王佳鑫 段遠勝 岳愷 司海山 董夢麗 周夢倩 王旭東

·基礎研究·

MALAT1通過VHL/β-catenin通路影響口腔鱗狀細胞癌生長侵襲的實驗研究*

王佳鑫 段遠勝 岳愷 司海山 董夢麗 周夢倩 王旭東

目的：探討肺腺癌轉(zhuǎn)移相關轉(zhuǎn)錄因子1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）對口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）生長侵襲的影響及其作用機制。方法：使用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）敲低MALAT1在人OSCC細胞系SCC25、UM1中的表達；CCK-8法、流式細胞術檢測敲低MALAT1表達后OSCC增殖能力、細胞周期及細胞凋亡的變化；細胞遷移實驗及Transwell實驗檢測細胞運動及侵襲能力的變化；蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞周期及凋亡相關蛋白、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）及侵襲相關蛋白、VHL及β-catenin等蛋白表達變化。結果：敲低OSCC中MALAT1表達后，細胞增殖能力顯著下降，細胞周期出現(xiàn)G1/S期阻滯，周期相關蛋白cyclin D1表達減少，P21表達增多；細胞凋亡增多，凋亡相關蛋白cleaved caspase-3、Bax表達增多；且EMT相關蛋白N-cadherin、vimentin表達減少，E-cadherin表達增多，侵襲相關蛋白MMP-2、MMP-9蛋白表達減少，細胞遷移、侵襲能力下降；同時發(fā)現(xiàn)敲低MALAT1表達后VHL蛋白表達增多，β-catenin蛋白表達減少。結論：MALAT1是OSCC生長侵襲的重要調(diào)節(jié)因素，可能通過VHL/β-catenin通路發(fā)揮調(diào)控作用。

口腔鱗狀細胞癌 肺腺癌轉(zhuǎn)移相關轉(zhuǎn)錄因子1 VHL β-catenin

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是頭頸部鱗狀細胞癌中最常見的類型，局部浸潤侵襲能力強，易發(fā)生頸部淋巴結轉(zhuǎn)移，手術難以徹底切除已經(jīng)浸潤周圍組織和發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的腫瘤［1-2］。近30年來，盡管化療、放療和靶向治療等均有長足的發(fā)展，但頭頸部鱗癌的總體預后卻不佳。

肺腺癌轉(zhuǎn)移相關轉(zhuǎn)錄因子1（metastasis associat?ed lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）是長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）家族的重要成員，通過消減雜交法在非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）的研究中被發(fā)現(xiàn)，其長度約為8 700 bp，定位于人類染色體11q13［2］。最新研究顯示，MALAT1在人類多種疾病，尤其是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。MALAT1在食管癌［3］、膠質(zhì)瘤［4］、腎癌［5］等多種人類惡性腫瘤中異常表達，是腫瘤預后不良的因素。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在OSCC中MALAT1高表達與患者預后差密切相關［6］，提示MALAT1可能參與OSCC惡性進展。本研究旨在探討MALAT1對OSCC增殖、凋亡及遷移侵襲能力的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人OSCC細胞株SCC25、UM1（購自美國ATCC生物資源中心），P160、Tscca（由中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所惠贈），Tb3.1（由上海交通大學第九人民醫(yī)院惠贈），蛋白抽提試劑盒（購自上海碧云天生物技術有限公司），Trizol抽提試劑（購自美國Invitrogen公司），RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自日本TAKARA公司），CCK8試劑盒（購自日本同仁公司），細胞周期試劑盒（購自北京天根生化科技有限公司），引物序列（購自上海生物工程公司），Matrigel（購自美國BD公司），細胞凋亡試劑盒（購自美國BD公司），胎牛血清（購自美國Hyclone公司），DMEM/F12培養(yǎng)基、MEM/EBSS培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基（購自美國Hyclone公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人OSCC細胞株SCC25、UM1常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，Tscca培養(yǎng)于含10%胎牛血清的MEM/EBSS培養(yǎng)基，P160、Tb3.1培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育，0.25%胰酶-EDTA消化傳代。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄RT-PCR方法檢測MALAT1在細胞中的表達 用Trizol提取總RNA；參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書加樣并進行反應，產(chǎn)物cDNA置于-20℃保存。引物序列：內(nèi)參β-actin上游：5'-CACAGCAAGAGAGGCATCC-3'；下游：5'-CTGGGGTGTTGAAGGTCTC-3'。MALAT1上游：5'-GACGGAGGTTGAGATGAAGC-3'；下游：5'-AT TCGGGGCTCTGTAGTCCT-3'。MALAT1的PCR條件：95℃30s，95℃5s，60℃34 s，共進行40次循環(huán)。

