熊肖，李博龔強，徐延浩

(長江大學農(nóng)學院，湖北荊州434025;湖北省澇漬災(zāi)害與濕地農(nóng)業(yè)重點實驗室( 長江大學) ，湖北荊州434025;主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心( 長江大學) ，湖北荊州434025)

大麥不同組織成熟過程中DNA甲基化的MSAP分析

熊肖，李博龔強，徐延浩

(長江大學農(nóng)學院，湖北荊州434025;湖北省澇漬災(zāi)害與濕地農(nóng)業(yè)重點實驗室( 長江大學) ，湖北荊州434025;主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心( 長江大學) ，湖北荊州434025)

DNA甲基化參與調(diào)控生長植物發(fā)育。使用甲基化敏感擴增多態(tài)性(methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP)方法并結(jié)合毛細管自動電泳分析儀，對大麥(HordeumvulgareL)的種子、根、莖、葉等4種組織在成熟過程中的DNA甲基化修飾進行了分析。結(jié)果表明，大麥不同組織在成熟過程中基因組總甲基化水平改變較小，但 44.90%～65.17% 的CCGG位點甲基化模式在不同組織在成熟過程中發(fā)生了改變。在大麥種子成熟過程中，CCGG位點半甲基化水平急劇升高，達到65.40%，全甲基化位點顯著下降僅為13.39%，與其他組織的甲基化特征差異顯著。結(jié)果顯示，在大麥組織成熟的過程中，DNA甲基化修飾發(fā)生了巨大的變化。

大麥(HordeumvulgareL)；DNA甲基化；甲基化敏感擴增多態(tài)性(MSAP)；組織類型；發(fā)育

發(fā)生在胞嘧啶位點上的甲基化修飾是表觀遺傳修飾的一種重要修飾形式，在調(diào)控基因時空表達、基因組防御、胚胎發(fā)育、基因組印跡等方面起著重要的作用[1]。陸光遠等[2]研究表明，在油菜幼苗形成過程中，從胚根到下胚軸到子葉，DNA甲基化水平逐漸增加。玉米穗位葉、雌穗苞葉、雄穗3 個組織中基因組CCGG位點胞嘧啶甲基化水平逐漸降低[3]。類似的現(xiàn)象在雞等[4～6]其他動植物中也有報道。由此可見，基因組DNA甲基化水平對調(diào)控動植物組織分化起著重要的作用[1,7]。DNA甲基化也是植物應(yīng)答基因組脅迫的一種重要調(diào)控方式[8]。Xu等[9]研究表明，在基因組加倍過程中，蕓薹花與葉片基因組DNA甲基化調(diào)控模式存在差異。比較和分析生物不同組織基因組甲基化水平，是解析DNA甲基化調(diào)控器官發(fā)育及組織特異逆境應(yīng)答的基礎(chǔ)。

檢測DNA甲基化的方法主要有色譜法、酶切法、測序法、甲基化PCR檢測法、芯片法等多種方法[10]。以甲基化修飾敏感性不同限制性內(nèi)切酶和PCR 為基礎(chǔ)的甲基敏感擴增片段多態(tài)性 (Methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP) 靈敏度高、不受基因組序列信息限制、檢測位點多、成本低并能同時分析多個樣品。目前[9,11～13]，MSAP已應(yīng)用在雜種優(yōu)勢分析、基因組加倍、逆境應(yīng)答等多個領(lǐng)域的研究中。但傳統(tǒng)的MSAP分析依賴于聚丙烯酰胺凝膠電泳，其操作自動化水平較低，嚴重地制約了分析通量。對MSAP分析自動化與高通量的研究是改進MSAP分析方法的主要方向[6]。

大麥(HordeumvulgareL)是釀造工業(yè)重要的原料和飼料作物，其基因組已完成測序[14]。作為一個典型的二倍體植物，大麥是細胞遺傳學的模式生物，目前正成為麥類作物功能基因組學的一個代表物種[15]。與玉米、油菜等作物相比，缺乏對大麥不同組織基因組DNA甲基化水平的比較分析。本研究使用MSAP方法并結(jié)合毛細管自動電泳儀對大麥不同組織基因組DNA甲基化水平進行比較分析，為大麥表觀遺傳研究積累更多資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

