郭 媛，王洪善，周 康

(1.無(wú)錫市科學(xué)技術(shù)情報(bào)研究所，江蘇 無(wú)錫 214001：2.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

魔芋甘露寡糖對(duì)植物乳桿菌和糞腸球菌共培養(yǎng)時(shí)發(fā)酵行為的影響

郭 媛1，王洪善2，周 康2

(1.無(wú)錫市科學(xué)技術(shù)情報(bào)研究所，江蘇 無(wú)錫 214001：2.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

魔芋甘露寡糖是一種新型的功能低聚糖，具有益生元功能，然而它們對(duì)腸道微生物的選擇性尚不明確。本文選取具有代表性的腸道微生物植物乳酸菌及糞腸球菌，進(jìn)行體外純培養(yǎng)及共培養(yǎng)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，觀察不同碳源條件下微生物的生長(zhǎng)及代謝情況以及微生物之間的交互作用，探究寡糖對(duì)腸道微生物的作用機(jī)理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在以葡萄糖、果寡糖、甘露寡糖為碳源的腸道模擬培養(yǎng)基中，植物乳桿菌、糞腸球菌都能較好地生長(zhǎng)并產(chǎn)生一定的有機(jī)酸；共培養(yǎng)中，植物乳桿菌的生長(zhǎng)相對(duì)糞腸球菌占據(jù)更大的優(yōu)勢(shì)，但共培養(yǎng)的代謝物組分存在顯著差異；甘露寡糖顯示出對(duì)上述幾株腸道益生菌具有更為明顯的促生長(zhǎng)作用。

魔芋甘露寡糖；益生菌；益生元；微生物交互作用

功能性寡糖是被動(dòng)物攝入后不被口腔、胃、小腸消化吸收，但能在腸道后端發(fā)揮作用的一類寡糖。目前，已知的有1 000多種功能性寡糖，應(yīng)用比較廣泛的主要有甘露寡糖、果寡糖、大豆寡糖、半乳寡糖以及木寡糖等[1-2]。大量體外培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)功能性寡糖能促進(jìn)腸道有益菌，尤其是乳桿菌的增殖。由于人體食用功能性寡糖后，本身不能對(duì)其消化分解，而乳桿菌等有益菌含有分解這些低聚糖的酶進(jìn)而利用這些糖類進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果產(chǎn)生的短鏈脂肪酸(SCFA)能使腸道pH降低，從而抑制對(duì)酸敏感的沙門氏菌等有害菌的生長(zhǎng)[3]。此外，益生菌等對(duì)病原菌生物具有屏障作用，通過(guò)其磷壁酸與腸粘膜上皮細(xì)胞結(jié)合，占據(jù)腸粘膜表面形成生物學(xué)屏障，阻止致病菌，調(diào)節(jié)致病菌的入侵和定植[4]。

甘露寡糖(Mannan-oligosaccharide，MOS)是由2～10個(gè)甘露糖與葡萄糖或者半乳糖殘基通過(guò)α-1，6、α-1，3、α-1，2、β-1，4或β-1，3糖苷鍵鏈接而成的低聚糖[5]。甘露寡糖大量來(lái)源于葡甘聚糖或半乳甘露聚糖，這些聚糖廣泛存在野生植物資源中，是甘露聚糖類植物資源精加工的重要方向。魔芋甘露寡糖(Konjakmannan-oligosaccharide)是通過(guò)化學(xué)或生物方法將魔芋葡甘聚糖降解得到的一種低分子糖。魔芋葡甘聚糖是β-葡萄糖與β-甘露糖通過(guò)β-1，4糖苷鍵鏈接而成的多糖[6]。目前酶解法是大量獲得MOS的最有效手段[7]。眾多研究表明，MOS具有多種生理活性，主要是調(diào)節(jié)腸道菌群微生態(tài)、改善腸道微環(huán)境進(jìn)而促進(jìn)宿主的健康、增強(qiáng)免疫活性、改善血糖血脂水平等[8-10]，越來(lái)越多地受到人們的關(guān)注與認(rèn)同。然而目前MOS對(duì)腸道微生物的具體影響，以及產(chǎn)生的微生物之間的相互作用類型以及機(jī)制尚不完全明確。因此亟待解析這方面的信息以理解MOS的益生機(jī)制。同時(shí)，MOS對(duì)于腸道菌群是選擇性的碳源，由此得到的發(fā)酵代謝物又可以對(duì)腸道微生物群落造成影響。因此，以MOS為外界刺激因素，探索及闡明益生元對(duì)典型腸道微生物發(fā)酵行為的影響可為該產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)提供依據(jù)。

