文興東

（荔浦縣人民醫(yī)院，廣西 荔浦546600）

近年來，隨著廣譜抗生素、抗腫瘤藥物、皮質(zhì)類固醇激素及免疫抑制劑的開發(fā)和應(yīng)用，介入治療、器官移植、骨髓移植術(shù)及導(dǎo)管插管等技術(shù)的普遍開展，免疫障礙以及艾滋病的流行，醫(yī)院真菌感染，特別是深部真菌感染所占比例正在逐年上升［1］，已成為醫(yī)院感染的又一新難題。深部真菌［2］主要有念珠菌、隱球菌、曲霉、毛霉、組織胞漿菌和卡氏肺孢菌等。深部真菌可累及全身各個部位和系統(tǒng)，其中受累臟器頻率最高的為呼吸道，特別是下呼吸道，其次為泌尿道、胃腸道、神經(jīng)系統(tǒng)等。由于院內(nèi)深部真菌感染患者起病較隱匿，且臨床表現(xiàn)無特異性等，病情易被基礎(chǔ)疾病掩蓋，給診斷帶來了很大困難。對其早期、準(zhǔn)確的診斷是治療成敗的關(guān)鍵。目前臨床實驗室主要借助顯微鏡檢查、培養(yǎng)、血清學(xué)、分子生物學(xué)等手段對真菌感染進(jìn)行檢測，現(xiàn)將近年來深部真菌感染的實驗室診斷介紹如下。

1 顯微鏡檢查

顯微鏡檢查是檢查真菌感染最快速有效和廉價的方法，包括直接鏡檢和染色后鏡檢（革蘭染色、墨汁染色、瑞氏染色等），主要是通過真菌形態(tài)學(xué)特征（包括孢子、菌絲和假菌絲等）對真菌進(jìn)行初步鑒別。對臨床標(biāo)本直接涂片、鏡檢，方法簡便、快速，但是陽性率較低，陰性結(jié)果不能直接排除診斷，大多數(shù)菌種都不能直接根據(jù)結(jié)果來確定。王鳳玲等［3］對呼吸內(nèi)科的286例呼吸系統(tǒng)感染疾病患者行痰涂片染色鏡檢直接檢測真菌，將檢測結(jié)果與真菌培養(yǎng)法的檢測結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示鏡檢法真菌檢出率略高于培養(yǎng)法的檢出率，但兩種方法差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明應(yīng)用超高倍顯微儀痰涂片檢測真菌準(zhǔn)確率較高，是一種簡便、快速診斷呼吸系統(tǒng)真菌感染的篩查方法。

2 真菌培養(yǎng)

真菌培養(yǎng)作為傳統(tǒng)的診斷深部真菌感染的方法，是目前各實驗室檢測真菌感染的基本環(huán)節(jié)。各種鏡檢法的陽性率均低于培養(yǎng)法。它能明確引起感染的真菌種類名稱，并可用相應(yīng)真菌進(jìn)行藥敏試驗。但也有一定弊端，培養(yǎng)結(jié)果要結(jié)合直接鏡檢的結(jié)果，必要時應(yīng)多次重復(fù)檢查；對于某些危險度處于1、2 類分級標(biāo)準(zhǔn)中的真菌還需注意安全防護(hù)；而且培養(yǎng)需要的時間相對較長［4］，一般需要48h，有時需要72～96h；同時在肺部真菌感染的診斷中，單純根據(jù)痰液培養(yǎng)結(jié)果難以鑒別真菌是定植還是真正的真菌感染［5］。

3 血清學(xué)檢查

目前真菌感染的血清學(xué)試驗主要包括抗原抗體檢測及代謝產(chǎn)物檢測兩大類。研究顯示［6］，血清學(xué)診斷念珠菌感染的特異性和敏感性可分別達(dá)93% 和80%，且73% 的陽性結(jié)果可早于血培養(yǎng)2d，有些病例甚至可早于血培養(yǎng)15d。

3.1 抗原檢測

近年來開展的真菌抗原檢測，作為一種非侵襲性診斷方法，有著早期、快速、高靈敏度和特異度的優(yōu)點，先后被歐洲國家、美國及中國制定的侵襲性真菌感染診斷和治療指南列為臨床診斷侵襲性真菌感染的微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)之一。理想的真菌感染的抗原性標(biāo)記［7］不應(yīng)該太短暫，應(yīng)該與感染相關(guān)而不是集群現(xiàn)象。它們應(yīng)該在目標(biāo)菌種內(nèi)保守，不與人類和其他微生物抗原發(fā)生交叉反應(yīng)，在抗真菌治療開始前足夠早出現(xiàn)。真菌感染血清抗原檢查主要有半乳甘露聚糖、beta－葡聚糖、cond－Tec抗原和烯醇化酶等抗原［8］。

