吳 帆，柳新紅，蔣冬月，李因剛，楊少宗，劉華紅，倪 穗

(1.寧波大學(xué)，應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315211；2.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023；3.杭州市園林綠化股份有限公司，浙江 杭州 310020)

典型櫻亞屬植物基因組DNA改良提取方法研究

吳 帆1，2，柳新紅2，蔣冬月2，李因剛2，楊少宗2，劉華紅3，倪 穗1*

(1.寧波大學(xué)，應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315211；2.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023；3.杭州市園林綠化股份有限公司，浙江 杭州 310020)

本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)的CTAB法及試劑盒法的基礎(chǔ)上，利用DNA提取緩沖液作為樣品預(yù)處理液，配合其他操作步驟的優(yōu)化，設(shè)計(jì)出針對(duì)櫻亞屬植物基因組DNA的新型提取方法，并對(duì)提取的DNA進(jìn)行ISSR-PCR分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)以檢驗(yàn)其質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，改進(jìn)后的CTAB法及試劑盒法均能有效地去除樣品中含有的多糖、色素、黃酮等雜質(zhì)，而試劑盒法提取的DNA純度和質(zhì)量總體而言高于CTAB法。ISSR-PCR結(jié)果顯示，兩條引物對(duì)樣品DNA均能進(jìn)行有效擴(kuò)增，并且擴(kuò)增條帶清晰，無(wú)明顯降解。改良后的兩種方法能高效高質(zhì)量地提取櫻亞屬植物DNA，并且具有較高的通用性，可以運(yùn)用于其他物種DNA的提取工作中。

典型櫻亞屬;DNA提取;CTAB;試劑盒

典型櫻亞屬(Subg.Cerasus)隸屬于薔薇科(Rosaceae)櫻屬(Cerasus)，為多年生落葉喬木或灌木。該亞屬植物在北半球溫和地帶，包括亞洲、歐洲、北美洲等均有分布記錄。亞屬中主要原生種分布于亞洲，集中在日本、朝鮮及我國(guó)西部和西南部地區(qū)，包括福建、浙江、云南、四川等省份[1-2]。我國(guó)產(chǎn)48種，包括迎春櫻(Cerasusdiscoidea)、山櫻花(Cerasusserrulata)、尾葉櫻(Cerasusdielsiana)、華中櫻(Cerasusconradinae)等常見(jiàn)種及天山櫻(Cerasustianshanica)、鶴峰櫻(Cerasushefenensis)等地區(qū)特有種[3-4]。該亞屬的植物多生長(zhǎng)于向陽(yáng)山坡、山頂或林緣地帶的陽(yáng)面，種類分布受海拔及坡向影響較大。

前人研究發(fā)現(xiàn)，櫻亞屬植物葉片中含有大量次生代謝產(chǎn)物，如多糖[5]、黃酮[6]、單寧和色素[7]等。分子生物學(xué)家將諸如櫻亞屬類具有大量次生代謝產(chǎn)物的植物稱為頑拗植物(recalcitrant plant)[8]，若對(duì)這些植物采用傳統(tǒng)的DNA提取手段，會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)的大量殘留，不僅影響DNA的提取質(zhì)量，還會(huì)影響后續(xù)基于DNA片段的相關(guān)研究，這會(huì)給櫻亞屬植物分子生物學(xué)研究帶來(lái)障礙，限制其進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用。目前，針對(duì)櫻亞屬植物基因組DNA提取的報(bào)道較少，且提取的DNA質(zhì)量較低，不能滿足后續(xù)分子實(shí)驗(yàn)的需求。本研究在傳統(tǒng)的CTAB法及試劑盒法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良優(yōu)化，以改良后的方法提取典型櫻亞屬植物基因組DNA，并對(duì)其進(jìn)行產(chǎn)量、純度測(cè)定、ISSR-PCR分子標(biāo)記分析，驗(yàn)證提取方法的質(zhì)量。旨在為提取高質(zhì)量的櫻亞屬植物DNA提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料均來(lái)自于浙江省內(nèi)14個(gè)縣(市、區(qū))(表1)，現(xiàn)場(chǎng)采集新鮮完整的葉片放入變色硅膠中干燥保存，后存放于-20 ℃冰柜中備用。

