李昌紅,車玲玉,程振輝,孫鑫,白云

(華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北唐山063000)

宮頸癌組織中p16蛋白、線粒體融合蛋白2的表達(dá)變化

李昌紅,車玲玉,程振輝,孫鑫,白云

(華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北唐山063000)

目的 觀察宮頸癌組織中抑癌基因p16和線粒體融合蛋白2(HSG)的表達(dá)變化。方法 采用免疫組織化學(xué)的方法檢測72例宮頸癌組織、51例宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)組織(其中CINⅠ級27例、CINⅡ級10例、CINⅢ級14例)、25例正常宮頸組織中p16和HSG的表達(dá)。結(jié)果 宮頸癌組織、CINⅠ組織、CINⅡ組織、CIN Ⅲ組織、正常宮頸組織中p16的陽性表達(dá)率分別為91.67%(66/72)、22.22%(6/27)、60.00%(6/10)、64.28%(9/14)、20.00%(5/25)；宮頸癌組織中p16的陽性表達(dá)率均高于CIN宮頸組織、正常宮頸組織(P均<0.05)。宮頸癌組織、CINⅠ組織、CINⅡ組織、CIN Ⅲ組織、正常宮頸組織中HSG的陽性表達(dá)率分別為 8.3%(6/72)、44.44%(12/27)、40.00%(4/10)、35.7%(5/14)、60.00%(15/25)；宮頸癌組織中HSG陽性表達(dá)率低于CINⅠ組織、CINⅡ組織、CIN Ⅲ組織、正常宮頸組織(P均<0.05)。p16表達(dá)與宮頸癌分化程度有關(guān)(P<0.05); HSG表達(dá)與宮頸癌臨床分期、分化程度有關(guān)(P均<0.05),與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及病理類型無關(guān)(P均>0.05)。相關(guān)性分析顯示，宮頸癌組織p16表達(dá)與HSG的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.464，P<0.05)。結(jié)論 宮頸癌組織中p16陽性表達(dá)率降低，HSG陽性表達(dá)率升高。p16、HSG的異常表達(dá)可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

宮頸腫瘤；宮頸癌；多腫瘤抑癌基因；細(xì)胞增殖抑制基因

宮頸癌是女性生殖道最常見的惡性腫瘤之一[1]。p16又稱多腫瘤抑制基因，是被發(fā)現(xiàn)的第一個可直接作用于細(xì)胞周期參與細(xì)胞周期調(diào)控，控制細(xì)胞生長與分化并抑制細(xì)胞分裂的基因[2]。p16是細(xì)胞周期中的一種抑癌基因，能直接參與細(xì)胞周期的調(diào)控并負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分裂，在肝癌、肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中存在異常表達(dá)。細(xì)胞增殖抑制基因HSG,又稱為線粒體融合蛋白2，既往研究發(fā)現(xiàn)，它可以使細(xì)胞周期停滯在G0/G期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；并且能抑制ras蛋白，調(diào)節(jié)ERK/MARP路徑，從而遏制腫瘤細(xì)胞快速增殖[3，4]。目前，國內(nèi)外關(guān)于p16、HSG在宮頸癌中的相關(guān)研究報道較少。我們觀察了宮頸癌組織中p16、HSG的表達(dá)變化，探討p16、HSG在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 宮頸病變組織標(biāo)本來源 收集2011年7月～2016年7月華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院婦科手術(shù)切除的宮頸癌組織標(biāo)本72例、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅰ27例、CINⅡ10例，CINⅢ 14例、正常宮頸組織標(biāo)本25例。宮頸癌患者中年齡(48.8±2.6 )歲，將宮頸癌患者年齡按照FIGO分期標(biāo)準(zhǔn)分為 Ⅰ期32例，Ⅱ期19例、Ⅲ～Ⅳ期21例。四類標(biāo)本來源與患者年齡等臨床資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 試劑與儀器 鼠抗人p16基因單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司 ,兔抗人HSG基因單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，SP-9001免疫組化染色試劑盒、DAB顯色劑及枸櫞酸鹽購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，華北理工大學(xué)提供Olympus光學(xué)顯微鏡。

