孫丹丹，吳玉鵬，楊軍，劉文，閆虹，王紅鵠

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，沈陽110001)

Toll樣受體-4基因啟動子區(qū)多態(tài)性與急性心肌梗死發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系

孫丹丹，吳玉鵬，楊軍，劉文，閆虹，王紅鵠

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，沈陽110001)

目的 探討Toll樣受體-4(TLR4)基因多態(tài)性與急性心肌梗死(AMI) 發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系。方法 選取AMI患者244例(AMI組)和非AMI患者284例(對照組)，采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)檢測兩組TLR4基因啟動子區(qū)多態(tài)性(rs10116253和rs10983755)，比較兩組TLR4啟動子區(qū)多態(tài)性的基因型分布差異，采用多因素Logistic 回歸模型分析TLR4基因啟動子區(qū)多態(tài)性與AMI發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系。結(jié)果 TLR4基因rs10116253、rs10983755均符合Hardy-Weiberg平衡。TLR4啟動子區(qū)rs10116253和rs10983755多態(tài)性與AMI的總體發(fā)病風(fēng)險無關(guān)(P均>0.05)。對于TLR4基因rs10116253多態(tài)位點，男性TC突變雜合型攜帶者AMI的發(fā)病風(fēng)險是TT野生純合型攜帶者的0.50倍， TC+CC突變型攜帶者AMI發(fā)病風(fēng)險是TT野生純合型攜帶者的0.51倍,伴有高血脂的TC雜合型攜帶者AMI發(fā)病風(fēng)險是TT野生純合型攜帶者的0.42倍，TC+CC突變型攜帶者AMI發(fā)病風(fēng)險是TT野生純合型攜帶者的0.46倍,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。TLR4基因rs10983755多態(tài)位點在性別、年齡、有無高血壓、有無糖尿病及有無血脂異常等分層分析中均未見統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)。結(jié)論 TLR4基因啟動子區(qū)rs10116253多態(tài)性與AMI分層發(fā)病風(fēng)險存在關(guān)系；rs10116253突變基因型可以降低男性人群、伴有高血脂人群AMI的發(fā)病風(fēng)險。

急性心肌梗死；Toll樣受體-4；基因多態(tài)性

目前認(rèn)為，急性心肌梗死(AMI)是遺傳因素及環(huán)境因素共同作用的復(fù)雜性疾病[1，2]。作為炎癥反應(yīng)的第一道屏障，Toll樣受體-4(TLR4)參與AMI的發(fā)生發(fā)展過程，與斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān)[3]。研究表明，TLR4基因多態(tài)性與糖尿病、缺血性腦血管病、頸動脈內(nèi)膜增厚等有關(guān)[4～6]。但是，TLR4基因啟動子區(qū)多態(tài)性與中國漢族人群AMI發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系尚未見報道。故本研究對TLR4基因啟動子區(qū)多態(tài)性與AMI發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系進行了探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科2013年9月～2015年9月收治的符合2002年AHA/ACC關(guān)于AMI診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者244例(AMI組)，男104例、女140例，年齡27～84(58.96±11.40)歲；吸煙112例(46.1%)，飲酒40例(16.5%)，高血壓156例(63.9%)，糖尿病83例(34.0%)，高血脂138例(56.6%)。選擇同期住院非AMI患者284例(對照組)，男122例、女162例，年齡19～87(57.93±11.11)歲；吸煙73例(25.3%)，飲酒40例(13.8%)，高血壓156例(54.9%)，糖尿病57例(20.1%)，高血脂112例(39.4%)。對照組冠狀動脈造影顯示冠狀動脈狹窄<50%，且對造影檢查知情同意。兩組均排除惡性腫瘤、自身免疫系統(tǒng)疾病、肝腎功能不全及近期急慢性感染性疾病。兩組比較，性別、年齡、飲酒情況無統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)，吸煙、糖尿病、高血脂情況有統(tǒng)計學(xué)差異(P均<0.05)。