表1 供試材料及采集地

1.2 DNA提取方法

1.2.1 提取緩沖液制備

為有效地去除樣品葉片中的次生代謝產(chǎn)物，結(jié)合DNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)提取緩沖液對(duì)樣品葉片進(jìn)行預(yù)處理，去除大量雜質(zhì)后再進(jìn)行后續(xù)提取實(shí)驗(yàn)會(huì)極大地提高提取效率。緩沖液(100 mL)具體配方如下：在50 mL蒸餾水中加入1.461 g NaCl，另取15mL蒸餾水加入2.4 g Tris堿，完全溶解后利用HCl調(diào)節(jié)pH至8.0，后轉(zhuǎn)移到50 mL水中；另取15 mL蒸餾水，先加入少許NaOH使溶液呈堿性，后加入1.8 g EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸)，再利用NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0，后轉(zhuǎn)入上述混合液中。取2 g PVP(Polyvinyl pyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮)加入混合液中，待完全溶解后加入1 ml β-巰基乙醇，蒸餾水定容至100 ml，混勻后冰箱4℃保存，備用。

1.2.2 改良CTAB法提取DNA

取干燥后的樣品葉片于預(yù)冷的研缽中，加入少量PVP粉末，液氮迅速研磨至樣品徹底成為粉末，后迅速轉(zhuǎn)移至2 mL預(yù)冷離心管中。加入1.5 mL預(yù)冷的緩沖液，混合均勻后冰浴器上靜置20 min。4 ℃下3 000 r/min離心5 min，棄上清液和膠狀粘稠物質(zhì)及壁上殘留。若上清液顏色較深則重復(fù)抽提1次。在沉淀中加入700 μL 65℃預(yù)熱的CTAB緩沖液、14 μL β-巰基乙醇，65 ℃水浴40 min。期間輕搖離心管數(shù)次，后4 ℃10 000 r/min離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移至新的2 mL預(yù)冷滅菌離心管內(nèi)，加入等體積的氯仿-異戊醇，輕輕上下顛倒2 min，靜置5 min后4 ℃10 000 r/min離心10 min。后重復(fù)此步驟1次。取上清液于新的2 mL預(yù)冷滅菌離心管內(nèi)，加入2.5倍體積的-20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇。上下輕輕顛倒至完全混合均勻后-20 ℃冷凍過(guò)夜。后4 ℃10 000 r/min離心10 min，1 mL-20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇洗滌沉淀1次，再4 ℃ 10 000 r/min離心10 min。加入60 μL EB緩沖液將固體溶解，后加入4 μL 碧云天生物公司生產(chǎn)的RNA酶，金屬浴加熱器中37 ℃存放1.5 h，取出后-40 ℃冷凍備用。

1.2.3 改良試劑盒法提取DNA

稱取約30 mg干燥葉片樣品于2 mL離心管內(nèi)，加入2粒球形鋼珠，放于液氮中使其與液氮充分接觸，約5 min后取出放于水平震蕩儀上，30 Hz震蕩90 s，間隔2 min后相同頻率再震蕩90 s，使樣品被充分粉碎。加入750 μL預(yù)冷的核分離液，后續(xù)預(yù)處理過(guò)程同CTAB法。后參照北京BioTeKe生物公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取樣品中的DNA。

1.3 ISSR-PCR反應(yīng)

為驗(yàn)證改良DNA提取方法的效果，選擇兩條由美國(guó)哥倫比亞大學(xué)研制開(kāi)發(fā)的ISSR-PCR引物，分別為UBC813(CTCTCTCTCTCTCTCTT)和UBC836(AGAGAGAGAGAGAGAGA)，對(duì)提取的樣品基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，確立為20 μL。其中2×TSINGKE PCR Master(blue)預(yù)混體系10 μL，ISSR引物0.6 μL，DNA模板1μL，ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；然后94℃ 30s，適當(dāng)退火溫度(UBC813為49.8 ℃；UBC836為50.3 ℃)30 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min，16 ℃保存。將擴(kuò)增后的產(chǎn)物點(diǎn)樣于1.5%瓊脂糖凝膠中，150 V電泳30 min檢驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 電泳檢測(cè)結(jié)果

利用改良后的CTAB法及試劑盒法對(duì)不同種典型櫻亞屬植物基因組DNA進(jìn)行提取(圖1)。

A.改良試劑盒提??；B.改良CTAB法提取

結(jié)果表明，部分樣品如B-7，由于DNA含量過(guò)高，產(chǎn)生帶出現(xiàn)象；部分樣品如A-6、B-5，DNA存在降解彌散現(xiàn)象；少部分樣品如B-2、B-4，條帶亮度不高，對(duì)應(yīng)含量偏低?？傮w而言改良后的兩種方法對(duì)DNA的提取效率明顯提高，幾乎沒(méi)有雜質(zhì)影響。此外，從圖1中可以看出，A-8與B-8號(hào)樣品的得率均不高，可見(jiàn)DNA的提取效率也受到樣品種類影響。

