陳瑞俊， 李蔚然， 黃乙涓 ， 劉建中， 李亮平,2

(1. 中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室，廣東 廣州 510080；2. 暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院，廣東 廣州 510632)

利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除小鼠ES細(xì)胞H2-K1基因*

陳瑞俊1， 李蔚然1， 黃乙涓1， 劉建中1， 李亮平1,2

(1. 中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室，廣東 廣州 510080；2. 暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院，廣東 廣州 510632)

利用CRISPR/Cas9和ES細(xì)胞技術(shù)，在小鼠ES細(xì)胞株上敲除小鼠H2-K1基因，為研發(fā)MHCⅠ類基因人源化小鼠打下基礎(chǔ)。設(shè)計(jì)了兩個(gè)單向?qū)NA(singleguideRNA，sgRNA)，分別靶向H2-K1基因的外顯子2和外顯子3。以pX330質(zhì)粒為骨架構(gòu)建表達(dá)sgRNA的打靶載體。用電穿孔轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建好的質(zhì)粒以及pSUPER-puro共同導(dǎo)入小鼠ES細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)基因敲除。在嘌呤霉素篩選后，利用PCR初步檢測靶基因的敲除情況，再通過測序以及流式細(xì)胞分析確定敲除H2-K1基因的小鼠ES細(xì)胞。結(jié)果顯示：利用CRISPR/Cas9技術(shù)，小鼠ES細(xì)胞的H2-K1基因被成功敲除，通過PCR檢測到4個(gè)克隆為H2-K1單等位基因敲除(19.0%)，2個(gè)克隆為H2-K1雙等位基因敲除(9.5%)。經(jīng)過測序以及流式細(xì)胞分析，2株小鼠ES細(xì)胞被確認(rèn)為H2-K1雙等位基因敲除。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)得到H2-K1基因敲除的小鼠ES細(xì)胞株, 為MHCⅠ類基因的敲除和置換提供了參考。

H2-K1 基因；CRISPR/Cas9技術(shù)；mES細(xì)胞；基因敲除

腫瘤免疫治療是通過生物制劑直接或間接地誘發(fā)或者增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答以及破壞腫瘤的免疫抑制效應(yīng)，達(dá)到抑制腫瘤生長或者直接殺傷腫瘤細(xì)胞的效果[1]。腫瘤免疫治療的進(jìn)展之一是特異性T細(xì)胞免疫治療，而T細(xì)胞腫瘤免疫法中一個(gè)很重要的進(jìn)展是T細(xì)胞受體(Tcellreceptor，TCR)基因治療的發(fā)展。TCR基因治療的主要目的是將病人原代T細(xì)胞改造成為抗腫瘤或抗感染性疾病的T細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對疾病的治療[2]。TCR基因治療的主要瓶頸是如何獲得高親和力的抗腫瘤TCR基因。李亮平等[3]構(gòu)建了整個(gè)人的TCR-HLA(humanleukocyteantigen)基因位點(diǎn)的基因人源化小鼠，并利用該小鼠模型成功地建立起可以分離得到高親和力治療性TCR分子的基礎(chǔ)系統(tǒng)。TCR-HLA小鼠的構(gòu)建需要實(shí)現(xiàn)HLA基因的人源化。HLA基因?yàn)槎嗟任换颍袑⒔?0種常用的HLA等位基因。這些等位基因?qū)⒈挥糜跇?gòu)建HLA基因人源化小鼠，為腫瘤免疫治療的研發(fā)提供了極為重要的基礎(chǔ)，和更廣泛的應(yīng)用群體。