1.2.3 MALAT1 siRNA轉(zhuǎn)染 將處于對數(shù)生長期的SCC25、UM1細胞常規(guī)消化后接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，12～24 h后（融合度60%～80%），加入無血清DMEM/F12，分組進行轉(zhuǎn)染。實驗共分為2組：1）陰性對照組：10 μL脂質(zhì)體+10 μL無意義對照序列RNA（正義序列：5'-UUC UUCGAACGUGUCACGUTT-3'；反義序列：5'-ACGUGA CACGUUCGGAGAATT-3'）；2）MALAT1 siRNA組：10 μL脂質(zhì)體+10 μL MALAT1 siRNA（正義序列：5'-GAGGUG UAAAGGGAUUUAUTT-3'；反義序列：5'-AUAAAUCCC UUUACACCUCTTT-3'）。轉(zhuǎn)染6 h后換為10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 CCK-8檢測細胞增殖能力 96孔板每孔鋪5× 103個經(jīng)轉(zhuǎn)染過的細胞，分別在0、24、48、72 h加入10 μL CCK-8溶液，混勻，細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，酶標儀450 nm波長測吸光度值。

1.2.5 流式細胞術PI單染檢測細胞周期 收集轉(zhuǎn)染48 h后的細胞用預冷生理鹽水洗滌細胞1次，將細胞重懸于體積分數(shù)75%乙醇溶液中，在4℃冰箱過夜。然后1 500 r/min離心5 min去除乙醇溶液并用生理鹽水洗滌細胞1次，細胞重懸至200 μL生理鹽水，加10 mg/mL PI染液1 μL和10 mg/mL RNase A溶液1 μL，避光4℃孵育30 min，上流式細胞儀進行檢測。

1.2.6 流式細胞術Annexin V-FITC/PI雙染分析細胞凋亡 將轉(zhuǎn)染48 h后的細胞用胰酶消化細胞，取（5～6）×105細胞加入500 μL 1×Binding Buffer、5 μL AnnexinV-FITC和5 μL PI，輕輕混勻室溫下避光15 min后上機檢測。同時以不加AnnexinV-FITC及PI的細胞懸液作為陰性對照。

1.2.7 Transwell侵襲實驗 將轉(zhuǎn)染48 h后的細胞進行消化，重懸于無血清DMEM/F12培養(yǎng)液中，接種到Matrigel覆蓋的Transwell上層小室內(nèi)，小室底部為含血清培養(yǎng)基500 μL。24 h后取出小室，多聚甲醛固定3 min，結晶紫染色5 min，倒置顯微鏡下觀察。隨機取3個視野拍照計數(shù)，計算每個視野內(nèi)的穿膜細胞數(shù)。

1.2.8 細胞遷移實驗 將轉(zhuǎn)染48 h后的細胞進行消化，重懸于無血清DMEM/F12培養(yǎng)液中，接種到Tran?swell上層小室內(nèi)，小室底部為含血清培養(yǎng)基500 μL。8 h后取出小室，多聚甲醛固定3 min，結晶紫染色5 min，倒置顯微鏡下觀察。隨機取3個視野拍照計數(shù)，計算每個視野內(nèi)的穿膜細胞數(shù)。

1.2.9 蛋白質(zhì)印跡法檢測相關蛋白的表達 轉(zhuǎn)染48 h后提取總蛋白，測定蛋白濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，冰浴下300 mA轉(zhuǎn)膜120 min。37℃封閉1 h，剪膜后分別加入一抗4℃孵育過夜，復溫1 h，相應加入辣根酶標記的小鼠二抗或兔二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h。加發(fā)光液后用成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶的表達。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 實時定量PCR篩選高表達MALAT1 OSCC細胞系并驗證siRNA敲低效果