1.2 TLR4基因啟動子區(qū)多態(tài)性檢測 ①TLR4啟動子區(qū)潛在功能性單核苷酸多態(tài)性(SNP)的選?。簭腍apMap數(shù)據(jù)庫(http://www.HapMap.org)下載TLR4啟動子區(qū)的基因型信息(Release27，PhaseⅠ+Ⅱ+Ⅲ)，利用Haploview4.0則進行SNP的篩選，篩選原則為: 中國人群、SNP位于-5 000～500 bp、最小等位基因型頻率≥5%、配對決定系數(shù)r2>0.8。對篩選出的SNP進一步進行功能預(yù)測，選取具有潛在與轉(zhuǎn)化因子結(jié)合能力的SNP，即rs10116253和rs10983755，進入隨后的分析研究。②基因組DNA提取：抽取兩組患者外周靜脈血5 mL裝于促凝試管內(nèi)，分離血清和凝血塊。酚氯仿法提取人全血基因組DNA。③TLR4基因分型：采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)進行TLR4基因rs10116253和rs10983755多態(tài)性分型檢測。正向引物序列分別為： 5′-TAAAAGCCAGGTAGAGGAGGG-3′，5′-TGACAGACCATCAAGAACACAGAAAAG-3′。反向引物序列分別為：5′-GAAAGAAGCAAGTGCAATGTAGT-3′，5′-GAAAGTAGCAAGTGCAATGTGTAA=3′。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：10×PCR Buffer 2.5 μL(含MgCl225 nmol/L)，50 μmol/L的dNTP 2 μL，0.2 μmol/L上下游引物各0.5 μL，2.5 U的Taq酶0.5 μL，模板DNA 0.5 μL，去離子水18 μL。PCR反應(yīng)條件: 94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物與限制性核酸內(nèi)切酶于37 ℃溫育過夜。全部酶切產(chǎn)物于3.0%瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)觀察分析電泳結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計數(shù)資料以頻率表示，組間比較采用χ2檢驗；TLR4啟動子區(qū)基因型與AMI發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系采用多因素Logistic 回歸模型分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TLR4基因啟動子區(qū)多態(tài)性分型 TLR4基因rs10116253、rs10983755均符合Hardy-Weiberg平衡。TLR4基因rs10116253野生純合型TT為兩個片段，分別為470 bp和131 bp；突變雜合型TC為三個片段，分別為601 bp、470 bp和131 bp；突變純合型CC為一個片段，601 bp。TLR4基因rs10983755野生純合型GG為兩個片段，分別為342 bp和121 bp；突變雜合型GA為三個片段，分別為463 bp、342 bp和121 bp；突變純合型AA為一個片段，463 bp。

2.2 兩組TLR4啟動子區(qū)多態(tài)性的基因型分布 兩組TLR4啟動子區(qū)rs10116253基因型、rs10983755基因型分布比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表 1 兩組TLR4啟動子區(qū)多態(tài)性基因型分布[例(%)]

2.3 TLR4基因啟動子區(qū)多態(tài)性與AMI總體發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系 對TLR4基因啟動子區(qū)rs10116253和rs10983755多態(tài)基因型與AMI總體發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系進行分析，顯示rs10116253和rs10983755多態(tài)性與AMI的總體發(fā)病風(fēng)險無關(guān)(P均>0.05)。見表2。

表2 TLR4基因啟動子區(qū)多態(tài)性與AMI總體發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系

注：調(diào)整年齡、性別、吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病、高血脂等非分組參數(shù)后。

2.4 TLR4基因啟動子多態(tài)性與AMI分層發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系 在性別分層中，對于TLR4基因rs10116253多態(tài)位點，男性TC突變雜合型攜帶者AMI的發(fā)病風(fēng)險是TT野生純合型攜帶者的0.50倍，男性TC+CC突變型攜帶者AMI發(fā)病風(fēng)險是TT野生純合型攜帶者的0.51倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。在有無高血脂分層中，對于TLR4基因rs10116253多態(tài)位點，伴有高血脂的TC雜合型攜帶者AMI發(fā)病風(fēng)險是TT野生純合型攜帶者的0.42倍，伴有高血脂的TC+CC突變型攜帶者AMI發(fā)病風(fēng)險是TT野生純合型攜帶者的0.46倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表3。但TLR4基因rs10983755多態(tài)位點在性別、年齡、有無高血壓、有無糖尿病及有無血脂異常等因素的分層分析中均未見統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)。見表4。