供試品種為長江大學農(nóng)學院保存的大麥鄂啤2號(HordeumvulgareL.cv.Epi 2)。材料于2015年11月4日播種在長江大學農(nóng)學院試驗田，田間管理按常規(guī)方法進行。試驗田行長1.5m，株距10cm，行距25cm，單穴點播，每個小區(qū)7行，共設(shè)置3個小區(qū)，按小區(qū)分別取樣、保存。2015年12月下旬采集幼苗的葉片和莖稈；2016年3月下旬采集抽穗后的旗葉和莖稈、并挖取地下根；2016年4月下旬采集乳熟期的種子。種子成熟后分小區(qū)脫粒、晾曬，2016年9月底作為成熟種子樣品使用。2015年11月4日在人工氣候箱中(上海佳語JYC-412)萌發(fā)種子，7d后收集幼根保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取

用CTAB法(2% CTABw/v,100mmol/L Tris-HCl pH 8.0,20mmol/L EDTA pH 8.0,2.8mol/L NaCl)提取各樣品基因組總DNA。粗提的DNA加入RNAase A消化過夜，用酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)抽提后用氯仿-異戊醇(24∶1)抽提1～2次，用無水乙醇沉淀DNA。DNA干燥后溶于TE溶液。用1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA 的完整性，用Nano Drop 2000檢測樣品DNA濃度。

1.3 MSAP的酶切與連接

雙酶切反應(yīng)體系總體積20μL，其中DNA 400ng，NEB 10×buffer 2μL，HpaII 20U或MspI 10 U，EcoRI 10 U，100×BSA(10mg/mL)0.2μL。37℃溫浴5h,75℃ 10min中止反應(yīng)。雙酶切反應(yīng)體系中加入EcoRI接頭5pmol，HpaII/MspI接頭50pmol(表1)，T4 DNA連接酶 1μL(NEB)，ATP 1mmol/L。14℃ 水浴12h。75℃ 10min中止反應(yīng)。

表1 MSAP接頭、引物信息

1.4 MSAP的預(yù)擴增、選擇性擴增

預(yù)擴增使用50ng (3μL)酶切連接產(chǎn)物作為模板，25μL PCR反應(yīng)體系含有0.2μmol/LEcoRI和HpaII/MspI預(yù)擴增引物(EcoRI + 0,HpaII/MspI + 0) (表1)，1× PCR buffer,1.5mmol/L MgCl2,0.2mmol/L dNTP ,2 U Taq酶(Fermentas)。PCR 擴增程序為 94℃ 3min； 然后 94℃ 30s，56℃ 40s，72℃ 60s共 23個循環(huán)；72℃ 延伸 10min。

預(yù)擴產(chǎn)物用ddH2O溶液稀20倍，取1μL作為選擇擴增的模板DNA。選擇性擴增引物對采用在預(yù)擴引物的序列基礎(chǔ)上加上幾個堿基組成(EcoRI + 3個選擇性堿基和HpaII/MspI +2～4個選擇性堿基，表2)。選擇性擴增PCR反應(yīng)體系和預(yù)擴增PCR反應(yīng)體系相同。PCR擴增程序為 94℃ 60s，接下來 94℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 60s，每個循環(huán)退火溫度降低 0.7℃，執(zhí)行 12 個循環(huán)；接著在 94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 60s 擴增23個循環(huán)；最后72℃ 延伸10min。

1.5 MSAP的擴增片段的自動電泳與數(shù)據(jù)讀取分析

利用毛細管自動電泳儀(Fragment Analyzer FSv2-CE，美國AATI)對MSAP選擇性擴增PCR產(chǎn)物進行電泳分離，分離試劑盒為DNF-900 dsDNA Reagent Kit 35～500bp(AATI，美國)，該試劑盒能區(qū)分35～500bp的片段，比較適用于MSAP擴增片段分離。毛細管電泳分離條件：8.0kV預(yù)電泳30s后7.5kV 10s吸取內(nèi)參DNA分子；接著7.5kV 10s吸取樣品DNA分子后，8.0kV電泳95min分離MSAP擴增片段。

表2 MSAP選擇性引物組合信息

電泳結(jié)束后用PROSize 2.0軟件(AATI，美國)矯正內(nèi)參DNA標記，將所有分子量相同的內(nèi)參DNA標記校準到同一水平位置后讀取分離片段的分子量并導(dǎo)出所有分析樣本數(shù)據(jù)。由于MSAP目標條帶較多，使用Excel將目標分離片段轉(zhuǎn)化為0/1矩陣進行甲基化率、甲基化模式比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麥不同組織基因組DNA甲基化水平比較