實時定量PCR結果顯示，P160、Tb3.1、UM1、SCC25和Tscca 5種OSCC細胞系中，UM1和SCC25高表達MALAT1；篩選UM1和SCC25進行體外細胞實驗。轉(zhuǎn)染MALAT1 siRNA 48 h后，UM1、SCC25細胞系MALAT1的表達較陰性對照組明顯降低（圖1）。

圖1 實時定量PCR篩選高表達MALAT1的OSCC細胞系并驗證siR?NA的敲低效果Figure 1 Effect of knockdown with MALAT1 siRNA verified by real-time polymerase chain reaction assay

2.2 敲低MALAT1表達后，細胞增殖能力、細胞周期及相關蛋白表達變化

CCK-8實驗結果顯示，經(jīng)轉(zhuǎn)染MALAT1 siRNA的SCC25、UM1細胞，其增殖能力受到顯著抑制（圖2，P<0.05）。運用流式細胞術檢測處理前后細胞周期的改變，發(fā)現(xiàn)SCC25細胞系G1期細胞比例由（41.02± 1.66）%增加至（61.48±1.66）%；S期細胞比例由（49.92±1.17）%降低至（36.02±1.54）%；UM1細胞系G1期細胞比例由（44.58±1.00）%增加至（59.63±0.51）%；S期細胞比例由（48.18±1.82）%降低至（32.49± 1.51）%。G0/G1期細胞增多，S期減少，細胞出現(xiàn)G1/S期阻滯，且差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。同時Western blot結果表明SCC25、UM1細胞系細胞周期素cyclin D1蛋白表達較陰性對照組降低，細胞周期抑制蛋白P21表達較陰性對照組升高（圖3）。

圖2 CCK-8法檢測細胞增殖能力變化Figure 2 Cell counting kit-8 assay indicated the cell proliferation change

2.3 敲低MALAT1表達后細胞凋亡及相關蛋白表達變化

流式細胞儀檢測陰性對照組與MALAT1 siRNA組細胞凋亡的變化，SCC25、UM1細胞系凋亡率分別由（4.43± 0.51）%、（4.07±0.90）%增加到（10.40±0.60）%、（11.67± 0.91%），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。同時Western blot法發(fā)現(xiàn)cleaved caspase-3及促凋亡蛋白Bax的表達水平較陰性對照組明顯上調(diào)（圖4）。

2.4 敲低MALAT1表達后細胞遷移侵襲能力及EMT相關蛋白表達的變化

細胞遷移實驗及Transwell實驗結果顯示，SCC25、UM1細胞系轉(zhuǎn)染MALAT1 siRNA 48 h后各隨機計數(shù)3個視野，與陰性對照組比較，MALAT1 siRNA組穿膜細胞數(shù)均明顯減少，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。E-cadherin蛋白表達上調(diào)，N-cadherin及vimentin蛋白表達下調(diào)，侵襲相關蛋白MMP-2、MMP-9表達下調(diào)（圖5）。

2.5 敲低MALAT1表達后Western blot法檢測VHL、β-catenin蛋白表達變化

轉(zhuǎn)染MALAT1 siRNA 48 h后，SCC25、UM1細胞系中VHL蛋白表達上調(diào)，β-catenin蛋白表達下調(diào)（圖6），提示MALAT1在OSCC中，可能通過VHL調(diào)控βcatenin通路。

圖3 MALAT1 siRNA處理后細胞周期及相應蛋白表達變化Figure 3 Changes in the cell cycle and the expression of related proteins after cell infection by MALAT1 siRNA

圖4 MALAT1 siRNA處理后細胞凋亡及相關蛋白表達變化Figure 4 Changes in cell apoptosis and the expression of related proteins after cell infection by MALAT1 siRNA

圖5 MALAT1 siRNA處理細胞后細胞遷移侵襲能力及EMT相關蛋白表達的變化Figure 5 Changes in cell migration and invasion and the expression of EMT-associated protein after cell infection by MALAT1 siRNA

圖6 MALAT1 siRNA處理細胞后VHL、β-catenin通路蛋白的表達變化Figure 6 Western blot analysis of the protein expression levels of VHL and β-catenin

