吳凱，左振君，夏勝應(yīng)，劉志雄

(長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025)

九江苦蕎大小孢子發(fā)生與雌雄配子體發(fā)育觀察

吳凱，左振君，夏勝應(yīng)，劉志雄

(長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025)

采用石蠟切片技術(shù)對(duì)苦蕎(Fagopyrumtataricum)大、小孢子發(fā)生及雌、雄配子體的發(fā)育進(jìn)行了觀察研究。結(jié)果顯示：苦蕎花藥4室，花粉囊壁由表皮、藥室內(nèi)壁、1層中層和1層絨氈層組成；小孢子四分體胞質(zhì)分裂為同時(shí)型，四分體為四面體型，成熟花粉為2細(xì)胞型；胚珠直立、雙珠被、厚珠心、大孢子四分體直線型、合點(diǎn)端為功能大孢子、蓼型胚囊；大孢子發(fā)生和雌配子體發(fā)育前期慢、后期快，小孢子四分體時(shí)期才能見大孢子母細(xì)胞，功能大孢子形成于2細(xì)胞花粉形成期，但也隨著花粉壁加厚和發(fā)育成熟，功能大孢子很快分裂發(fā)育成成熟胚囊。

苦蕎(Fagopyrumtataricum)；孢子；配子體

苦蕎(Fagopyrumtataricum(L.) Gaerth)屬蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrum)，是藥食同源的一年生小雜糧作物，其種子富含類黃酮、蘆丁和抗氧化活性物質(zhì)等，具很高的營養(yǎng)價(jià)值和保健功效[1,2]。研究表明，蕎麥作為目前唯一種子具高蘆丁含量的谷物，其蘆丁具有降低血清中髓過氧化物酶和膽固醇水平，及減輕頭痛和消除疲勞等優(yōu)點(diǎn)，成為理想的具食療潛能的功能食品原料之一，被開發(fā)成茶、面條和其他多種保健食品[1,2]；苦蕎作為蕎麥主要的2個(gè)栽培種之一，其種子蘆丁含量約為普通蕎麥(FagopyrumesculentumMoench)的100倍，營養(yǎng)價(jià)值更高[1]。 隨著世界經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們對(duì)健康的重視，苦蕎及其相關(guān)制品的需求正逐年增加。苦蕎原產(chǎn)于我國，在日本、韓國、尼泊爾、美國、俄羅斯和歐洲部分國家也有栽培，因其具有生育期短、耐旱、耐瘠薄等優(yōu)點(diǎn)，是中國干旱和半干旱地區(qū)主要糧食作物之一[3,4]。同時(shí)，苦蕎花期長、種子熟期同步化程度低，同一植株甚至同一花序上存在不同發(fā)育時(shí)期的種子，不利機(jī)械化作業(yè)，加上落粒性、產(chǎn)量低和因自花授粉造成的品種遺傳背景單一等特點(diǎn)，使得大面積推廣應(yīng)用困難。

大宗作物的育種實(shí)踐證明，開展雜交育種是提高自花授粉作物產(chǎn)量、品質(zhì)和增加遺傳多樣性的有效途徑[5]。由于苦蕎雜交育種工作滯后，目前育種方法主要以系統(tǒng)選育和誘變育種為主，產(chǎn)量提高有限，嚴(yán)重地制約著苦蕎的開發(fā)利用[6]。我國苦蕎種質(zhì)資源豐富，很多資源的綜合農(nóng)藝性狀好[7]。這些優(yōu)異的材料為苦蕎雜交育種的開展積累了珍貴的資源。而弄清作物自身花器官的形態(tài)特征和發(fā)育規(guī)律是開展雜交育種的前提和基礎(chǔ)。本研究以國家苦蕎品種審定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照種‘九江苦蕎’為試驗(yàn)材料，通過石蠟切片技術(shù)，系統(tǒng)研究苦蕎花發(fā)育過程中大小孢子的發(fā)生與雌雄配子體的發(fā)育過程，以為苦蕎雄性不育系的創(chuàng)制和雜交育種研究積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料

‘九江苦蕎’由長江大學(xué)作物遺傳育種研究所麥類作物研究課題組純化后提供，于2016年3月播種于長江大學(xué)作物遺傳育種研究所試驗(yàn)田，出苗后常規(guī)水肥管理，花分生組織分化后連續(xù)取樣觀察。

1.2 方法

取‘九江苦蕎’不同發(fā)育時(shí)期的新鮮花序和小花芽，立即用FAA固定液(甲醛︰冰乙酸︰70%乙醇=1︰1︰18；v/v)固定24h，經(jīng)濃度分別為70%、85%、95%和100% 乙醇梯度脫水，每級(jí)1h；再依次經(jīng)50%二甲苯乙醇和100%的二甲苯透明，各2h；38℃下在飽和的二甲苯石蠟溶液中浸蠟12h，后在60℃下用液體純蠟置換二甲苯石蠟溶液，浸蠟12h，每4h換1次純蠟，用石蠟包埋。石蠟切片的方法參照文獻(xiàn)[8]，略有改動(dòng)，用Leica RM2235石蠟切片機(jī)連續(xù)切片，切片厚度8μm,用1%番紅-0.1%固綠對(duì)染,中性樹膠封片后在OLYMPUS BX63顯微鏡下觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)并拍照。