2.2 紫外檢測(cè)結(jié)果

從表2中可以看出，兩種方法提取DNA的OD260與OD280比值在1.6～1.9之間，總體來(lái)說(shuō)提取純度較高，蛋白質(zhì)、RNA等雜質(zhì)污染較少；兩種方法中，改良的試劑盒法提取的DNA的OD260/OD280相對(duì)更穩(wěn)定，總體來(lái)說(shuō)DNA濃度高于傳統(tǒng)的CTAB法。DNA濃度最高的是改良的CTAB法提取的毛葉山櫻花樣本(B-7)，最低為改良的CTAB法提取的浙閩櫻樣本(B-4)，由此可見(jiàn)DNA提取效率受到樣品本身影響較大，不同種櫻亞屬植物提取濃度存在明顯差異。

表2 不同方法提取樣品DNA吸光度及濃度

注：A為改良的試劑盒提取；B為改良的CATB法提取。

A.引物UBC813;B.引物UBC836

2.3 ISSR分子標(biāo)記結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩條ISSR引物對(duì)所有DNA樣本擴(kuò)增的條帶大小約在250bp～2000bp左右，不同DNA樣本之間多態(tài)性差異較大，不同ISSR引物之間擴(kuò)增的多態(tài)性也存在較大差異。圖中所有條帶均沒(méi)有出現(xiàn)明顯的拖尾或降解現(xiàn)象，且條帶較亮，說(shuō)明模板DNA鏈本身具有較高的完整度。

3 討 論

3.1 緩沖液對(duì)DNA提取效率分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在正式開(kāi)始提取實(shí)驗(yàn)之前加入緩沖液進(jìn)行預(yù)處理，可以極大程度地提高提取效率。緩沖液的成分，包括Tris堿、EDTA、 PVP、β-巰基乙醇等，均為后續(xù)提取實(shí)驗(yàn)中會(huì)用到的試劑。所以不必考慮緩沖液會(huì)對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成試劑污染。緩沖液中的各種成分的配比有利于多糖、色素、單寧、黃酮等雜質(zhì)的溶解，離心后便可去除；若雜質(zhì)過(guò)多，會(huì)使緩沖液極度粘稠，此時(shí)可以適當(dāng)增加緩沖液洗滌次數(shù)，以確保雜質(zhì)的去除效率。此外，由于緩沖液中的鹽濃度不高，故緩沖液本身不會(huì)大量溶解DNA，即不會(huì)降低DNA的含量。

值得注意的是緩沖液中含有β-巰基乙醇，此藥物是在緩沖液處理樣品時(shí)的抗氧化劑[9]，在高溫下會(huì)揮發(fā)和分解[10]，故在配置過(guò)程中最好在最后一步再加入；配置好的緩沖液應(yīng)當(dāng)放置于4℃冰箱中保存，且整個(gè)處理過(guò)程最好在低溫環(huán)境下進(jìn)行。此外，緩沖液中的PVP可以增加溶液中其他藥品的親水性，使其余藥品能更好地溶解[11]。但實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，其本身與水結(jié)合后會(huì)形成膠體狀物質(zhì)，故可以利用加熱型磁力攪拌器加速PVP本身的溶解。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)在去除緩沖液的時(shí)候離心轉(zhuǎn)速和旋轉(zhuǎn)時(shí)間也是一個(gè)非常重要的參數(shù)。若轉(zhuǎn)速和時(shí)間過(guò)高雖然可以有效地分離緩沖液和固體樣品，但是會(huì)導(dǎo)致樣品擠壓過(guò)實(shí)，從而影響后續(xù)提取試劑對(duì)樣品的處理；若轉(zhuǎn)速和時(shí)間過(guò)低又無(wú)法將固液完全分離。馬輝[12]等在對(duì)白術(shù)DNA提取過(guò)程中，將此步驟的轉(zhuǎn)速設(shè)定在4 000 r/min，時(shí)間為5 min；而筆者在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，也可以達(dá)到和上述條件一樣的效果。為節(jié)省時(shí)間提高工作效率，故將實(shí)驗(yàn)條件定為3 000 r/min離心5 min。

