張春霆 劉全啟 徐禮臻 余謙 羅榮利 陳良佑 楊慶 朱再生

前列腺癌組織緊密連接蛋白-4表達及與生化復發(fā)的關系

張春霆 劉全啟 徐禮臻 余謙 羅榮利 陳良佑 楊慶 朱再生

目的探討緊密連接蛋白-4（Claudin-4）在前列腺癌中的表達及與前列腺癌生化復發(fā)之間的關系。方法應用S-P法檢測79例前列腺癌和45例前列腺增生組織Claudin-4表達狀況，分析其與前列腺癌臨床病理特點之間的關系，對前列腺癌隨診結果采用Kaplan-Meier生存分析5年前列腺癌患者生化復發(fā)與Claudin-4表達之間的關系；結果前列腺癌組織和前列腺增生組織Claudin-4表達陽性率分別為64.56%（51/79）和33.33%（15/45），差異有統(tǒng)計學意義（P均<0.01）。Claudin-4陽性表達在前列腺癌TNM分期Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期分別為46.34%和84.21%，在Gleason評分＜7分≥7分患者分別為57.14%和72.97%，兩者比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。隨訪60個月內生化復發(fā)45例，復發(fā)率為56.96%，生化復發(fā)的患者中Claudin-4表達陽性39例，Claudin-4表達陰性6例，兩組間生化復發(fā)率比較差異有統(tǒng)計意義（P<0.01）。前列腺癌患者PSA結果進行Kaplan-Meier生存分析顯示Claudin-4陽性患者5年生化復發(fā)率高于陰性表達患者。結論前列腺癌組織Claudin-4表達增高，其異常表達與前列腺癌臨床分期和Gleason評分及5年生化復發(fā)相關，聯(lián)合檢測Claudin-4可能有助于前列腺癌預后評估。

前列腺癌；Claudin-4；免疫組化；生化復發(fā)

前列腺癌已成為危害我國男性健康的疾病之一，前列腺癌起病隱匿，病因未明，多種因素參與前列腺癌的發(fā)生進展。緊密連接蛋白-4（Claudin-4）在多種腫瘤組織中異常表達[1-4]，但在前列腺癌中的表達狀況及與前列腺癌生化復發(fā)之間的關系報道較少。本研究對Claudin-4在前列腺癌中的表達狀況及與前列腺癌臨床病理關系和5年生化復發(fā)之間的關系進行研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料提取2005年1月—2015年8月浙江大學金華醫(yī)院泌尿外科手術切除或活檢證實的前列腺癌患者79例，年齡52～82歲，中位年齡68歲，平均病程（2.0±0.75）年。前列腺癌按照2002年AJCC的TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期41例，Ⅲ～Ⅳ期38例。分化程度按照Gleason系統(tǒng)，所有病理標本經(jīng)有經(jīng)驗的病理醫(yī)師再次證實。所提取的標本收取前患者無內分泌治療、放療及化療。收集同期前列腺增生患者45例，年齡51～83歲，中位年齡69歲，平均病程（2.0±0.5）年。兩組患者年齡、一般資料、病程無明顯差異，兩組資料有可比性（P>0.05）。

1.2 實驗方法采用Claudin-4兔抗人多克隆抗體和DAB顯色劑（均購自北京中杉金橋生物有限公司，批號140706）。采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶染色法（S-P法）。嚴格按試劑盒說明書進行實驗，石蠟包埋標本，3μm厚組織連續(xù)切片，抗原微波修復，過氧化氫清除內源性過氧化物酶活性。依次加一抗（1：100工作濃度）、生物素標記的二抗和酶標鏈霉親和素，37℃孵育20min，DAB顯色，顯微鏡下觀察，以PBS液替代一抗作陰性對照，用已知Claudin-4陽性的前列腺癌切片作陽性對照。