3 討論

lncRNA是長度介于200 bp～10 kb之間的一類轉(zhuǎn)錄本，廣泛參與機體的生理和病理過程，從轉(zhuǎn)錄到mRNA剪切、RNA修飾直至翻譯，幾乎每一步基因活動周期都受到lncRNA的影響［7］。MALAT1是最早發(fā)現(xiàn)的lncRNA之一，在乳腺癌、NSCLC、肝癌、腎細胞癌、宮頸癌、結腸癌等多種人類惡性腫瘤中存在過表達或突變現(xiàn)象，與腫瘤的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等生物學行為密切相關［8］。本課題組前期對96例OSCC標本分析發(fā)現(xiàn)，MALAT1在OSCC組織中表達明顯高于癌旁組織和正?？谇唤M織，并且高表達MALAT1與患者預后差密切相關［6］，提示MALAT1與OSCC的惡性進展相關，但其發(fā)揮作用的具體機制尚不清楚。

有研究認為，腫瘤惡性進展是一個涉及多因素、多信號通路參與的復雜生物學過程［9］，這些因素導致腫瘤細胞周期改變、凋亡減少、極性和表面分子蛋白改變、發(fā)生細胞重塑、運動遷移能力增強，進而啟動腫瘤惡性進展［2］。近年來的研究顯示，MALAT1可在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后等多層面發(fā)揮對蛋白質(zhì)表達的調(diào)控作用，進而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展［10-11］。骨肉瘤細胞中高表達MALAT1通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路增強細胞的增殖能力［12］；在肝細胞肝癌中MALAT1通過上調(diào)SRSF1并且激活mTOR促進腫瘤發(fā)展［13］。本研究結果顯示，敲低OSCC細胞中MALAT1表達后，G1期細胞增多，S期細胞減少，細胞周期出現(xiàn)阻滯，細胞增殖能力顯著降低；同時可見細胞凋亡增多。表明高表達MALAT1參與調(diào)控OSCC細胞生長增殖。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的前期事件，本課題組前期實驗已證實OSCC中存在EMT現(xiàn)象，且OSCC的EMT促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，是預后不良的重要因素［14］。膽囊癌中，MALAT1通過激活ERK/MAPK通路促進膽囊癌細胞轉(zhuǎn)移［15］；NSCLC中MALAT1通過調(diào)控腫瘤細胞EMT過程影響腫瘤腦轉(zhuǎn)移［16］。本研究結果顯示，敲低MALAT1在OSCC細胞中的表達后，E-cadherin表達上調(diào)，N-cadherin、vimentin表達下調(diào)，OSCC的EMT過程發(fā)生逆轉(zhuǎn)，提示OSCC中MALAT1參與調(diào)控OSCC的EMT過程。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，隨OSCC的MALAT1表達水平的降低，侵襲相關蛋白MMP-2、MMP-9表達下調(diào)，同時可見OSCC細胞遷移運動能力和侵襲能力減弱，說明MALAT1表達影響OSCC的遷移侵襲過程。由此可見，在OSCC中，高表達MALAT1可通過誘導EMT過程促進OSCC細胞的遷移侵襲。