表3 TLR4基因啟動子區(qū)rs10116253多態(tài)性與AMI分層發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系

注：調(diào)整年齡、吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病等非分組參數(shù)后。

表4 TLR4基因啟動子區(qū)rs10983755多態(tài)性與AMI分層發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系

注：調(diào)整年齡、吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病等非分組參數(shù)后。

3 討論

TLR4是第1個被發(fā)現(xiàn)的哺乳動物Toll樣受體，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，參與天然免疫反應(yīng)，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁[7]。隨著分子生物學(xué)研究對TLR4與動脈粥樣硬化(AS)發(fā)生發(fā)展的密切關(guān)系逐漸揭示，TLR4基因多態(tài)性與AMI發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系也引起了越來越多學(xué)者的關(guān)注。研究表明，位于TLR4基因第三外顯子編碼區(qū)的rs4986790及rs4986791多態(tài)位點在高加索人群導(dǎo)致了Asp299Gly氨基酸的改變，引起TLR4信號通路受損，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)減弱，還可影響脂質(zhì)代謝和降低急性冠脈綜合征患者血漿中纖維蛋白原和可溶性VCAM-1的水平，減少急性冠脈綜合征的發(fā)生[8]。但TLR4 Asp299Gly多態(tài)性研究在不同人種間分布不均，在歐洲高加索人種多有報道，而在韓國、日本及中國等亞洲人群中對TLR4 Asp299Gly多態(tài)性的研究報道較少[9]。迄今為止，TLR4基因啟動子區(qū)多態(tài)性與中國漢族人群AMI發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系尚未見報道。

本研究表明，在中國人群中TLR4基因啟動子區(qū)rs10116253多態(tài)性與AMI的發(fā)病有關(guān)。其分子機制可能為以下幾點。首先，作為天然免疫的第一道屏障，TLR4不但能識別一些外源性配體，如革蘭陰性菌的脂多糖(LPS)、革蘭陽性菌的脂磷壁酸和衣原體的熱休克蛋白60(HSP60)[10]，還能識別一些內(nèi)源性配體，如HPS60、纖維連接蛋白正蛋白結(jié)構(gòu)域A片段、透明質(zhì)酸和輕度修飾的低密度脂蛋白，這些配體均被證實與AS的發(fā)生相關(guān)[11]。其次，TLR4能在AS形成細胞表面表達，不但介導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞等血管細胞的病變，還能活化樹突狀細胞、單核/巨噬細胞等免疫細胞產(chǎn)生的炎性因子，誘導(dǎo)AS的發(fā)生發(fā)展[12]。其中重要的一點是AMI的發(fā)生與局部斑塊的不穩(wěn)定性密切相關(guān)，而后者是炎癥反應(yīng)進展的結(jié)果。有研究表明，敲除TLR4的ApoE-/-小鼠模型斑塊體積明顯減少，斑塊中的脂質(zhì)和巨噬細胞浸潤均降低，促炎因子表達顯著下調(diào)，這使得斑塊穩(wěn)定且不易破裂[3]。已有研究證實，LPS通過TLR4介導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶9、蛋白水解酶表達[13]，兩者可降解細胞外基質(zhì)引發(fā)斑塊不穩(wěn)定。還有研究表明，細胞調(diào)亡亦可促進斑塊不穩(wěn)定發(fā)展。斑塊的破裂多發(fā)生在其肩部，平滑肌細胞的調(diào)亡可使斑塊肩部無法起到支撐作用，同時平滑肌細胞及基質(zhì)的減少導(dǎo)致纖維帽形成障礙，兩者均可促進斑塊不穩(wěn)定。已有報道TLR4信號途徑可誘導(dǎo)調(diào)亡分子表達，促進平滑肌細胞凋亡而引發(fā)斑塊不穩(wěn)定[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，TLR4基因啟動子區(qū)rs10116253突變基因型可以降低男性患者AMI的發(fā)病風(fēng)險。多數(shù)研究表明，由于雌激素對AS有保護作用，男性是罹患AMI的高發(fā)人群。但是，Rettew等研究表明，雌激素可以通過TLR4介導(dǎo)促炎反應(yīng)。雌激素可以上調(diào)巨噬細胞TLR4表達，并進一步促進炎癥因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)的分泌[15]。本研究還觀察到，TLR4基因啟動子區(qū)rs10116253多態(tài)位點突變基因型可以降低高血脂人群的AMI發(fā)病風(fēng)險。近年來越來越多的研究表明，TLR4的內(nèi)源性配體弱氧化修飾低密度脂蛋白(mmLDL)在AS的發(fā)病機制中發(fā)揮了重要作用。Choi等研究表明，mmLDL通過與TLR4結(jié)合誘導(dǎo)的巨噬細胞吞噬作用，最終導(dǎo)致脂質(zhì)在巨噬細胞中的積累[16]。首先，TLR4基因啟動子區(qū)rs10116253多態(tài)位點可能通過改變轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合能力導(dǎo)致TLR4的表達減少，進而影響減低AMI的發(fā)病風(fēng)險。其次，基于以上研究闡述的雌激素及mmLDL對TLR4的作用，TLR4啟動子區(qū)rs10116253多態(tài)位點更易于降低男性患者或伴有高血脂患者的AMI的發(fā)病風(fēng)險。