2 結(jié)果與分析

苦蕎為總狀花序(圖1A)：小花被片5枚，淡綠色、花萼狀；雄蕊8枚、外輪5枚、內(nèi)輪3枚，2輪雄蕊間鄰近花絲基部的位置著生8個(gè)沒有完全退化的圓球形腺體；子房上位，花柱3，3合生心皮1室，內(nèi)含1直立胚珠(圖1B)。

圖1 苦蕎的花序和花

A.孢原細(xì)胞平周分裂成初生辟細(xì)胞和造孢細(xì)胞(400×)； B.小孢子母細(xì)胞和絨氈層形成(400×)；C.絨氈層開始解體，小孢子母細(xì)胞開始減數(shù)分裂(400×)；D.小孢子形成四面體型四分體，大孢子母細(xì)胞形成(400×)；E.小孢子四分體開始解體(400×)；F.三角形單核花粉粒，大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂(400×)；G.單核花粉變大變圓，直線型大孢子四分體形成(400×)；H.花粉單核靠邊期，珠孔端的3個(gè)大孢子退化，合點(diǎn)端的發(fā)育成功能大孢子(400×)；I.二細(xì)胞花粉，功能大孢子形成(400×)；J.成熟花粉粒，功能大孢子第一次有絲分裂；K.卵細(xì)胞,成熟花粉粒(400×)；L.雙受精后的卵細(xì)胞和極核(400×)圖2 苦蕎大小孢子發(fā)生與雌雄配子體發(fā)育

2.1 小孢子發(fā)生與雄配子體發(fā)育

花藥4個(gè)角隅處的孢原細(xì)胞經(jīng)1次平周分裂，形成內(nèi)、外2層細(xì)胞，外層的為周緣細(xì)胞，內(nèi)層的為造孢細(xì)胞(圖2A)。周緣細(xì)胞繼續(xù)平周分裂成藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層；此時(shí)可明顯見花粉囊壁由1層表皮、1層藥室內(nèi)壁、1層中層和1層絨氈層構(gòu)成；造孢細(xì)胞則分裂形成小孢子母細(xì)胞，小孢子母細(xì)胞體積大、核大、核仁明顯、質(zhì)濃，生理活性旺盛(圖2B)?？嗍w中層和絨氈層細(xì)胞解體發(fā)生的時(shí)間相對(duì)較早，隨著小孢子細(xì)胞母進(jìn)一步發(fā)育進(jìn)入減數(shù)分裂期、中層和絨氈層細(xì)胞開始解體為小孢子發(fā)育提供營養(yǎng)、整個(gè)藥室內(nèi)細(xì)胞間隙變得明顯，小孢子母細(xì)胞處于游離狀態(tài)(圖2C)。隨后游離小孢子母細(xì)胞連續(xù)進(jìn)行2次的減數(shù)分裂，形成四面體型的四分體；在四分體形成過程中，胞質(zhì)分裂為同時(shí)型，但同一朵花不同雄蕊花藥藥室間小孢子發(fā)育具有不同步現(xiàn)象(圖2D)。四分體最初包裹在明膠狀的胼胝質(zhì)中，隨著胼胝質(zhì)溶解，小孢子逐漸從四分體中釋放出來，開始釋放出來的小孢子呈三角型(圖2D～F)；隨著小孢子的不斷發(fā)育，小孢子細(xì)胞逐漸變大變圓，出現(xiàn)了大的液泡、小孢子核被擠向一邊形成單核靠邊期小孢子；緊接著，小孢子核分裂成一個(gè)大的營養(yǎng)核和一個(gè)小的生殖核，形成2-細(xì)胞型花粉；此時(shí)仍可觀察到中層和絨氈層解體的殘存結(jié)構(gòu)(圖2G～I(xiàn))。隨著2-細(xì)胞型花粉的發(fā)育變大變圓、花粉壁不斷加厚、花粉發(fā)育成熟，此時(shí)中層和絨氈層才完全消失(圖2J～K)。