1.3 宮頸癌組織中p16、HSG蛋白檢測方法 采用免疫組化方法。將標(biāo)本制成3 μm石蠟切片，對脫蠟完全的標(biāo)本進(jìn)行抗原修復(fù)，暴露抗原決定簇；過氧化氫溶液除去內(nèi)源性氧化酶，解除內(nèi)源物質(zhì)對實(shí)驗(yàn)的干擾；滴加一抗和HSG，4 ℃冰箱過夜。將5 μL p16與1 000 μL的稀釋液均勻混合配制成通用二抗(p16)，4 ℃冰箱過夜。DAB顯色劑進(jìn)行顯色操作，用蒸餾水洗去DAB顯色劑，然后進(jìn)行脫水，脫水后風(fēng)干，中性樹脂封片，封片完成后在顯微鏡下觀察。p16陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中，呈深黃色大顆粒。p16在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)處深黃色大顆粒為陽性；HSG陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒。HSG在細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)出棕黃色顆粒則為陽性。計(jì)算陽性細(xì)胞百分比：>60%為強(qiáng)陽性，10%～60%為陽性，<10%為弱陽性，未發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞為陰性，強(qiáng)陽性與弱陽性均判定為蛋白表達(dá)陽性。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法，相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析法。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織、CIN組織、正常宮頸組織中p16和HSG蛋白的表達(dá)變化 宮頸癌組織、CINⅠ組織、CINⅡ組織、CIN Ⅲ組織、正常宮頸組織中p16陽性表達(dá)率分別為91.67%(66/72)、22.22%(6/27)、60.00%(6/10)、64.28%(9/14)、20.00%(5/25)；宮頸癌組織中p16陽性表達(dá)率均高于CIN宮頸組織、正常宮頸組織(P均<0.05)。宮頸癌組織、CINⅠ組織、CINⅡ組織、CIN Ⅲ組織、正常宮頸組織中HSG的陽性表達(dá)率分別為 8.3%(6/72)、44.44%(12/27)、40.00%(4/10)、35.7%(5/14)、60.00%(15/25)；宮頸癌組織中HSG陽性表達(dá)率低于CINⅠ組織、CINⅡ組織、CIN Ⅲ組織、正常宮頸組織(P均<0.05)。

2.2 p16、HSG表達(dá)與宮頸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 p16表達(dá)與宮頸癌分化程度有關(guān)(P<0.05); HSG表達(dá)與宮頸癌臨床分期、分化程度有關(guān)(P均<0.05),與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及病理類型無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

表1 p16 、HSG表達(dá)與宮頸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

2.3 宮頸癌組織 p16、HSG表達(dá)的相關(guān)性 相關(guān)性分析顯示，宮頸癌組織p16表達(dá)與HSG的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.464,P<0.05)。

3 討論

宮頸癌是危害婦女健康的第二大腫瘤，死亡率位居女性惡性腫瘤的首位，同時也是女性癌癥的第二大死亡原因[9]。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程是非常復(fù)雜的，它與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)失控有關(guān)，也與多種抑癌基因的表達(dá)以及細(xì)胞凋亡的參與密切相關(guān)。