3.2 改良后兩種提取法的比較分析

由上述圖表可以看出，改良后的兩種提取方法對(duì)DNA均有較高的提取效率。相比較而言，在DNA提取的質(zhì)量方面，兩種方法相差不大；在濃度方面，利用試劑盒法提取得到的DNA濃度總體而言高于CTAB法。這有可能是因?yàn)槭褂玫腃TAB緩沖液中含有β-巰基乙醇，而操作步驟中對(duì)的加熱過(guò)程導(dǎo)致β-巰基乙醇的揮發(fā)或者降解，從而導(dǎo)致DNA在提取時(shí)的抗氧化劑失效，從一定程度上降低了DNA的提取效率。在實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間方面，試劑盒法明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的CTAB法。利用試劑盒提取DNA，從緩沖液預(yù)處理算起，一般耗時(shí)1.5 h；而CTAB法需要超過(guò)6 h。從實(shí)驗(yàn)要求的操作熟練程度而言，CTAB法步驟更為繁復(fù)，在細(xì)節(jié)方面要求更多，故對(duì)實(shí)驗(yàn)員的熟練程度要求更高；而試劑盒由于已經(jīng)是規(guī)范化生產(chǎn)，配合離心柱，按照說(shuō)明書(shū)要求一步步操作即可，故對(duì)實(shí)驗(yàn)員的技術(shù)要求沒(méi)有CTAB高。且CTAB法在操作過(guò)程中需要運(yùn)用到氯仿異戊醇等有毒試劑，雖然其成本比試劑盒要低一些，但總體而言還是試劑盒法更為高效和安全。

3.3 其他操作步驟改進(jìn)

在CTAB法提取實(shí)驗(yàn)步驟中與試劑盒法不同，由于樣品研磨是在空氣中直接進(jìn)行，為防止在研磨過(guò)程中空氣對(duì)DNA的氧化，故在研缽中提前放入少量PVP粉末，以確保此步驟不會(huì)造成DNA被氧化。此外，由于不同物種葉片硬度不一樣，有些樣品在研磨時(shí)需要加入少量石英砂以確保能充分被研磨[13-14]，但由于櫻亞屬植物葉片多為紙質(zhì)，利用硅膠干燥后已經(jīng)可以直接進(jìn)行研磨，故在此實(shí)驗(yàn)中未添加石英砂。在DNA析釋過(guò)程中，前人有使用異丙醇作為DNA的析釋劑[15]。雖然異丙醇可以將DNA從溶液中析釋出來(lái)，但是同時(shí)也會(huì)將殘留的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)同時(shí)析出，造成二次污染；且異丙醇本身具有一定毒性，會(huì)對(duì)身體產(chǎn)生危害。故本實(shí)驗(yàn)利用事先冷凍的冰乙醇代替異丙醇，大大降低了毒性同時(shí)不會(huì)影響DNA的析釋效率。在最后DNA溶解劑的選擇方面，前人使用TE緩沖液[16]或純凈水[17]對(duì)DNA進(jìn)行溶解。在本實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)兩種提取方法得到的DNA，筆者均使用試劑盒中原裝的EB緩沖液進(jìn)行溶解。原本三種試劑對(duì)DNA的溶解力相差不大，為方便實(shí)驗(yàn)步驟，故直接選用EB緩沖液。此外，盡管在實(shí)驗(yàn)步驟上進(jìn)行諸多改進(jìn)，但實(shí)驗(yàn)樣品本身的新鮮程度也是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要因素。一般來(lái)說(shuō)，在采樣時(shí)盡量選擇無(wú)破損、蟲(chóng)蛀、枯萎發(fā)黃的新鮮葉片或嫩芽[18]，會(huì)對(duì)DNA的提取效率有顯著提高。

[1] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志：第37卷 薔薇科[M].北京：科學(xué)出版社，1990.

[2] 浙江植物志編輯委員會(huì).浙江植物志：1992-1993版 1～7卷合訂[M].杭州：：浙江科學(xué)技術(shù)出版社，1992.

[3] 王鋮.漫淡我國(guó)櫻花現(xiàn)狀與應(yīng)用[J].園林，2010(3)：14-16.

[4] 王賢榮.中國(guó)櫻花品種圖志[M].北京：科學(xué)出版社，2014.

[5] 李友偉，溫東東.櫻花多糖提取工藝的優(yōu)化及抗氧化性研究[J].中國(guó)藥事，2015(1)：58-62.