惡性腫瘤中MALAT1通過多種途徑發(fā)揮調(diào)控作用。MALAT1作為SC35剪接結構域的一個組成成分，通過SC35區(qū)域作用影響前體mRNA的剪接，進而調(diào)控基因表達［10］；其次，MALAT1亦可通過與多種蛋白結合發(fā)揮基因表達調(diào)控作用，MALAT1與多梳抑制復合物1（PRC1）的CBX4亞基結合導致CBX脫甲基化，調(diào)控生長控制基因的沉默或激活，從而影響細胞的生長活動；亦或與多梳抑制復合物2（PRC2）EZH2亞基結合，募集EZH2對下游靶基因發(fā)揮表觀遺傳學調(diào)控功能［17］。另外，MALAT1參與調(diào)控信號轉(zhuǎn)導通路，影響腫瘤進展。Wnt/β-catenin通路在腫瘤的惡性進展中功能作用已被證實，與腫瘤細胞增殖、凋亡、分化、遷移及侵襲等多種生物學行為密切相關，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［18］。肝癌、結直腸癌、腎癌等多種惡性腫瘤均存在MALAT1介導Wnt/β-catenin信號通路誘導腫瘤EMT促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)機制。本課題組前期研究證實，在OSCC標本中β-catenin高表達，與OSCC的EMT和淋巴結轉(zhuǎn)移相關。本研究結果顯示，敲低MALAT1表達后可見β-catenin表達水平下降，β-catenin通路下游靶基因如cyclin D1，E-cadherin的表達水平也發(fā)生相應變化，推測MALAT1可能通過β-catenin通路發(fā)揮下游調(diào)控作用；敲低MALAT1表達，β-catenin表達降低的同時可見VHL表達升高，提示MALAT1同時調(diào)控VHL、β-catenin表達水平。正常情況下，β-catenin在無上游刺激時可被Axin/APC降解復合物磷酸化，隨后經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑被降解；VHL作為E3泛素連接酶的組成部分，是調(diào)節(jié)β-catenin轉(zhuǎn)錄活性與亞細胞定位的重要分子，VHL蛋白能通過激活泛素降解通路降解β-catenin［19］。本課題組前期實驗證明［20］，VHL在OSCC組織中低表達，恢復OSCC的VHL表達能夠顯著抑制胞核及胞質(zhì)中β-catenin表達水平。因此MALAT1可能通過調(diào)控VHL/β-catenin通路影響OSCC細胞生長侵襲過程。

綜上所述，MALAT1在OSCC中高表達，調(diào)控OS?CC增殖、凋亡、EMT及侵襲等過程，這一作用可能是通過VHL/β-catenin通路實現(xiàn)的。更深入的作用機制還有待于進一步研究和探索。

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（2017-03-03收稿）

（2017-04-05修回）

（編輯：孫喜佳 校對：張亻 抿）

Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1 modulates the growth and invasion of oral squamous cell carcinoma through the VHL/β-catenin pathway in vitro

Jiaxin WANG,Yuansheng DUAN,Kai YUE,Haishan SI,Mengli DONG,Mengqian ZHOU,Xudong WANG

Xudong WANG;E-mail:wxd.1133@163.com Department of Otorhinolaryngology and Maxillofacial Oncology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital;National Clinical Research Center for Cancer;Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin;Tianjin's Clinical Research Center for Cancer; Tianjin 300060,China This work was supported by National Natural Science foundation of China(No.81672684)and Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital Scientific Fund(No.1601)

Objective:To investigate the effect and mechanism of metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1(MALAT1)in modulating the growth and invasion of oral squamous cell carcinoma(OSCC).Methods:MALAT1 siRNA was transfected into SCC25 and UM1 human OSCC cell lines.Cell counting kit-8 assay and flow cytometry were used to test the proliferation,cell cycle,and apoptosis of the cells after infection by the MALAT1 siRNA.Cell invasive and migration ability were evaluated by Transwell assay and cell migration assay,respectively.The expression levels of the proteins VHL and β-catenin,which regulate the cell cycle,apoptosis,epithelialmesenchymal transition,invasion,and migration,were examined by Western blot assay.Results:After down regulation of the MALAT1 expression in the cells,the proliferation was inhibited,and G1/S arrest was triggered.The expression of cyclin D1 was down regulated and that of P21 was up regulated.Cell apoptosis increased,and the expression levels of Bax and cleaved caspase-3 were up regulated. Migration and invasion were attenuated.The expression levels of N-cadherin,vimentin,and MMP-2/9 were down regulated,and the expression of E-cadherin was up regulated in the cells after the knockdown of MALAT1.These findings show significant differences between the transfected cells and negative-control cells.We found that VHL expression was up regulated and that of β-catenin was down regulated.Conclusion:MALAT1 is an important factor for the growth and invasion of OSCC.MALAT1 possibly modulates these processes through the VHL/β-catenin signal pathway.

oral squamous cell carcinoma,metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,VHL,β-catenin

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.09.246

天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院頜面耳鼻喉腫瘤科，國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學研究中心（天津市300060）

*本文課題受國家自然科學基金項目（編號：81672684）和天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院科研基金項目（編號：1601）資助

王旭東 wxd.1133@163.com

王佳鑫 專業(yè)方向為頭頸鱗癌的外科治療。

E-mail：claireyoo@163.com