綜上所述，TLR4基因啟動子區(qū)rs10116253多態(tài)性與AMI發(fā)病風(fēng)險存在關(guān)聯(lián)，rs10116253突變基因型可以降低男性人群、伴有高血脂人群AMI的發(fā)病風(fēng)險，此為臨床AMI易發(fā)人群早期預(yù)警及個性化治療提供了理論依據(jù)。但是，本研究結(jié)果的客觀真實性仍需要通過對TLR4基因rs10116253多態(tài)位點功能的相關(guān)研究來進一步驗證。

[1] Riccioni G, Mancini B, DiIlio E, et al. Protective effect of lycoPene in Cardiovascular disease[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2008,12(3):183-190.

[2] He J, Gu D, Wu X, et al. Major causes of death among men and women in China[J]. N Engl J Med, 2005,353(11):1124-1134.

[3] Michelsen KS, Wong MH, Shah PK, et al. Lack of Toll-like receptor 4 or myeloid differentiation factor 88 reduces atherosclerosis and alters plaque phenotype in mice deficient in apolipoprotein E[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004,101(29):10679-10684.

[4] Peng D, Jiang F, Zhang R, et al. Association of Toll-like Receptor 4 Gene polymorphisms with susceptibility to type 2 diabetes mellitus in the Chinese population[J]. J Diabetes, 2015,7(4):485-492.

[5] Lin YC, Chang YM, Yu JM, et al. Toll-like receptor 4 gene C119A but not Asp299Gly polymorphism is associated with ischemic stroke among ethnic Chinese in Taiwan[J]. Atherosclerosis, 2005,180(2):305-309.

[6] Kiechl S, Lorenz E, Reindl M, et al. Toll-like receptor 4 polymorphisms and atherogenesis[J]. N Engl J Med, 2002,347(3):185-192.

[7] Chow JC, Young DW, Golenbock DT, et al. Toll-like receptor-4 mediates lipopolysaccharide-induced signal transduction[J]. J Biol Chem, 1999,274(16):10689-10692.

[8] Arbour NC, Lorenz E, Schutte BC, et al. TLR4 mutations are associated with endotoxin hyporesponsiveness in humans[J]. Nat Genet, 2000,25(2):187-191.

[9] Cheng PL, Eng HL, Chou MH, et al. Genetic polymorphisms of viral infection-associated Toll-like receptors in Chinese population[J]. Transl Res, 2007,150(5):311-318.