小鼠的MHC(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)基因稱為H-2(histocompatibility-2)基因，人的MHC基因稱為HLA基因。小鼠H-2Ⅰ類基因包括：H-2K、H-2D和H-2L等，在一些小鼠中，H-2L基因沒有功能。H2-K1基因是H-2K基因的一種單體型(haplotype)。作為MHCⅠ類分子，其表達(dá)產(chǎn)物H-2Kb能將內(nèi)源性抗原肽(如腫瘤抗原肽)提呈到細(xì)胞表面，供T細(xì)胞的TCR識(shí)別[4-5]。1993年，科學(xué)家證實(shí)，在HLA轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，如果小鼠自身H-2Ⅰ類分子所限制的免疫應(yīng)答被抑制，HLAⅠ類分子所限制的免疫應(yīng)答會(huì)很活躍而且多樣[6]。根據(jù)這一結(jié)果，科學(xué)家開始研發(fā)不表達(dá)H-2Ⅰ類分子而只表達(dá)HLAⅠ類分子的基因工程小鼠。一種策略是：選取H-2L基因沒有功能的小鼠，通過基因敲除分別得到H2-K、H2-D單基因敲除的小鼠；然后讓這些小鼠交配得到H2-K、H2-D雙基因敲除(即H-2Ⅰ類基因被敲除)的小鼠。H-2Ⅰ類基因被敲除的小鼠和HLAⅠ類轉(zhuǎn)基因小鼠交配，最后得到H-2Ⅰ類基因敲除、HLAⅠ類基因人源化小鼠[7]。實(shí)驗(yàn)證明，與H-2Ⅰ類基因沒有被敲除的HLAⅠ類轉(zhuǎn)基因小鼠相比，這些小鼠體內(nèi)HLAⅠ類分子限制的免疫應(yīng)答被增強(qiáng)[8-10]。這些H-2Ⅰ類分子缺陷的HLAⅠ類基因人源化小鼠在腫瘤免疫治療、病毒疫苗、基因治療等領(lǐng)域中有重要的應(yīng)用[7,11,12]。

CRISPR/Cas9技術(shù)來源于細(xì)菌和古細(xì)菌中的一種干擾破壞入侵的外源性遺傳物質(zhì)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，即CRISPR(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)/Cas(CRISPR-associatedproteins)9系統(tǒng)。該系統(tǒng)的主要工作組分包括：Cas9蛋白，crRNA(CRISPRRNA)以及tracrRNA(trans-activatingcrRNA)。在破壞外源性遺傳物質(zhì)時(shí)，tracrRNA與crRNA結(jié)合形成二聚體并結(jié)合在靶序列上，和Cas9蛋白一起介導(dǎo)對靶序列的切割[13]。而CRISPR/Cas9技術(shù)對該系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化，將crRNA和tracrRNA融合成一個(gè)sgRNA，由sgRNA與Cas9蛋白介導(dǎo)DNA的靶向切割[14]。無論是CRISPR/Cas9系統(tǒng)還是改造后的CRISPR/Cas9技術(shù)，其作用的靶序列附近需要有幾個(gè)保守的堿基被稱為protospacer-adjacentmotif(PAM)，PAM通常是:5′-NGG-3′(N為任意一個(gè)堿基)[15-16]?，F(xiàn)在，CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)被用于對細(xì)胞以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基因組DNA進(jìn)行基因編輯[14,17-18]。

本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了穩(wěn)定敲除H2-K1基因的小鼠ES細(xì)胞(以下簡稱mES細(xì)胞)株,可通過此細(xì)胞株得到H2-K1基因敲除的小鼠，為進(jìn)一步研發(fā)有重大應(yīng)用價(jià)值的免疫基因人源化小鼠提供有效的工具。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、質(zhì)粒和主要試劑

129小鼠品系胚胎干細(xì)胞 (mouseembryonicstem,mES)、懷孕13.5d的ICR小鼠品系胚胎成纖維細(xì)胞(mouseembryofibroblast,MEF)，購自賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司。pSuperpuro質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存。pX330質(zhì)粒，購自Addgene。

大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、氨芐青霉素，購自廣州鼎國生物技術(shù)有限公司。1kbDNALadder，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、pGH平末端PCR產(chǎn)物克隆試劑盒和質(zhì)粒小量制備試劑盒，購自上海捷瑞生物工程有限公司。FastDigestBbsⅠ限制性內(nèi)切酶，購自Fermentas。去內(nèi)毒素質(zhì)粒中量制備試劑盒，購自Promega公司。基因組DNA提取試劑盒(DNeasyBlood&TissueKit)，購自Qiagen公司。QuickTMLigationKit、T4PolynucleotideKinase(T4PNK)，購自NewEnglandBiolabs公司。電轉(zhuǎn)試劑盒，AmaxaTMP3PrimaryCell4D-NucleofectorTMXKitL，購自Lonza公司。PrimerStarMax(Takara公司)，購自廣州瑞真生物公司。寡核苷酸單鏈合成、PCR引物合成和質(zhì)粒測序服務(wù)，購自Invitrogen公司。流式抗體：FITCMouseAnti-MouseH-2Kb(Isotype:MouseIgG2a,κ)、FITCMouseAnti-MouseH-2Db(Isotype:MouseIgG2b,κ)、FITCMouseIgG2a,κIsotypeControl以及FITCMouseIgG2b,κIsotypeControl，購自BDBioscience公司。胎牛血清、青鏈霉素、嘌呤霉素、DMEM、Trypsin-EDTA、谷氨酰胺(100×)，β-巰基乙醇，非必需氨基酸(100×)，丙酮酸鈉，購自LifeTechnologies。白血病抑制因子(Leukemiainhibitoryfactor，LIF)，購自Millipore。二甲基亞砜(Dimethylsulfoxide，DMSO)、明膠、絲裂霉素C，購自Sigma公司。