1.3 結果判定所有結果均由兩位有經(jīng)驗病理醫(yī)師進行雙盲讀片顯示結果，所有切片進行染色細胞數(shù)和染色強度觀察，Claudin-4定位于細胞膜，陽性顆粒呈藍色。高倍鏡下染色強度和陽性細胞所占比例進行測定現(xiàn)陽性顆粒數(shù)目，5個高倍視野下染色細胞計數(shù)所占比例分為5級：<5%為0分，～25%為1分，～50%為2分，～75%為3分，>75%為4分。再按染色強度分為3級：弱染色為1分，中度染色為2分，強染色為3分。每切片得分=染色細胞分數(shù)×染色強度分數(shù)，<2分為陰性，≥2分為陽性。

1.4 統(tǒng)計學方法應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，計數(shù)資料率的比較采用χ2或fish確切概率法，隨訪臨床資料采用Kaplan-Meier生存分析法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Claudin-4表達Claudin-4主要分布在前列腺上皮細胞膜，在胞質和胞核上表達少，見圖1（封二）。

2.2 Claudin-4蛋白表達與前列腺癌臨床病理特征的關系Claudin-4蛋白在前列腺癌中呈現(xiàn)高表達，在79例前列腺癌中Claudin-4蛋白陽性表達51例，陽性表達率為64.56%，在45例前列腺增生組織中陽性表達為15例，陽性率33.33%。Claudin-4蛋白表達陽性率與Gleason分級有關，在Gleason評分≤7分和＞7分患者中的陽性表達率分別為57.14%（24/ 42）和72.97%（27/37）；在前列腺癌TNM分期Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期患者Claudin-4蛋白表達率分別為46.34%（19/41）和84.21%（32/38），Claudin-4蛋白表達隨著分化程度加深呈現(xiàn)表達率上升（P<0.05），見表l。

表1 79例前列腺癌患者Claudin-4表達與臨床病理及5年生化復發(fā)之間的關系（例）

2.3 Claudin-4蛋白表達與隨訪前列腺癌患者5年生化復發(fā)之間的關系79例前列腺癌患者60個月PSA隨訪中，60個月內生化復發(fā)45例，復發(fā)率為56.96%，生化復發(fā)患者中Claudin-4表達陽性39例；Claudin-4表達陰性28例中60個月生化復發(fā)6例，生化復發(fā)率為21.43%，見表1。兩組間生化復發(fā)率比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.007）。Kaplan-Meier生存曲線結果可見Claudin-4陽性表達的前列腺癌患者復發(fā)高于Claudin-4表達陰性者，見圖2（封二）。

3 討論

Claudins蛋白是構成緊密連接的重要組成部分。Claudins在多種上皮來源的惡性腫瘤中存在異常表達，并且與這些腫瘤發(fā)生和發(fā)展以及生存率有關[5-7]。研究顯示，Claudins表達存在差異，Claudins家族中與腫瘤有關蛋白在同一組織中有的表達上調，有的則是表達下調或缺失，例如，Claudin-3和Claudin-4在卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌中呈現(xiàn)高表達，Claudin-7在乳腺癌和頭頸部腫瘤中表達下降，但是在胃癌中高表達[8-10]，我們前期基因篩查發(fā)現(xiàn)Claudin-4在前列腺癌中表達增高，因此，進一步研究它是否與前列腺癌發(fā)生、進展及臨床病理相關以及與前列腺癌5年生化復發(fā)之間的關系。

本實驗中應用免疫組化方法對前列腺癌Claudin-4表達狀況進行了研究，結果顯示，在前列腺癌中Claudin-4陽性表達率64.56%，在增生的前列腺組織中Claudin-4陽性表達率33.33%，兩者相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示Claudin-4在前列腺癌中異常表達可能與前列腺癌發(fā)生有關；國外研究[11]顯示，緊密連接蛋白在腫瘤中的作用使E-鈣黏蛋白表達減少，引起B(yǎng)-catenin在細胞內聚集，B-catenin/Tif信號通路激活，導致腫瘤細胞黏附力下降，易脫離原發(fā)灶，致周圍間質、血管、淋巴管及廣泛轉移。國內張曉波等[12]對雄激素依賴性和非依賴性前列腺癌細胞差異表達膜蛋白表達差異進行了研究，對前列腺癌細胞株LNCaP和PC-3中膜蛋白進行Western印跡檢測、串聯(lián)質譜分析等技術，發(fā)現(xiàn)Claudin-4在LNCaP和PC-3細胞存在明顯差異，陽性表達率分別為34.3%和72.4%，推測Claudin-4異常表達可能在雄激素非依賴性前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用；Meng等[13]對睪酮缺乏后小鼠前列腺內免疫炎癥因子變化狀況與前列腺疾病進行研究，發(fā)現(xiàn)睪酮通過調節(jié)前列腺內Claudin-4膜蛋白的表達，進而影響前列腺中炎癥因子繼發(fā)的前列腺疾病，包括前列腺癌；但是在前列腺癌中Claudin-4是否存在上述機制，Claudin-4蛋白表達增高如何參與前列腺癌發(fā)生進展以及轉移的過程，尚無充分的證據(jù)報道。