3.1.1 血漿葡聚糖試驗

葡聚糖廣泛存在于真菌細(xì)胞壁中，在真菌細(xì)胞的生長代謝過程中可自然脫落下來而進(jìn)入循環(huán)；當(dāng)真菌減少時［9］，機(jī)體免疫系統(tǒng)將其迅速清除，而在淺部真菌感染時則無類似現(xiàn)象。Ostrosky－Zeichner等［10］對170 名健康志愿者和163例確診或可疑深部真菌感染患者進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示以≥60ng·L－1為陽性判定界值點，其總敏感度為69.9%，特異度為87.1%。雖然具有較高的診斷敏感度和特異性，但陽性率很低。葡聚糖檢測只能提示有無真菌感染，不能明確為何種真菌，且會有一定數(shù)量的漏診。

3.1.2 半乳甘露聚糖（GM）試驗

GM 是曲霉菌細(xì)胞壁上的一種多糖抗原。研究顯示［11］，血清GM 水平與組織的真菌負(fù)荷量成正比，動態(tài)監(jiān)測血清GM 水平的變化有助于判斷抗真菌治療的效果。2003年，美國FDA 完成對該實驗的臨床評價，早期診斷優(yōu)勢突出，并批準(zhǔn)GM 實驗用于非免疫缺陷患兒侵襲性曲霉菌?。↖A）的輔助診斷。但也有文獻(xiàn)報道在兒童，尤其是小嬰兒和新生兒的假陽性率則較高。目前公認(rèn)的檢測［12］GM 抗原最佳方法是ELISA 法，用ELISE 法檢測高?；颊咧蠫M 曲霉抗原用于臨床侵襲性曲菌的早期診斷在國外已被許可。

另外，還有隱球菌莢膜多糖抗原的檢測是目前臨床上診斷隱球菌感染的最重要方法之一，已被廣泛應(yīng)用；而由于甘露糖廣泛存在于各種真菌細(xì)胞中，導(dǎo)致該檢測方法特異度較低，限制了臨床應(yīng)用；烯醇化酶的抗原性較強(qiáng)，在體內(nèi)清除較快，陽性率不如其抗體檢測。

3.2 抗體檢測

少數(shù)引起深部感染的真菌，其胞壁成分甘露聚糖及胞膜代謝產(chǎn)物阿拉伯糖可作為抗原產(chǎn)生相應(yīng)抗體。孔曉祥等［13］通過實驗研究表明，ELISA 法檢測血清抗白念珠菌烯醇化酶抗體對診斷該菌深部感染有重要價值。

4 分子生物學(xué)檢測

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，包括PCR 法在內(nèi)的多種分子生物學(xué)技術(shù)開始應(yīng)用于真菌病的診斷和研究，其敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、快捷方便等優(yōu)點引起了廣大學(xué)者的高度關(guān)注。但由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)化和經(jīng)過驗證的商品化試劑，PCR 技術(shù)尚未常規(guī)應(yīng)用于臨床標(biāo)本的診斷。同時，由于PCR強(qiáng)大的擴(kuò)增能力與靈敏度，極微量的污染即可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果。真菌DNA 的提取方法有很多種［14］，如氯化芐法、蝸牛酶破壁法、液氮研磨法等。有學(xué)者［15］用多重PCR測定法鑒定口腔念珠菌屬，采用引物ITS1、ITS2、CA3 和CA4進(jìn)行檢測，結(jié)果能比培養(yǎng)法更準(zhǔn)確檢測出所有樣本菌，說明多重PCR 是一種檢測假絲酵母屬的快速方法。Kanbe等［16］應(yīng)用套式PCR 檢測侵襲性曲霉感染，發(fā)現(xiàn)此方法特異性和敏感性均很高。

5 其他檢驗方法

真菌病的病理學(xué)檢查在臨床上非常重要，特別是在診斷深部真菌感染時意義尤為重大。它可根據(jù)鏡下的形態(tài)作出初步的鑒定，但確切的感染菌種還要依靠真菌培養(yǎng)。有些真菌［17］如瘢痕疙瘩樣芽生菌、鼻孢子菌等不能培養(yǎng)生長，只能依靠組織病理檢查。但組織穿刺往往不易被患者接受，且穿刺部位及所取組織量也會影響診斷結(jié)果，臨床開展受到一定的限制。席麗艷等［18］報導(dǎo)應(yīng)用氣相色譜－質(zhì)譜選擇離子法檢測血漿中的D／L 阿刺伯醇，可以早期診斷系統(tǒng)性真菌感染。

大量臨床資料表明，深部真菌感染的療效及轉(zhuǎn)歸很大程度取決于早期診斷。由于各種診斷方法均有其優(yōu)勢和局限性，傳統(tǒng)檢測方法亦具有新的檢測方法所不可替代的優(yōu)點，如組織病理學(xué)檢查仍是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)等。尋找更具代表性的檢測物質(zhì)及非侵襲性的檢測技術(shù)，廣泛利用新技術(shù)提高檢測速度、靈敏度和特異度，建立新的診斷方法，是日后進(jìn)一步明確深部真菌感染的研究方向。

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