1.2sgRNA靶點(diǎn)的選擇及其序列的合成

利用哈佛大學(xué)張峰實(shí)驗(yàn)室(ZhangFengLab,MIT)提供的網(wǎng)絡(luò)工具CRISPERDESIGN(http://crispr.mit.edu)設(shè)計(jì)H2-K1基因的向?qū)NA(sgRNA)靶點(diǎn)。根據(jù)H2-K1基因的結(jié)構(gòu)，分別在其外顯子2和外顯子3上各設(shè)計(jì)一個(gè)sgRNA靶點(diǎn)。根據(jù)質(zhì)粒pX330中BbsⅠ酶切位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，在正義鏈寡核苷酸(oligo)序列的5′端添加“CACC”，并在反義鏈寡核苷酸序列的5′端添加“AAAC”, 這與BbsⅠ酶切后形成的黏性末端互補(bǔ)(圖1:A)。為增強(qiáng)U6啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，在其起始轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)需要添加堿基G[19]。如果正義鏈寡核苷酸序列的“CACC”后面的堿基不是“G”，則需要添加堿基“G”，并在反義鏈寡核苷酸序列的3′端添加堿基“C”。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建

首先，用BbsⅠ內(nèi)切酶切割質(zhì)粒pX330(1～2 μg), 電泳后，按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書進(jìn)行切膠回收。將設(shè)計(jì)的單鏈oligo退火形成雙鏈，退火體系：1 μL，oligo 1(100 μmol/L)；1 μL，oligo 2(100 μmol/L)；1 μL，10×T4 Ligation Buffer (NEB)；6.5 μL，ddH2O；0.5 μL，T4 PNK (NEB)；退火程序：37 ℃，30 min；95 ℃，5 min；-6 ℃/min，降溫至25 ℃。將退火形成的雙鏈DNA連接到經(jīng)BbsⅠ酶切回收后的pX330載體中，連接體系：線性化的pX330，50 ng；退火產(chǎn)物經(jīng)1∶200稀釋，后取1 μL稀釋液；2×Quickligation Buffer，5 μL；補(bǔ)水至10 μL；加入1 μL Quick Ligase后，室溫連接10 min。將連接產(chǎn)物在42 ℃轉(zhuǎn)化到DH 5α感受態(tài)細(xì)胞中, 用含有氨芐青霉素的瓊脂糖平板進(jìn)行篩選過夜, 挑取單克隆,提取小制備質(zhì)粒DNA并通過測序驗(yàn)證插入序列的正確性。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和藥篩

MEF細(xì)胞培養(yǎng)條件：DMEM+15%(w)胎牛血清+ 1%(w)谷氨酰胺+1 mmol/L丙酮酸鈉+ 1%(w)非必需氨基酸+100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素。37 ℃、φ=5% CO2恒溫培養(yǎng)。

用絲裂霉素C處理MEF細(xì)胞：往MEF培養(yǎng)基中加入絲裂霉素C，使其質(zhì)量濃度為10 μg/ mL。待MEF鋪板率達(dá)到90%以上后，吸除培養(yǎng)基，加入含絲裂霉素C的MEF培養(yǎng)基。37 ℃、φ=5% CO2恒溫培養(yǎng)2 h后，吸除培養(yǎng)基，用PBS洗3遍。此時(shí)，MEF細(xì)胞可用普通MEF培養(yǎng)基培養(yǎng)；也可以消化下來，種在用明膠處理的培養(yǎng)皿中，用于培養(yǎng)mES細(xì)胞。