[10] Ohashi K, Burkart V, Flohe S, et al. Cutting edge: heat shock protein 60 is a putative endogenous ligand of the toll-like receptor-4 complex[J]. J Immunol, 2000,164(2):558-561.

[11] Gondokaryono SP, Ushio H, Niyonsaba F, et al. The extra domain A of fibronectin stimulates murine mast cells via toll-like receptor 4[J]. J Leukoc Biol, 2007,82(3):657-665.

[12] Yuen CY, Wong SL, Lau CW, et al. From skeleton to cytoskeleton: osteocalcin transforms vascular fibroblasts to myofibroblasts via angiotensin Ⅱ and Toll-like receptor 4[J]. Circ Res, 2012,111(3):e55-66.

[13] Castrillo A, Joseph SB, Vaidya SA, et al. Crosstalk between LXR and toll-like receptor signaling mediates bacterial and viral antagonism of cholesterol metabolism[J]. Mol Cell, 2003,12(4):805-816.

[14] den Dekker WK, Tempel D, Bot I, et al. Mast cells induce vascular smooth muscle cell apoptosis via a toll-like receptor 4 activation pathway[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2012,32(8):1960-1969.

[15] Rettew JA, Huet YM, Marriott I, et al. Estrogens augment cell surface TLR4 expression on murine macrophages and regulate sepsis susceptibility in vivo[J]. Endocrinology, 2009,150(8):3877-3884.

[16] Choi SH, Wiesner P, Almazan F, et al. Spleen tyrosine kinase regulates AP-1 dependent transcriptional response to minimally oxidized LDL[J]. PloS one, 2012,7(2):e32378.

Relationship of promoter polymorphisms of Toll-like receptor 4 with risk of acute myocardial infarction

SUNDandan,WUYupeng,YANGJun,LIUWen,YANHong,WANGHonghu

(TheFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China)

Objective To investigate the association between the promoter polymorphisms of Toll-like receptor 4 (TLR4) and the risk of acute myocardial infarction (AMI) in Northern Chinese Han population. Methods Two hundred and forty-four patients with AMI (AMI group) and 284 patients without AMI (control group) were enrolled in this study. Polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism was performed to detect the promoter polymorphisms of TLR4 (rs10116253 and rs10983755). The distributions of genotypes were evaluated by Chi-square (χ2) test. The association between each SNP and CAD risk was determined using multiple logistic regression analysis. Results The distributions of TLR4 rs10116253 and rs10983755 were in Hardy-Weinberg equilibrium. The TLR4 rs10116253 and rs10983755 polymorphisms were not associated with the total risk of AMI (allP>0.05). Compared with those carriers with wild TT genotype, male carriers with variant TC genotype had a 50% lower AMI risk. Compared with the male carriers with wild TT genotype, male carriers with variant genotype (TC+CC) had lower AMI risk by 0.51 fold. Compared with the hyperlipidemic patients with the wild TT genotype, the patients with the TC variant genotype had lower AMI risk by 0.42 fold. In comparison with the hyperlipidemic patients with wild TT genotype, the patients with variant genotype (TC+CC) had lower AMI risk by 0.46 fold. Significant difference was found between them (allP<0.05). However, TLR4 rs10983755 polymorphism showed no statistical significance in the stratification analysis including sex, age, with or without hypertension, with or without diabetes mellitus and with or without dyslipidemia (allP>0.05). Conclusion Our results reveal an association between the promoter polymorphism rs10116253 of TLR4 and AMI risk. The variant genotype of TLR4 rs10116253 can reduce the risk of AMI in male subjects or subjects with hyperlipidemia.

acute myocardial infarction; Toll-like receptor 4; gene polymorphisms

遼寧省自然科學(xué)基金計劃項目(2015020506)。

孫丹丹(1983-)，女，主治醫(yī)師，博士，研究方向為心血管超聲診斷及心血管疾病的基因多態(tài)性。E-mail：dan_101912@163.com

孫丹丹

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.17.006

R542.2

A

1002-266X(2017)17-0017-04

2016-12-08)