HpaII酶切未甲基化和單鏈外側(cè)C甲基化的CCGG位點，MspI酶切未甲基化和雙鏈內(nèi)側(cè)C甲基化的CCGG位點。當樣品在HpaII酶切擴增產(chǎn)物中有帶而在MspI酶切擴增產(chǎn)物中無帶，則說明該位點發(fā)生了單鏈外側(cè)的胞嘧啶甲基化；反之，則說明該位點發(fā)生了雙鏈內(nèi)側(cè)胞嘧啶甲基化；兩者擴增產(chǎn)物中均有帶，說明該位點未發(fā)生甲基化(表3)。

表3 大麥不同組織基因組CCGG位點DNA甲基化水平

注：1)格子代表CCGG雙鏈，黑色的格子代表甲基化的位點。2)H代表EcoRI-HpaII酶切,M代表EcoRI-MspI酶切；+表示有帶，-表示無帶。3)括號中數(shù)據(jù)代表該類型所占比例(%)。

大麥乳熟期種子CCGG位點總甲基化水平為74.11%，成熟種子甲基化水平為78.79%，在種子成熟過程中，甲基化水平上升4.68%；大麥幼根CCGG位點總甲基化水平為72.62%，抽穗后根系總甲基化水平為78.36%，隨著發(fā)育成熟，根系甲基化水平升高5.74%；大麥幼莖CCGG位點總甲基化水平為76.65%，抽穗后莖稈總甲基化水平為74.02%，甲基化水平下降2.64%；大麥幼葉CCGG位點總甲基化水平為71.36%，旗葉總甲基化水平為75.35%，隨著發(fā)育成熟，葉片甲基化水平升高3.99%(表3)?？偟膩碚f，在大麥發(fā)育成熟的過程中，不同器官基因組總甲基化水平維持在75%左右，改變程度在5%左右。在大麥種子成熟過程中，CCGG位點半甲基化水平急劇升高，達到65.40%，增加25.60%；全甲基化位點下降20.91%，僅為13.39%；但從幼嫩莖到成熟莖的過重中，CCGG位點半甲基化水平下降15.17%，而全甲基化水平提高12.54% (表3)。但在根和葉成熟過程中，CCGG位點半甲基化水平和全甲基化水平改變程度較小(表3)。

2.2 大麥不同組織在成熟過程中DNA甲基化模式的改變

雖然在大麥不同組織成熟過程中基因組總甲基化水平改變程度較低，但不同位點的甲基化修飾模式還需要進一步分析。20對選擇性引物組合在4組組織中共擴增得到3235條帶(圖1)。根據(jù)MSAP帶紋在每組幼嫩組織和成熟組織中的相對模式，MSAP帶紋模式可以分3大類，第一類在組織成熟過程中沒有發(fā)生DNA甲基化狀態(tài)改變的位點，根據(jù)其帶紋模式再分為無甲基化位點、單鏈外側(cè)甲基化位點、雙鏈內(nèi)側(cè)甲基化位點等3個類型(A1～A3)；第二類是在組織成熟過程中發(fā)生了超甲基化的位點，依據(jù)其帶紋模式，共包括5個類型(B1～B5)；第三類是在組織成熟過程中發(fā)生了去甲基化的位點，依據(jù)其帶紋模式，共分為5個類型(C1～C5)(表4)。

注：1)1.新種子樣品；2.老種子樣品；3.幼根樣品；4.幼莖樣品；5.幼葉樣品；6.拔節(jié)根樣品；7.拔節(jié)莖樣品；8.拔節(jié)葉樣品。2)H表示EcoRI-HpaII酶切擴增電泳帶，M表示EcoRI-MspI酶切擴增電泳帶。3)選擇性引物組合依次為HpaII/MspI+TTC×EcoRI+CGT，HpaII/MspI+TAA×EcoRI+GTT，HpaII/MspI+CTG×EcoRI+GTA。圖1 大麥不同組織的MSAP電泳帶紋模式

帶紋類型帶紋亞類幼嫩組帶型HM成熟組帶型HM不同器官擴增帶紋數(shù)量種子根莖葉ABC總計A11111123222229231A210107510413762A3010158889385小計256414459378B11110411513B2110182145B3010099919988B4100052857592B5110028221217小計191211205215C1011112874C210112667C30001801109592C4001167121421C500101278947100小計288225169224735850833817

注：1)A.DNA甲基化未改變位點；B.超甲基化位點；C.去甲基化位點。2)H代表EcoRI-HpaII酶切，M代表EcoRI-MspI酶切；1代表有擴增帶紋，0代表無擴增帶紋。