本研究還對前列腺癌分化程度和臨床分期與Claudin-4蛋白陽性表達之間的關系進行比較，發(fā)現(xiàn)在Gleason評分＜7分和≥7分患者中Claudin-4蛋白陽性表達率分別為57.14%（24/42）和72.97%（27/ 37），在前列腺癌Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期Claudin-4蛋白表達率分別為46.34%（19/41）和84.21%（32/38），表明它的異常表達可能參與了前列腺癌的進展和異常分化；文獻報道中對卵巢癌研究中發(fā)現(xiàn)Claudin-4轉錄因子通過甲基化調節(jié)減低組蛋白酶H3乙?；饔?，可使組蛋白酶H3失活，促進腫瘤進展[14]。Claudin-4也可經(jīng)蛋白激酶PKC8作用于189蘇氨酸／194絲氨酸位點，使其發(fā)生磷酸化作用而表達下降，并由細胞膜轉至細胞漿。使得緊密連接蛋白出現(xiàn)松散破壞[15]。因此推測前列腺癌進展中Claudin-4異常表達可能經(jīng)多種調節(jié)途徑，引起緊密連接骨架蛋白結構破壞，細胞極性和滲透性改變，瘤細胞侵襲力增加，促進腫瘤進展。

本研究發(fā)現(xiàn)Claudin-4異常表達與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展相關，隨訪中C1audin-4陽性表達與前列腺癌5年生化復發(fā)之間存在相關性，但是Claudin-4在前列腺癌發(fā)生進展中確切的作用機制以及以哪種作用方式參與了前列腺癌的發(fā)生進展，尚需要進一步研究。

［1］Kuwada M，Chihara Y，Luo Y，et al.Prochemotherapeutic effects of antibody against extracellular domain of claudin-4 in bladder cancer［J］.Cancer Lett，2015，369（1）：212-221.

［2］Ma X，Miao H，Jing B，et al.Claudin-4 controls the proliferation，apoptosis，migration and in vivo growth of MCF-7 breast cancer cells［J］.Oncol Rep，2015，34（2）：681-690.

［3］Cuevas ME，Gaska JM，Gist AC，et al.Estrogen-dependent expression and subcellular localization of the tight junction protein claudin-4 in HEC-1A endometrial cancer cells［J］. Int J Oncol，2015，47（2）：650-656.

［4］Alikanoglu AS，Gunduz S，Demirpence O，et al.Expression pattern and prognostic significance of claudin 1，4 and 7 in pancreatic cancer［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2015，16（10）：4387-4392.

［5］Yao Q，Cao S，Li C，et al.Turn a diarrhoea toxin into a receptor-mediated therapy for a plethora of CLDN-4-overexpressing cancers［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，398（3）：413-419.

［6］Cui YF，Liu AH，An DZ，et al.Claudin-4 is required for vasculogenic mimicry formation in human breast cancer cells［J］.Oncotarget，2015，6（13）：11087-11097.

［7］Kwon MJ，Kim SH，Jeong HM，et al.Claudin-4 Over-expression is associated with epigeneticderepressionin gastric carcinoma［J］.Lab Invest，2011，91（11）：1652-1667.