明膠處理培養(yǎng)皿：往100 mm培養(yǎng)皿中加入w=0.1%的無菌的明膠溶液，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，放置2 h，然后徹底除去明膠溶液。

mES細(xì)胞的培養(yǎng)條件：用DMEM+15%(w)胎牛血清+0.1 mmol/Lβ-巰基乙醇+106IU/mL LIF(白血病抑制因子)+1%(w)谷氨酰胺+1 mmol/L丙酮酸鈉+1%(w)非必需氨基酸+100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)mES細(xì)胞。在明膠處理好的培養(yǎng)皿中種上MEF細(xì)胞，然后換成將mES細(xì)胞培養(yǎng)基，將mES細(xì)胞種在皿中，37 ℃、φ=5% CO2恒溫培養(yǎng)。

mES細(xì)胞去除MEF細(xì)胞處理：在電轉(zhuǎn)和鑒定打靶的mES時(shí)需要去除MEF。用胰酶將mES細(xì)胞消化下來。加入培養(yǎng)基終止消化，離心去除胰酶上清后，用mES培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到明膠處理過的培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、φ=5% CO2恒溫培養(yǎng)20～30 min，使MEF貼壁生長。然后，輕輕吸出懸液，離心收集懸浮的mES細(xì)胞。如果MEF細(xì)胞沒有除盡，可在mES克隆長出來后，可以重復(fù)上述步驟去除MEF細(xì)胞，直到可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

mES的CRISPR/Cas9基因打靶：培養(yǎng)129-mES細(xì)胞，使其保持未分化狀態(tài)。未分化mES細(xì)胞團(tuán)濃密，呈橢圓形或圓形且邊界清晰明顯；在還沒有出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)融合時(shí)，用胰酶將ES細(xì)胞消化下來。經(jīng)過去除MEF細(xì)胞的處理后，按照“AmaxaTM4D-NucleofectorTMProtocol”中小鼠ES電轉(zhuǎn)化法的使用說明進(jìn)行電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)程序選用4D-NucleofectorTMSystem中已設(shè)定的小鼠ES細(xì)胞電轉(zhuǎn)程序。收集4×106個(gè)細(xì)胞，用電轉(zhuǎn)緩沖液重懸；并加入7.5 μg的pX330-H2K1-Exon2，7.5 μg的pX330-H2K1-Exon3，5 μg的pSuper-puro，1 μg的pmaxGFP。電轉(zhuǎn)36 h后，給細(xì)胞換上含1 μg/mL嘌呤霉素的mES細(xì)胞培養(yǎng)基，進(jìn)行藥篩，在藥篩18 h時(shí)，補(bǔ)充3×105個(gè)經(jīng)絲裂霉素C處理的MEF細(xì)胞。藥篩36 h后，給細(xì)胞換上普通的mES細(xì)胞培養(yǎng)基，并再次補(bǔ)充5×105個(gè)經(jīng)絲裂霉素C處理的MEF細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 mES細(xì)胞克隆的擴(kuò)增和基因組DNA的提取

mES細(xì)胞集落形成后，挑取單克隆，進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)以及基因型鑒定。每個(gè)mES細(xì)胞單克隆在擴(kuò)增后都分成兩份，一份用于凍存，一份用于擴(kuò)增細(xì)胞。擴(kuò)增的ES細(xì)胞，去MEF細(xì)胞后提基因組DNA進(jìn)行鑒定。提取基因組DNA時(shí)，先消化收集細(xì)胞(每個(gè)樣品約收集6×105個(gè)細(xì)胞)，并用PBS洗兩次，按照基因組DNA提取試劑盒說明書的操作步驟提取基因組DNA。

1.6 mES細(xì)胞基因打靶的鑒定

用PCR法擴(kuò)增打靶區(qū)域的DNA序列，根據(jù)靶點(diǎn)的位置，設(shè)計(jì)基因敲除鑒定引物：H2-K1-(2,3)-F：CGGATCCGGTGGCGCGATCACCAAGAACCAATC； H2-K1-(2,3)-R：GGAATTCCTGACACATTCAGCAGGACAGGAGTC。

PCR條件如下: Primer Star Max 10 μL, 基因組DNA 1 μL(60 ng), Primers(F+R)(2 μmol/L) 2 μL, 補(bǔ)水至20 μL。程序如下: 第1個(gè)循環(huán)，95 ℃，變性3 min。95 ℃,變性30 s；57 ℃,退火45 s；72 ℃,延伸1 min 45 s,共35個(gè)循環(huán)。最后72 ℃延伸5 min, 4 ℃保存。取反應(yīng)后產(chǎn)物5 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