本文選取具有代表性的腸道微生物植物乳酸菌及糞腸球菌，進(jìn)行體外純培養(yǎng)及共培養(yǎng)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，觀察不同碳源條件下微生物的生長(zhǎng)及代謝情況以及微生物之間的交互作用，探究寡糖對(duì)腸道微生物的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

種子培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10，牛肉膏 10，酵母粉 5，葡萄糖 20，乙酸鈉 5，檸檬酸氫二胺 2，磷酸氫二鉀 2，七水合硫酸鎂 0.58，一水合硫酸錳 0.19，吐溫80 1。pH至6.2，滅菌時(shí)溫度為121 ℃，時(shí)長(zhǎng)為20 min。

模擬腸道培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖(魔芋甘露寡糖或果聚糖)8，胰蛋白胨 3，酵母粉 4.5，膽鹽3號(hào) 0.4，L-半胱氨酸鹽酸鹽 0.8，氯化鈉4.5，氯化血紅素 0.05，六水氯化鎂 0.45，六水氯化鈣 0.2，磷酸氫二鉀 0.4，吐溫80 1。所有試劑均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。本研究涉及的植物乳桿菌和糞腸球菌均為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種；魔芋甘露寡糖來(lái)自成都永安緣河有限公司，果聚糖購(gòu)自美國(guó)Amresco公司。

1.2 培養(yǎng)條件

植物乳桿菌37 ℃活化18 h，糞腸球菌37 ℃活化24 h后分別進(jìn)行植物乳桿菌純培養(yǎng)及植物乳桿菌+糞腸球菌共培養(yǎng)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。純培養(yǎng)及共培養(yǎng)菌種接種量均為1%，發(fā)酵體系50 mL，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)發(fā)酵48 h。每12 h取樣。

1.3 pH以及OD檢測(cè)

發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液的pH和OD值分別采用pH計(jì)和Molecular Devices測(cè)定，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3次測(cè)量的平均值。

1.4 TLC分析

TLC步驟如下：取硅膠薄板一塊，在距底邊1.0 cm處劃一條直線，在直線上每隔1.5～2.0 cm作一記號(hào)，分別吸取梯度乙醇沉淀得到的MOS上清液及沉淀復(fù)溶液點(diǎn)樣，控制點(diǎn)樣斑點(diǎn)直徑不超過(guò)2 mm。將薄板點(diǎn)樣一端放入盛有展開溶劑已進(jìn)行預(yù)飽和的層析缸中，展開劑液面不得超過(guò)點(diǎn)樣線，層析缸密閉，待展開完全后取出薄板吹干，將顯色劑均勻噴霧在薄板上，85 ℃顯色10 min，拍照保存。展開劑按照V(正丁醇)∶V(乙酸)∶V(水)=2∶2∶1的比例配置展開劑400 mL。

苯胺-二苯胺磷酸顯色劑的配制：準(zhǔn)確稱取二苯胺4 g，與4 mL苯胺與20 mL 85%磷酸共溶于200 mL丙酮中，避光保存于棕色瓶中備用。

1.5 培養(yǎng)物有機(jī)酸分析

將培養(yǎng)液離心(12 000 r/min，5 min)獲得上清液。準(zhǔn)確量取 2 mL 發(fā)酵上清液，分別加入 800 μL硫酸鋅(300 g/L)和 800 μL亞鐵氰化鉀(106 g/L)，振蕩混勻，離心，取上清液用 0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾后過(guò) Sep-Pak C18預(yù)處理小柱除色素，為待測(cè)樣品。取 1 mL 各單標(biāo)及混標(biāo)樣品過(guò) 0.22 μm 微孔濾膜，為待測(cè)標(biāo)樣。處理后的各樣品使用HPLC進(jìn)行有機(jī)酸分析。色譜柱：Waters Atlantis T3，4.6 mm×250 mm，5 μm；流動(dòng)相：20 mmol/L磷酸二氫鈉，用磷酸調(diào) pH2.7；進(jìn)樣體積：10 μL；流速：0.7 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：UV210 nm。分別在進(jìn)樣之前及測(cè)定之后用純甲醇及5%甲醇平衡色譜柱。標(biāo)樣峰面積/樣品峰面積=標(biāo)樣有機(jī)酸含量/樣品有機(jī)酸含量，對(duì)樣品中各有機(jī)酸進(jìn)行絕對(duì)定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的發(fā)酵