p16是1994年美國冷泉港實(shí)驗(yàn)室Kamb等科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的一種新的抗癌基因[10]，定位于人類染色體9p21上;由2個內(nèi)含子及3個外顯子組成，第1外顯子由126 bp組成，第2外顯子由307 bp組成，第3外顯子11 bp組成。該基因是細(xì)胞周期中的一種基本基因和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白之一，它可阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，從而抑制細(xì)胞增殖；p16基因的表達(dá)產(chǎn)物(即p16蛋白)直接參于細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)節(jié)并定位于細(xì)胞核內(nèi)。據(jù)之前的研究表明p16可能是比P53更重要的一種新型抗癌基因。有人把p16基因比作細(xì)胞周期中的剎車裝置，一旦失靈則會導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖[11]，便可能導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生。發(fā)生突變或缺失時，通常極易導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖[11]，形成腫瘤。p16基因直接參與腫瘤的形成，目前已經(jīng)分別在肺癌、乳腺癌、腦腫瘤、骨腫瘤、皮膚癌、膀胱癌、腎癌、卵巢癌和淋巴瘤、黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)p16基因發(fā)生突變，這提示p16基因以缺失、突變方式廣泛參予腫瘤形成[12]。因此，檢測p16基因的突變與缺失，是判斷宮頸組織是否有腫瘤以及推斷腫瘤的部分性質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)；對于宮頸癌的預(yù)后診斷及臨床治療更是具有極其重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中p16陽性表達(dá)率降低。p16的表達(dá)與宮頸癌組織分化程度有關(guān)；這說明p16基因的表達(dá)水平越高，腫瘤組織分化程度越嚴(yán)重[13]；這也提示p16基因的表達(dá)上調(diào)與宮頸癌的進(jìn)展密切相關(guān)，且能夠參與并調(diào)節(jié)生物體多種生理病理過程：具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用；能夠通過使癌變細(xì)胞的細(xì)胞周期停留在G0/G期，而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，HSG在宮頸癌組織中的表達(dá)量明顯低于在正常宮頸組織里和良性腫瘤組織當(dāng)中。在臨床分期和分化中，p16表達(dá)量與其發(fā)展程度呈負(fù)相關(guān)；且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)量低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。這即證明HSG的表達(dá)量越低，腫瘤組織發(fā)展就越慢；即HSG能較有效地抑制惡性腫瘤細(xì)胞進(jìn)而削弱癌細(xì)胞對周圍組織的浸潤作用。以上結(jié)果都充分表明了HSG是一種潛在的抑癌基因，具有抗腫瘤效應(yīng)[14]。它也是一種潛在的生物標(biāo)志物，其在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝、增殖及調(diào)亡等生理或病理性過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用；并且HSG基因與宮頸癌的不良預(yù)后也有著密切的相關(guān)性。因此它亦能夠作為評估宮頸癌病情進(jìn)展和預(yù)后的指標(biāo)之一。

HSG是具有抑制細(xì)胞增殖作用的融合蛋白，并且也是一種高度保守的跨膜GTP酶。它在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝、細(xì)胞增殖以及細(xì)胞凋亡等多種生命過程中均具有重要的調(diào)節(jié)作用；對于多種腫瘤傳代細(xì)胞系同樣具有抗增殖和誘導(dǎo)其凋亡的作用。HSG可以使分裂細(xì)胞的細(xì)胞周期在G0/G1期停止然后誘導(dǎo)相對應(yīng)的細(xì)胞凋亡，該基因在腫瘤中的作用是通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡而抑制腫瘤細(xì)胞增殖[15]。

本研究中，宮頸癌組織p16表達(dá)與HSG的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)?？赡茉?yàn)椋趯m頸癌發(fā)生發(fā)展過程中， p16可直接作用于細(xì)胞周期，腫瘤組織中p16的表達(dá)情況可作為宮頸癌惡性程度的指標(biāo)[16]。p16在宮頸組織中的表達(dá)特點(diǎn)提高了宮頸癌的早期診斷、預(yù)后判斷的準(zhǔn)確率,并且也為腫瘤的基因治療提供理論依據(jù)[17]。HSG則是一種潛在的抑癌基因，具有較強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)[18],能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,降低腫瘤細(xì)胞的浸潤能力。

綜上所述，宮頸癌組織中p16陽性表達(dá)率降低，HSG陽性表達(dá)率升高。p16、HSG的異常表達(dá)可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。p16、HSG可能作為宮頸癌診斷和預(yù)后判斷的參考指標(biāo)，提高對官頸癌診斷的靈敏度[19]和預(yù)后判斷的準(zhǔn)確率[20]。但p16、HSG在宮頸癌組織中相互作用的具體機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

[1] Li PT, Zhu SY, Wu XP, et al.Association of Polymorphisms inMitofusin-2 Gene with Type 2 Diabetes in Han Chinese[J] . Bio Med Res Inter, 2012，42(7)：1-7.