對發(fā)生了基因打靶的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分子克隆和測序：用基因組DNA做PCR(50 μL×8)，對需要檢查的條帶進(jìn)行膠回收。用pGH平末端PCR產(chǎn)物克隆試劑盒將PCR目的條帶連接入載體，連接反應(yīng)體系：pGH Blunt end Vector (25 ng/μL)，2 μL；插入片段(50 ng/μL)，1.5 μL(分子數(shù)vector:insert大約為1∶5)；2×quick ligation solution，5 μL；ddH2O，1.5 μL；16 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，接種在含有氨芐青霉素的瓊脂糖平板上。37 ℃培養(yǎng)過夜，長出菌落后，挑取單克?。粨u菌，提質(zhì)粒后送樣測序。

1.7 基因打靶細(xì)胞表型鑒定

mES細(xì)胞分化培養(yǎng)：對確定有H2-K1基因敲除的ES細(xì)胞克隆進(jìn)行分化培養(yǎng)。首先復(fù)蘇凍存的拷貝，去除mES細(xì)胞中的MEF細(xì)胞，然后將mES細(xì)胞接種在沒有經(jīng)明膠處理的培養(yǎng)皿中，37 ℃、φ=5%CO2恒溫培養(yǎng)。用mES細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)幾天以擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)量，然后，用mES細(xì)胞分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)，分化的細(xì)胞多數(shù)呈纖維狀。

細(xì)胞表面H-2Kb分子表達(dá)的檢測：在大部分mES細(xì)胞分化后，消化收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為106～107個(gè)/ mL，用小鼠MHC分子單克隆抗體(anti-mouse H-2Kb)檢測H-2Kb分子的表達(dá)。取流式抗體(每種流式抗體各2 μL)加入100 μL的待測細(xì)胞懸液中，4 ℃，避光反應(yīng)30 min。反應(yīng)完畢后，離心收集細(xì)胞，用PBS洗細(xì)胞后，加入100 μL PBS重懸細(xì)胞，然后上樣檢測以及分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 CRSPR/Cas9基因打靶載體的設(shè)計(jì)與構(gòu)建

利用哈佛大學(xué)張峰實(shí)驗(yàn)室提供的網(wǎng)絡(luò)工具，在H2-K1基因的外顯子2和外顯子3上各設(shè)計(jì)了一個(gè)sgRNA，并命名為H2-K1-Exon2-sgRNA和H2-K1-Exon3-sgRNA(圖1:B)。兩個(gè)靶位點(diǎn)之間的序列長度為0.56kb。

根據(jù)pX330質(zhì)粒中BbsⅠ酶切位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)以及U6啟動(dòng)子的特性，設(shè)計(jì)了需要合成的寡核苷酸鏈(表1)。通過退火使寡核苷酸單鏈形成雙鏈, 然后將退火產(chǎn)物克隆于pX330質(zhì)粒的BbsⅠ酶切位點(diǎn)上, 得到pX330-H2-K1-Exon2和pX330-H2-K1-Exon3載體；測序后，擴(kuò)增正確的質(zhì)粒,用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 小鼠ES細(xì)胞H2-K1基因打靶

消化mES細(xì)胞并經(jīng)過去MEF細(xì)胞的處理后，用AmaxaTMP3PrimaryCell4D-NucleofectorTMXKitL電轉(zhuǎn)試劑盒，將pX330-H2K1-Exon2，pX330-H2K1-Exon3，pSuper-puro，pmaxGFP共4個(gè)載體共轉(zhuǎn)染mES細(xì)胞。電轉(zhuǎn)36h后，在熒光顯微鏡下可觀察到電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞表達(dá)綠色熒光，表示電轉(zhuǎn)染成功，用含1μg/mL嘌呤霉素的mES細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行藥篩。

警務(wù)指揮系統(tǒng)可以很好地處理在交通中產(chǎn)生的應(yīng)急情況，得到出現(xiàn)事故路線的交通情況和車輛狀態(tài)，從而將信息及時(shí)地發(fā)布給相關(guān)人員，避免交通出現(xiàn)進(jìn)一步擁堵。公共交通服務(wù)系統(tǒng)可以為出行者進(jìn)行線路的規(guī)劃，確定合適的出行方式，從而確保其順利出行。