［8］Walther W，Petkov S，Kuvardina ON，et al.Novel Clostridium perfringens enterotoxin suicide gene therapy for selective treatment of claudin-3-and-4-overexpressing tumors［J］.Gene Ther，2012，19（5）：494-503.

［9］Li JG，Bao GQ，Yang XF，et al.Expression of claudin-4 and KLF-5 in gastric carcinoma and their clinical implication［J］.Chin J Diagn Pathol，2014，21（2）：94-99.

［10］Wu J，Peng XJ，Wang X.Expression of E-ca-dherin and claudin-4 in gastric carcinoma and its clinical significances［J］.Chin J Anatomy，2011，34（1）：27-30.

［11］Romanov V，Whyard TC，Waltzer WC，et al.A claudin 3 and claudin 4-targeted Clostridium perfringens protoxin is selectively cytotoxic to PSA-producing prostate cancer cells［J］.Cancer Lett，2014，351（2）：260-264.

［12］張曉波，唐正嚴，齊琳，等.雄激素依賴性和雄激素非依賴性前列腺癌差異膜抗原的篩選［J］.中南大學學報（醫(yī)學版），2012，37（8）：817-823.

［13］Meng J，Mostaghel EA，Vakar-Lopez F，et al.Testosterone regulates tight junction proteins and influences prostatic autoimmune responses［J］.Horm Cancer，2011，2（3）：145-156.

［14］Kwon MJ，Kim SS，Choi YL，et al.Derepression of CLDN3 and CLDN4 during ovarian tumorigenesis is associated with loss of repressive histone modifications［J］.Carcinogenesis，2010，31（6）：974-983.

［15］Hwang TL，Lee LY，Wang CC，et al.Claudin-4 expression is associated with tumor invasion，MMP-2 and MMP-9 expression in gastric cancer［J］.Exp Ther Med，2010，1（5）：789-797.

（收稿：2016-06-22修回：2016-11-03）

Relationships of Expressionof Claudin-4 and Biochemical Recurrence in Prostate Cancer

ZHANG Chunting, LIU Quanqi,XU Lizhen,YU Qian,LUO Rongli,CHEN Liangyou,YANG Qing,ZHU Zaisheng.Department of Urology,Zhejiang University Jinhua Hospital,Jinhua(321000),China

ObjectiveTo investigate the expression of Claudin-4 in prostate cancer tissue and its relationship with biochemical recurrence of prostate cancer.MethodsS-P method was used to detect the expression of Claudin-4 in 79 cases with prostate cancer and 45 cases with benign prostatic hyperplasia,then the relationship between its expression withthe clinical and pathological features was analyzed.Kaplan-Meier survival analysis was used to analyze 5-year biochemical recurrence in patients and the follow-up results was assessed with the expression of Claudin-4.ResultsThe positive rate of Claudin-4 expression in prostate cancer and benign prostatic hyperplasia was64.56%（51/79）and 33.33%（15/45）,respectively,with a significant different between them（P<0.01）.The positive expression rates of Claudin-4 in tissues at TNM stage I～II and III～IV were 46.34%and 84.21%and intissues from the Gleason score<7 and≥7 were 57.14%and 72.97%,both with a significant difference（P<0.05）.In a follow-up of 60 months,45 cases hadbiochemical recurrence,with a recurrence rate of 56.96%;among them,39 cases had positive expression of Claudin-4,4 cases with negative Claudin-4 expression;the difference in recurrence rate was statistically significant（P<0.01）.Kaplan-Meier survival analysis showed that Claudin-4-positive expression patients had a higher 5-year biochemical recurrence rate than patients with Claudin-4 negative expression.Conclusion

Claudin-4 expression was increased in prostate cancer,the increase was related to the clinical stage and Gleason score and biochemical recurrence of prostate cancer.Detection of Claudin-4 may contribute to prognosis of prostate cancer.

prostate cancer;Claudin-4;immunohistochemistry;biochemical recurrence

浙江省金華市科技計劃項目（No.2013-3-043）

浙江大學金華醫(yī)院泌尿外科（金華321000）

朱再生，Tel：18267028028；E-mail：zaishengzhu@126.corn