首先通過(guò)腸道模擬培養(yǎng)基以及厭氧條件的培養(yǎng)，考察葡萄糖、果寡糖以及甘露寡糖為碳源的情況下，植物乳桿菌、糞腸球菌以及他們的共培養(yǎng)物的生長(zhǎng)及培養(yǎng)物pH變化情況。結(jié)果如圖1、圖2所示。

圖1 不同寡糖為碳源的情況下，植物乳桿菌、糞腸球菌純培養(yǎng)及共培養(yǎng)過(guò)程中pH變化情況

圖2 不同寡糖為碳源的情況下，植物乳桿菌、糞腸球菌純培養(yǎng)及共培養(yǎng)過(guò)程中OD變化情況

糞腸球菌的生長(zhǎng)情況較好，但是pH降低幅度較小。糞腸球菌與植物乳桿菌共培養(yǎng)時(shí)，菌體生長(zhǎng)以及pH降低的情況都與植物乳桿菌純培養(yǎng)物較相似。其中以葡萄糖為底物的情況下，糞腸球菌和植物乳桿菌的生長(zhǎng)情況最好，但是共培養(yǎng)物的生長(zhǎng)情況較每株菌的純培養(yǎng)物相對(duì)較差。由pH降低可知，植物乳桿菌的pH下降程度要大于糞腸球菌。在果寡糖為底物的情況下，腸球菌的pH降低幅度與共培養(yǎng)物相比，差異較大。由OD值升高而后保持不變可推測(cè)，兩種菌都可以利用上述三種碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，隨著碳源的消耗，都各自達(dá)到了生長(zhǎng)的穩(wěn)定期，但實(shí)驗(yàn)所研究的兩種菌利用寡糖的能力不同，即不同寡糖對(duì)不同菌的生長(zhǎng)促進(jìn)作用不同。其中葡萄糖對(duì)三種菌的增殖效果最顯著，但腸道環(huán)境中幾乎沒(méi)有葡萄糖，因此，本研究中，僅使用葡萄糖碳源作為對(duì)照。本研究結(jié)果顯示，甘露寡糖對(duì)糞腸球菌的增殖效果最顯著，而植物乳桿菌在考察的幾種寡糖中，并沒(méi)有體現(xiàn)顯著的偏好。

2.2 不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵上清液中甘露寡糖的TLC分析

由圖3可見(jiàn)，小分子量的甘露寡糖在純培養(yǎng)和共培養(yǎng)的情況下均優(yōu)先被利用，大分子量的寡糖未有明顯利用情況。在TLC結(jié)果中，下層分子量較大的糖無(wú)明顯衰減趨勢(shì)，上層分子量較小的糖衰減趨勢(shì)較明顯，可推測(cè)，兩種菌更容易利用寡糖中相對(duì)分子量較小的，分子量較大的糖利用率相對(duì)較低。

圖3 以甘露寡糖為底物，不同發(fā)酵時(shí)間的

2.3 發(fā)酵液中有機(jī)酸分析

在檢測(cè)到的幾種有機(jī)酸中，發(fā)酵結(jié)束時(shí)酒石酸、丙酮酸和乳酸含量相對(duì)于開始時(shí)有增加，說(shuō)明發(fā)酵過(guò)程會(huì)產(chǎn)生酒石酸、丙酮酸及乳酸。除以葡萄糖為碳源，發(fā)酵結(jié)束時(shí)琥珀酸有增加，以甘露寡糖及果聚糖為碳源琥珀酸并沒(méi)有明顯增加。在以甘露寡糖和果聚糖為碳源的情況下，與植物乳桿菌純培養(yǎng)物相比，植物乳桿菌和糞腸球菌的共培養(yǎng)物的酒石酸、丙酮酸和積累量都有顯著提升；同樣地，琥珀酸積累量變化不大甚至還略有降低。