篩選后，換普通的mES細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)mES細(xì)胞，5d后挑取mES細(xì)胞單克隆并培養(yǎng)擴(kuò)增。mES細(xì)胞擴(kuò)增后，取一部分用于去MEF細(xì)胞、提取基因組DNA并做PCR鑒定H2-K1基因是否被敲除。以野生型的mES細(xì)胞(wildtypemEScell)為對照組，標(biāo)記為：WT。對于野生型DNA、僅發(fā)生小片段缺失或插入的DNA，其PCR條帶為1.43kb；對于在兩靶點(diǎn)間發(fā)生整個(gè)片段敲除的DNA，其PCR條帶為0.87kb。本實(shí)驗(yàn)通過PCR鑒定了21個(gè)克隆(圖2)，其中,#3、#5、#9、#20，共4個(gè)克隆都在一個(gè)等位基因上發(fā)生兩靶點(diǎn)間的片段敲除(19.0%)；#12、#17，共2個(gè)克隆在雙等位基因上都發(fā)生兩靶點(diǎn)間的片段敲除(9.5%)；總共打靶效率為28.5%(6/21)。

圖1 構(gòu)建靶向H2-K1的pX330質(zhì)粒Fig.1 Construction of H2-K1-targeting pX330 plamidsA：pX330質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，包含2個(gè)BbsⅠ酶切位點(diǎn)以及啟動(dòng)子； B: H2-K1-Exon2-sgRNA以及H2-K1-Exon3-sgRNA的靶位點(diǎn)及其附件序列

sgRNAOligonucleotidesequenceH2-K1-Exon2-sgRNAsenseoligo:5'-CACCGTAGCCGACTTCCATGTACCG-3'antisenseoligo:5'-AAACCGGTACATGGAAGTCGGCTAC-3'H2-K1-Exon3-sgRNAsenseoligo:5'-CACCGCTGATCACCAAACACAAGT-3'antisenseoligo:5'-AAACACTTGTGTTTGGTGATCAGC-3'

2.3mES細(xì)胞克隆基因型鑒定

本次研究對#12和#17克隆進(jìn)行了提取基因組DNA、PCR、連接載體以及測序鑒定。分析測序結(jié)果證實(shí), 這兩株克隆的靶位點(diǎn)間的片段被敲除。假設(shè)特異性切割的位置是在靶位點(diǎn)5′往3′方向的第17和第18個(gè)堿基之間(即PAM序列前的第3和第4個(gè)堿基之間)[14]。其中，#17克隆有3個(gè)靶位點(diǎn)在假設(shè)位置上發(fā)生了精確的切割(Clone17-Allele-1的H2-K1-Exon2-sgRNA靶點(diǎn)，Clone17-Allele-2的H2-K1-Exon2-sgRNA靶點(diǎn)和H2-K1-Exon3-sgRNA靶點(diǎn))，#12和#17克隆其他5 個(gè)靶位點(diǎn)上的靶向切割都發(fā)生了小片段的缺失或者插入(圖3)。

2.4H2-K1基因表達(dá)的鑒定

MHC分子在ES細(xì)胞上只有少量的表達(dá)，為了便于分析，本次研究對#12、#17mES細(xì)胞克隆以及野生型mES細(xì)胞克隆進(jìn)行分化培養(yǎng)，前4～5d用mES細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，ES細(xì)胞克隆長出來后，用mES細(xì)胞分化培養(yǎng)基培養(yǎng)(圖4)。培養(yǎng)25～30d后，大部分的mES細(xì)胞發(fā)生分化，收集細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(圖4)。

圖2 PCR鑒定基因片段敲除的mES細(xì)胞克隆Fig.2 The identification of the mES cell clones with gene deletion

3 討 論

H2-K1基因是小鼠MHCⅠ類基因的一種，其表達(dá)產(chǎn)物H-2Kb參與了病毒抗原、腫瘤抗原等內(nèi)源性抗原的加工和提呈。MHCⅠ類基因人源化小鼠在腫瘤免疫治療、病毒疫苗、基因治療等領(lǐng)域中有重要的應(yīng)用[7,11-12]。CRISPR/Cas9技術(shù)是一項(xiàng)新的基因組編輯技術(shù)，和鋅指核酸酶(zincfingerendonuclease,ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN)一樣，可以用于編輯細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基因組DNA[20-21]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)，以pX330質(zhì)粒為骨架，快速地構(gòu)建了用于敲除H2-K1基因的質(zhì)粒載體，并且通過電擊穿孔轉(zhuǎn)染的方法將載體轉(zhuǎn)染到mES細(xì)胞中。在mES細(xì)胞單克隆挑取以及細(xì)胞擴(kuò)增后，經(jīng)PCR、DNA測序以及流式細(xì)胞分析證實(shí)，本研究得到了兩株H2-K1雙等位基因敲除的mES細(xì)胞株。