[2] 郭建華，伍亞云，劉俊宏.p53、p16和C-myc基因表達(dá)在宮頸癌早期診斷中的價值[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，22(23)：2518-2523．

[3] Ferlay J, Shin HR, Bray F, et al. Estimates of worldwisde burden of cancer in 2008:GLOBOCAN 2008 [J]. Inter Jour Cancer, 2010, 127(12): 2893-2917.

[4] 雷蕾，葉斌，王西川,等. P16基因、p53和Ki67在宮頸癌中的表達(dá)及其臨床意義 [J]. 實(shí)用醫(yī)院臨床雜志,2014,11(4):123-126.

[5] Wang Z，Liu Y，Liu J，et al．HSG /Mfn2 gene polymorphism and essential hypertension; a case-control association study inChinese[J]． J Atheroscler Thromb，2011，18(1) : 24-31．

[6] 劉爽，李亞里，劉愛軍，等 .P16( INK4A)及 Ki-67 在宮頸腺癌組織中的表達(dá)及意義[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2012,15(3)：225-228.

[7] Snijders PJ，Steenbergen RD，Heideman DA，et al． HPV media-ted cervical carcinogenesis: concepts and clinical implications[J]． J Pathol， 2006，208(2):152-164．

[8] Zhang GE， Jin HL， Lin XK,et al. Anti-Tumor Effects of Mfn2 in Gastric Cancer[J]. Mole Sci, 2013,14(7)：13005-13021

[9]Deng XJ，Wu HG. The expression and its clinical significance of Ki67 and PTEN in ovarian serous tumor[J]. Pract Jour Cancer， 2011，26(4):365-371．

[10] 董靜茹，李麗，潘龍.CEA、P16、Ki-67 在原發(fā)宮頸腺癌中的表達(dá)及意義[J]. 中國實(shí)用醫(yī)藥，2014，19(13)：50-51.

[11]徐秋霞，關(guān)紅瓊. P16基因INK4A、p14AR和Ki67在宮頸癌中的表達(dá)特點(diǎn)[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010,16(1)：17-19.

[12] 盧偉，雷春燕. P16和磷酸化蛋白激酶B在宮頸癌和宮頸病變組織中的表達(dá)[J]. 內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志,2010,4 (3):303-305.

[13] 陳悅，張曉薇，鄧志校，等．P16基因表達(dá)與宮頸癌預(yù)后相關(guān)性分析[J]．實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2014，30(15)：2417-2419．

[14] David M, Smalley G, Nicholas E，et al． Isolation and identification of potential urinary microparticle biomarkers of bladder cancer[J]． J Proteome Res， 2008，7(5):2089-2096.

[15] 章培,涂媛,李釩,等. REGγ 和P16基因 在乳腺癌中的表達(dá)及意義[J]. 四川醫(yī)學(xué)，2015,7(36):941-943.

[16] 郭周慶,陳光輝,吳又明，等. TCT結(jié)合DNA定量及Ki67 P16基因免疫組化聯(lián)合對宮頸癌及其癌前病早期篩查的應(yīng)用研究[J]. 國際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報，2015,21(2):180-183.

[17] 周莉，孔敏，李海霞，等. P16基因在宮頸癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J]. 中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué), 2013, 17(9): 1614-1616.

[18] 楊偉洪,鐘守軍,段立峰,等.P16基因、ER、CEA在宮頸腺癌和子宮內(nèi)膜癌別診斷中的臨床意義[J]. 中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2015,12(18): 36-38.

[19] 劉嶸，濮德敏，祝達(dá)，等. uPA、Ki67和VEGF在宮頸癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性研究[J].華中科技大學(xué)學(xué)報，2014,43(5)：516-519.

[20] 李昌紅，白云，車玲玉，等. 宮頸癌組織中HSG，Ki67表達(dá)觀察[J].山東醫(yī)藥， 2016,56(27)：82-84.

河北省衛(wèi)生計(jì)生委醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃(20170894)；華北理工大學(xué)2017年大學(xué)生創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(20170897);華北理工大學(xué)2017年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃立項(xiàng)項(xiàng)目(X2017189)。

白云(E-mail: 1063628881@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.19.015

R737.33

B

1002-266X(2017)19-0051-03

2016-11-17)