2.2 大孢子發(fā)生與雌配子體發(fā)育

苦蕎大孢子發(fā)生晚于小孢子，當(dāng)小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂形成四分體時(shí)，才可見大孢子造孢細(xì)胞發(fā)育成大孢子母細(xì)胞(圖2D)。大孢子母細(xì)胞細(xì)胞核大，細(xì)胞質(zhì)濃厚，生理活動(dòng)旺盛，體積較大，包被在2層珠心細(xì)胞中，并與周圍珠心組織細(xì)胞差異顯著(圖2 D)。隨著內(nèi)、外輪珠被的出現(xiàn)和發(fā)育，可以看到大孢子母細(xì)胞經(jīng)過2次減數(shù)分裂形成直線型的四分體(圖2F～G)。隨著內(nèi)、外輪珠被繼續(xù)向前延伸和發(fā)育，靠近珠孔端的3個(gè)大孢子逐漸退化消失，留下合點(diǎn)端的1個(gè)繼續(xù)發(fā)育長大成功能大孢子(圖2H～I(xiàn))。隨后，功能大孢子經(jīng)過連續(xù)2次的有絲分裂形成8核7細(xì)胞型成熟胚囊(圖2J～K)。但很快通過自花授粉和雙受精形成2倍體的合子和3倍體的受精極核(圖2L)。

3 討論與結(jié)論

苦蕎為蓼科蕎麥屬自花授粉的小雜糧作物，其為總狀花序。本研究觀察到苦蕎子房3心皮合生1室、基底胎座、單個(gè)直立胚珠，雙珠被、厚珠心，大孢子四分體直線型排裂，合點(diǎn)端為功能大孢子，典型的蓼型胚囊；小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂中胞質(zhì)分裂為同時(shí)型，小孢子四分體為四面體型，成熟花粉為二細(xì)胞型。前人研究表明，花藥具4個(gè)小孢子囊、花粉二細(xì)胞型；二層珠被、厚珠心、倒生胚珠、功能大孢子位于合點(diǎn)端、蓼型胚囊、珠被不具絨氈層為原始性狀[9]?？嗍w具有較多的原始性狀、而胚珠直立則是相對(duì)進(jìn)化的特征。而目前報(bào)道的石竹目(Caryophyllales)其他科屬植物的胚胎學(xué)特征則表現(xiàn)得相對(duì)原始,支持了蓼科植物具基底胎座、單個(gè)直立胚珠的性狀是該目中的衍生類群[10～12]。如核心石竹目藜科(Chenopodiaceae)植物華北駝絨藜[Ceratoidesarborescens(Losinsk.)Tsien.etC.G.Ma]的則具有典型相對(duì)原始的胚胎學(xué)特征[12]；而該科另一植物甜菜(Betavulgaris)的具備較多的原始胚胎學(xué)特征的同時(shí)，出現(xiàn)了彎生胚珠的衍生性狀[14,15]。在非核心石竹目植物檉柳(Tamarixchinensis)中，其胚胎學(xué)重要性狀為基底胎座、多數(shù)胚珠、倒生，但其胚囊發(fā)育為貝母型，4個(gè)大孢子全部參與胚囊形成[16]。進(jìn)一步說明石竹目植物胚胎發(fā)育的復(fù)雜性。

從大小孢子的發(fā)育進(jìn)度來看，小孢子母細(xì)胞形成較早，當(dāng)小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂形成四面體型四分體時(shí)，珠心中造孢細(xì)胞才發(fā)育成大孢子母細(xì)胞。在小孢子發(fā)生與雄配子體發(fā)育過程中，絨氈層細(xì)胞破壞較早，但完體解體消失持續(xù)的時(shí)間相對(duì)較長，當(dāng)小孢子母細(xì)胞剛進(jìn)入減數(shù)分裂時(shí)就可看見絨氈層細(xì)胞明顯破壞，細(xì)胞間間隙明顯，中層細(xì)胞受到擠壓明顯遭受破壞，隨著四分體解體和雄配子體發(fā)育，絨氈層細(xì)胞和中層細(xì)胞中營養(yǎng)物質(zhì)被逐漸吸收，至花粉發(fā)育成熟時(shí)，中層和絨氈層細(xì)胞才完全消失。在大孢子發(fā)生與雌配子體發(fā)育過程中，大孢子前期發(fā)育相對(duì)較慢，雌配子體發(fā)育相對(duì)進(jìn)度較快；小孢子四分體時(shí)期時(shí)，大孢子母細(xì)胞特征明顯，但直到2細(xì)胞形花粉形成時(shí)，功能大孢子才形成，隨著花粉壁的加厚和發(fā)育成熟，功能大孢子很快發(fā)育成成熟胚囊，為自花受精作準(zhǔn)備。

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[編輯] 余文斌

2017-02-20

湖北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(D20151302)。

吳凱(1991-)，男，碩士生，研究方向?yàn)閳@藝植物遺傳發(fā)育與種質(zhì)創(chuàng)新。通信作者：劉志雄，zxliu77@yahoo.com。

Q949.744;Q945.5

A

1673-1409(2017)10-0034-04

[引著格式]吳凱，左振君，夏勝應(yīng)，等.九江苦蕎大小孢子發(fā)生與雌雄配子體發(fā)育觀察[J].長江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版)，2017，14(10)：34～37,78.