[6] 衛(wèi)強(qiáng)，紀(jì)小影.聚酰胺-大孔樹(shù)脂聯(lián)用純化櫻花葉總黃酮及其抗炎活性[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2015，35(13)：1204-1209.

[7] 趙峰，羅家剛，張澤俊.櫻花色素的提取[J].昭通學(xué)院學(xué)報(bào)，2014(5)：36-37.

[8] BI I V，HARVENGT L，CHANDELIER A，et al.Improved RAPD amplification of recalcitrant plant DNA by the use of activated charcoal during DNA extraction[J].Plant Breeding，1996，115(3)：205-206.

[9] 閆光照，鄭根昌，王偉，等.β-巰基乙醇與PVP在紅干椒DNA提取中的比較研究[J].內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2009，24(1)：51-54.

[10] 薛麗梅，胡永玲，趙桂紅.β-巰基乙醇的合成及精餾研究[J].化學(xué)與粘合，2010，32(4)：24-26.

[11] 靖博宇，鄭霞，楊瑞，等.親水性聚合物對(duì)自乳化藥物傳遞系統(tǒng)穩(wěn)定性的影響[J].中國(guó)藥房，2016(7)：910-912.

[12] 馬輝，張智俊，羅淑萍，等.藥用植物白術(shù)DNA提取方法的研究[J].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30(2)：13-16.

[13] HU Y P，XIE X L，LI W，et al.An effective and low-cost method for DNA extraction from herbal drugs of Rheum tanguticum(Polygonaceae)[J].African Journal of Biotechnology，2010，8(12)：2691-2694.

[14] ZENG J，ZOU Y，BAI J，et al.Preparation of Total DNA from "Recalcitrant Plant Taxa"[J].Acta Botanica Sinica，2002，44(6)：694-697.

[15] CUI H，HE Y，WANG J，et al.Cotton plant event A2-6 and primer and method for use in detection thereof：2013170399.3[P].2013-11-23.

[16] 王蘭，龍?jiān)沏?，劉耀?一種用于PCR的植物基因組DNA快速制備方法[J].分子植物育種，2009，7(2)：425-428.

[17] 王小蓉，陳濤，湯浩茹，等.一種適合富含多糖類植物的干燥葉片DNA提取方法：CN103756994A[P].2014-04-30.

[18] HANANIA U，VELCHEVA M，SAHAR N，et al.An improved method for isolating high-quality DNA from Vitis vinifera nuclei[J].Plant Molecular Biology Reporter，2004，22(2)：173-177.

Study on A New Extraction Method of Genomic DNA from Subg.Cerasus

Wu Fan1，2，Liu Xinhong2，Jiang Dongyue2，Li Yingang2，Yang Shaozong2，Liu Huahong3，Ni Sui1*

(1.Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology of Ministry of Education，Ningbo University，Ningbo 315211，China；2.Zhejiang Forestry Academy，Hangzhou 310023，China；3.Hangzhou Landscaping Co.，Ltd.，Hangzhou 310020，China)

In the present study，a new method used to extract the genomic DNA of Subg.Cerasuswas developed based on the traditional methods of CTAB and kits.In the new method，the DNA extraction buffer was used as the pre-treatment buffer，and other procedures were also optimized.The new method was assayed through ISSR-PCR using the DNA extracted by the new method.The results showed that several impurities including polysaccharide，pigment，and flavone could be eliminated effectively by the new method，while the purity and quality of DNA extracted through the method of kit were better.The results of ISSR-PCR showed that the two pairs of primers could be used for amplification in the sample DNA，while the amplified bands were clear and there is no obvious degradation.In conclusion，the two new methods could be used to the extraction of genomic DNA of Subg.Cerasus.The new methods could be applied to the work of other species because of their high generalization.

Subg.Cerasus；DNA extraction；CTAB；kit

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.02.007

2016-08-18

浙江省科技廳院所專項(xiàng)—國(guó)產(chǎn)櫻花新品系無(wú)性快繁技術(shù)體系研發(fā)(2016F50024)；浙江省林科院院企合作項(xiàng)目—櫻花種質(zhì)資源庫(kù)建設(shè)及新品種選育。

吳帆，男，碩士研究生，主要研究方向?yàn)橹参锓肿由飳W(xué)。E-mail：eiknarf@126.com

*通訊作者： 倪穗，教授，主要從事植物生物技術(shù)研究。E-mail：nisui@nbu.edu.cn

Q943

A

1006-9690(2017)02-0024-04