，造模后每籠1只單獨飼養(yǎng)，術(shù)后1周采用CUMS結(jié)合孤養(yǎng)方法建立PSD大鼠模型，共刺激28 d。正常組：大鼠置于同一籠內(nèi)飼養(yǎng)，正常飲食、飲水。以上各組動物在相互隔離的環(huán)境下飼養(yǎng)，術(shù)后常規(guī)腹腔注射青霉素預(yù)防感染。各組均造模成功。

1.3 各組大鼠額葉、海馬、杏仁核區(qū)神經(jīng)元計數(shù)方法 采用NeuN免疫熒光組織染色法。各組大鼠CUMS第29天斷頭取腦，將腦組織放入4%多聚甲醛固定6 h。梯度酒精脫水后進行石蠟包埋、切片，冠狀面上切取大腦額葉、海馬、杏仁核，片厚5 μm，撈片后自然干燥，放入60 ℃烤箱烤2 h。二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，置于修復(fù)液中高壓修復(fù)后自然冷卻，依次用蒸餾水、PBS漂洗，封閉非特異性的抗原抗體反應(yīng)1h后，加入1∶750稀釋的一抗4 ℃過夜,PBST充分漂洗后加入1∶100的二抗，室溫下孵育1h(嚴格避光)，PBS漂洗后50%甘油封片(嚴格避光)。熒光顯微鏡下觀察。激發(fā)波長493 nm，發(fā)射波長518 nm，細胞核或細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光者為神經(jīng)元細胞。每只大鼠每個腦區(qū)選擇5張切片，每個切片選擇5個非重疊視野(×400)，計數(shù)視野內(nèi)神經(jīng)元細胞數(shù)量。

2 結(jié)果

各組大鼠額葉、海馬、杏仁核中神經(jīng)元數(shù)量見表1。由表1可見，PSD組大鼠額葉、海馬、杏仁核中神經(jīng)元數(shù)量均低對照組、抑郁組和卒中組(P均<0.05)，抑郁組和卒中組大鼠額葉、海馬、杏仁核中神經(jīng)元數(shù)量均低于對照組(P均<0.05)。

表1 各組大鼠額葉、海馬、杏仁核中神經(jīng)元數(shù)比較

注:與對照組相比，☆P<0.05；與抑郁組相比，*P<0.05；與卒中組相比，#P<0.05。

3 討論

NeuN是一種可溶解的核蛋白, 在體外可與DNA疏松的結(jié)合，同時NeuN也是脊椎動物神經(jīng)系統(tǒng)大多數(shù)神經(jīng)元胞核中的特異性蛋白質(zhì), 其只在成熟神經(jīng)元細胞核中特異性表達，因此NeuN被作為脊椎動物成熟神經(jīng)元的特異性標(biāo)記物。NeuN能與脊椎動物神經(jīng)系統(tǒng)中很多部位的成熟神經(jīng)細胞核發(fā)生免疫反應(yīng), 包括脊髓、大腦皮質(zhì)、海馬、背側(cè)丘腦、尾殼核、小腦等的神經(jīng)元，主要參與調(diào)解神經(jīng)元發(fā)育成熟的轉(zhuǎn)錄過程，而且僅僅在于神經(jīng)元前體細胞遷移結(jié)束后才表達。NeuN檢測神經(jīng)元成熟比其他常用的神經(jīng)元標(biāo)記物更為敏感。

大腦皮質(zhì)是機體的最高調(diào)節(jié)者，也是情感活動的最高調(diào)節(jié)者。前皮質(zhì)尤其是額葉皮質(zhì)與人的情緒、抽象思維和高級神經(jīng)活動相關(guān)，是腦內(nèi)重要的情感整合中樞。海馬的功能是參與情緒的控制和反應(yīng)，與情緒和認知關(guān)系密切；杏仁核是邊緣系統(tǒng)的一部分，是產(chǎn)生情緒，識別情緒和調(diào)節(jié)情緒，控制學(xué)習(xí)和記憶的腦組織。研究表明，PSD患者存在海馬及杏仁核容積異常縮小[3]。影像學(xué)研究結(jié)果也表明抑郁患者杏仁核容積明顯小于對照組[4,5]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PSD大鼠額前皮質(zhì)、海馬及杏仁核NeuN陽性細胞較其他對照組明顯減少，提示PSD大鼠情感障礙相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)元細胞存活較少，神經(jīng)細胞存在異常的死亡和丟失情況。

細胞凋亡是指為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，而形成的由基因控制的細胞自主的有序的死亡。正常情況下，細胞凋亡涉及一系列基因的激活、表達以及調(diào)控，細胞凋亡能使細胞更好的適應(yīng)環(huán)境。但有研究發(fā)現(xiàn)腦缺血可以引起神經(jīng)元的凋亡[6,7]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，額葉、海馬、杏仁核等部位對缺血極為敏感，缺血后神經(jīng)元細胞極易出現(xiàn)凋亡、壞死。卒中導(dǎo)致神經(jīng)元細胞凋亡、壞死的途徑有：受體途徑[8，9]、線粒體途徑[10，11]及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[12]途徑。缺血性腦卒中后，缺血、缺氧可導(dǎo)致神經(jīng)元出現(xiàn)一系列異常變化，如細胞腫脹、細胞裂解、細胞器游離等，加速了神經(jīng)元細胞的凋亡、壞死，進而形成腦組織不可逆性損傷，出現(xiàn)腦神經(jīng)功能損害表現(xiàn)[13,14]。有研究發(fā)現(xiàn)PSD大鼠海馬和杏仁核區(qū)域凋亡細胞增加[15，16]。本研究結(jié)果顯現(xiàn)，腦卒中組、抑郁組及PSD組情感障礙相關(guān)腦區(qū)NeuN陽性細胞較正常對照組明顯減少，而PSD組較各對照組明顯減少，提示上述疾病狀態(tài)均可導(dǎo)致細胞凋亡增加，細胞存活減少，這種改變在PSD病理過程中可能最為明顯。

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國家自然科學(xué)基金資助項目(81360208)。

李云(E-mail： liyun_neuron@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.19.012

R749.1

A

1002-266X(2017)19-0043-03

2016-09-07)