表1 不同寡糖為碳源的情況下，植物乳桿菌、糞腸球菌純培養(yǎng)及共培養(yǎng)物中有機(jī)酸分析

3 討 論

從微生物交互作用角度，通過(guò)對(duì)植物乳桿菌與糞腸球菌的共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析認(rèn)為：在植物乳桿菌與糞腸球菌的共培養(yǎng)中，植物乳桿菌是優(yōu)勢(shì)微生物，其與糞腸球菌可能存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。具體可能存在的原因如下：1)植物乳桿菌對(duì)甘露寡糖等的利用能力更強(qiáng)，體現(xiàn)生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)；2)植物乳桿菌在發(fā)酵過(guò)程中，產(chǎn)生抑制其他微生物生長(zhǎng)的代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致其他微生物生長(zhǎng)較弱。通過(guò)比較植物乳桿菌和糞腸球菌的純培養(yǎng)和共培養(yǎng)體系發(fā)現(xiàn)，雖然純培養(yǎng)時(shí)，糞腸球菌比植物乳桿菌生長(zhǎng)情況好，但是二者共培養(yǎng)時(shí)，與植物乳桿菌純培養(yǎng)生長(zhǎng)趨勢(shì)較一致，糞腸球菌未能體現(xiàn)其生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，分析認(rèn)為，上述兩種原因中后者在植物乳桿菌與糞腸球菌共培養(yǎng)時(shí)體現(xiàn)較為顯著。

由有機(jī)酸結(jié)果分析，植物乳桿菌與糞腸球菌的共培養(yǎng)相對(duì)植物乳桿菌的純培養(yǎng)而言，酒石酸和琥珀酸的含量降低，而丙酮酸及乳酸的含量升高；另外不同的寡糖對(duì)他們的發(fā)酵行為也存在影響，例如以葡萄糖為碳源時(shí)，植物乳桿菌與糞腸球菌的共培養(yǎng)相對(duì)植物乳桿菌的純培養(yǎng)而言，酒石酸含量升高，而以甘露寡糖為碳源時(shí)其含量為下降結(jié)果。說(shuō)明純培養(yǎng)與共培養(yǎng)之間存在差別，并且植物乳桿菌的代謝產(chǎn)物被其他微生物作為前體物質(zhì)利用，進(jìn)一步參與細(xì)胞代謝，導(dǎo)致部分代謝產(chǎn)物在共培養(yǎng)時(shí)積累量下降。

本研究對(duì)2株腸道微生物進(jìn)行了純培養(yǎng)和共培養(yǎng)的發(fā)酵行為分析，同時(shí)比較了碳源對(duì)這些微生物之間交互作用的程度的影響。甘露寡糖對(duì)益生菌存在一定的增殖作用，另外也發(fā)現(xiàn)糞腸球菌與植物乳桿菌共培養(yǎng)時(shí)，植物乳桿菌為優(yōu)勢(shì)微生物，但有機(jī)酸等代謝物的積累情況顯著區(qū)別于植物乳桿菌純培養(yǎng)物。這些信息為益生元、益生菌以及合生元的選擇及配伍提供了基礎(chǔ)信息。

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Effect of Konjacmannan Oligosaccharides on the Co-culture ofLactobacillusplantarumandEnterococcusfaecalis

Guo Yuan1，Wang Hongshan2，Zhou Kang2

(1.Wuxi Institute of Scientific and Technical Information，Wuxi 214001，China; 2.School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

Konjacmannan oligosaccharidesare is considered as a new type of prebiotic，with many physiological functions，such as adjusting the structure of intestinal flora，anting inflammatory，improving body immunity，promoting animal growth.Mannan oligosaccharide(MOS)has positive effects on gut microbiota，but its selectivity towards microorganism is still unclear.In this study，we used representative intestinal microbial strains，LactobacillusplantarumandEnterococcusfaecalisto culture with mannan oligosaccharides as carbon resource，and fructooligosaccharide(FOS)and glucose were applied as controls.Invitromonoculture and co-culture fermentation experiments were carried out to monitor the growth and metabolism of microorganisms.The interactions between microorganisms under different carbon sources was also studied.The results showed that bothLactobacillusplantarumandEnterococcusfaecaliscan utilize glucose，F(xiàn)OS and mannan oligosaccharide to grow.Lactobacillusplantarumis the dominant strain in the co-culture withEnterococcus.However，the metabolites varied a lot in the co-culture compared with monoculture ofLactobacillusplantarum.

Konjacmanno oligosaccharides;probiotics;prebiotics;microbial interaction

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.02.004

2016-08-28

郭媛(1980—)，女，工程師，碩士。研究領(lǐng)域：微生物與生化藥學(xué)。E-mail：guoyuanwx@163.com

Q53

A

1006-9690(2017)02-0013-04