對MSAP結(jié)果(表4)的分析表明，在種子成熟過程中，65.17%檢測的CCGG位點發(fā)生了甲基化狀態(tài)的改變，其中25.99%的位點發(fā)生了超甲基化，39.18%的位點發(fā)生了去甲基化；在根系成熟的過程中，51.29%檢測的CCGG位點發(fā)生了甲基化狀態(tài)的改變，其中24.82%的位點發(fā)生了超甲基化，26.47%的位點發(fā)生了去甲基化；在莖成熟的過程中，44.90%檢測的CCGG位點發(fā)生了甲基化狀態(tài)的改變，其中24.61%的位點發(fā)生了超甲基化，20.29%的位點發(fā)生了去甲基化；在葉片成熟的過程中，53.73%檢測的CCGG位點發(fā)生了甲基化狀態(tài)的改變，其中26.32%的位點發(fā)生了超甲基化，27.41%的位點發(fā)生了去甲基化。說明雖在大麥組織成熟的過程中，可能經(jīng)歷過基因組甲基化狀態(tài)的重排。

3 討論

本研究使用毛細管自動電泳儀分離MSAP片段，一次能分離96個樣品，并且自動讀取條帶的分子量，避免了人工讀帶的主觀誤差，保留了毛細管電泳適應(yīng)自動化、通量高、分辨率高的特點，又保留了MSAP成本相對較低的特點，為大麥DNA甲基化分析提供了一個快速、高通量的分析技術(shù)手段[6]。

MSAP僅能分析CCGG位點雙鏈內(nèi)側(cè)全甲基化和單鏈外側(cè)半甲基化修飾，植物基因組中還存在CG、CHG、CHH位點的甲基化修飾，這些位點的甲基化狀態(tài)在組織成熟過程中的變化還需要使用其他研究手段進一步去分析[16]。通過MSAP分析，發(fā)現(xiàn)大麥不同組織在成熟過程中基因組CCGG位點DNA甲基化水平相對比較穩(wěn)定，改變程度大約在5%。這與在蕓薹屬[9]、菘藍[12]、玉米[3]等多種作物中的研究結(jié)果類似。這說明一定程度的基因組甲基化水平對維持基因組的穩(wěn)定性具有重要作用。

但在大麥不同組織成熟過程中，超過一半的CCGG位點的甲基化模式發(fā)生了重排，其中超甲基化事件與去甲基化事件基本相當。一般認為DNA甲基化是調(diào)控基因表達的一種重要表觀遺傳修飾，DNA超甲基化能關(guān)閉或降低基因的表達，而去甲基化則可以啟動或增強基因的表達，但具體哪些基因發(fā)生了時空轉(zhuǎn)錄的變化，還需要通過轉(zhuǎn)錄組和甲基化測序來進一步確定。

DNA甲基化修飾是植物響應(yīng)逆境脅迫的一種重要方式。對大麥干旱脅迫下的葉片和根系甲基化組的研究表明，葉片在干旱脅迫下發(fā)生更多的去甲基事件，而根系發(fā)生更多的甲基化事件[13]。這與本研究觀察到的不同組織器官成熟過程中具有組織特異的甲基化改變模式一樣。與本研究相比，菘藍[11]、油菜[9]等不同植物器官[17]的甲基化模式改變程度及其在逆境下的甲基化重排程度都要小得多。這可能是因為大麥基因組較大，基因組中大部分是重復(fù)序列和反轉(zhuǎn)座子序列，而這些位點是甲基化修飾和調(diào)控的熱點區(qū)域[13]。

基因組內(nèi)DNA甲基化受到DNA甲基化酶、染色質(zhì)域甲基化轉(zhuǎn)移酶、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶等酶的作用，而去甲基化修飾則主要與沉默抑制因子(ROS1)、轉(zhuǎn)葡萄糖基酶、氧化去甲基化、水解去甲基化等機制有關(guān)[1,7,16]。RNA介導(dǎo)的DNA甲基化修飾也是調(diào)控DNA甲基化的重要機制[18]。這些機制在大麥組織成熟和分化過程中是如何調(diào)控基因組DNA甲基化的修飾是一個值得深入研究的問題。

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[編輯] 余文斌

2017-03-16

長江大學青年基金資助項目(2015cqr16)；濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程中心開放課題(KF201601)。

熊肖(1988-)，男，碩士生，研究方向為植物分子育種。通信作者:徐延浩，xyh09@yangtzeu.edu.cn。

Q78；S512.3

A

1673-1409(2017)10-0029-05

[引著格式]熊肖，李博，龔強，等.大麥不同組織成熟過程中DNA甲基化的MSAP分析[J].長江大學學報(自科版)，2017，14(10)：29～33,42.