本研究選取了一對靶位點(diǎn)，去除的是一段基因。如果只設(shè)計(jì)一個(gè)靶位點(diǎn)，可能會(huì)產(chǎn)生小片段堿基的缺失或者插入，但是少數(shù)幾個(gè)堿基的變化不一定能夠使基因沉默。而且小片段的突變很難通過PCR的方法來檢測，需要通過T7核酸內(nèi)切酶Ⅰ或者Suveryor試驗(yàn)等方法進(jìn)行檢測，過程比較復(fù)雜。與之相比，本次實(shí)驗(yàn)去除的基因片段包含了H2-K1基因的Exon2和Exon3的序列，破壞了其對應(yīng)的分子的α1和α2結(jié)構(gòu)，能夠更有效地敲除H2-K1基因。通過普通的PCR方法即可鑒定DNA片段是否被敲除。除此之外，在提供帶同源臂的DNA模板的條件下，Cas9蛋白對DNA進(jìn)行切割產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(double-strandbreak，DSB)后，可通過以同源指導(dǎo)修復(fù)(homologydirectedrepair，HDR)為基礎(chǔ)的DNA修方式，實(shí)現(xiàn)對DNA的修飾[17-18]。本實(shí)驗(yàn)成功地敲除H2-K1基因兩個(gè)靶點(diǎn)間的基因片段，證實(shí)所設(shè)計(jì)的兩個(gè)靶點(diǎn)可以作為CRISPR/Cas9系統(tǒng)的靶點(diǎn)。靶點(diǎn)所在的Exon2和Exon3對應(yīng)H2-Kb分子的α1和α2結(jié)構(gòu)，正是MHCⅠ類分子與抗原肽結(jié)合的部位，這是不少科學(xué)家在人源化小鼠的MHC基因時(shí)修飾的基因區(qū)間[7]。因此，本次實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的兩個(gè)靶位點(diǎn)為H2-K1基因的修飾提供兩個(gè)可靠的靶位點(diǎn)。

圖4 mES細(xì)胞分化培養(yǎng)養(yǎng)Fig.4 The differentiation of mES cellsA：#12 mES細(xì)胞分化前的形態(tài)；B: #17 mES細(xì)胞分化前的形態(tài)；C: 野生型mES細(xì)胞分化前的形態(tài)；D：#12 mES細(xì)胞分化后的形態(tài)；E: #17 mES細(xì)胞分化后的形態(tài)；F: 野生型mES細(xì)胞分化后的形態(tài)

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果Fig.5 The result of flow cytometryA、B：藍(lán)色曲線代表用FITC Mouse Anti-Mouse H-2Kb流式抗體標(biāo)記分化的#12 mES細(xì)胞的檢測結(jié)果；橙色曲線代表用FITC Mouse Anti-Mouse H-2Kb流式抗體標(biāo)記分化的#17 mES細(xì)胞的檢測結(jié)果；黑色曲線代表用FITC Mouse IgG2a, κ Isotype流式抗體標(biāo)記分化的野生型mES細(xì)胞的檢測結(jié)果；紅色曲線代表用FITC Mouse Anti-Mouse H-2Kb流式抗體標(biāo)記分化的野生型 mES細(xì)胞的檢測結(jié)果；C、D：紫色曲線代表用FITC Mouse Anti-Mouse H-2Db流式抗體標(biāo)記分化的#12 mES細(xì)胞的檢測結(jié)果；綠色曲線代表用FITC Mouse Anti-Mouse H-2Db流式抗體標(biāo)記分化的#17 mES細(xì)胞的檢測結(jié)果；黑色曲線代表用FITC Mouse IgG2b, κ Isotype流式抗體標(biāo)記分化的野生型mES細(xì)胞的檢測結(jié)果；紅色曲線代表用FITC Mouse Anti-Mouse H-2Db流式抗體標(biāo)記分化的野生型 mES細(xì)胞的檢測結(jié)果

研發(fā)MHCⅠ類基因人源化小鼠的一種策略是先分別得到H2-K、H2-D單基因敲除的小鼠。通過顯微注射技術(shù)，本研究獲得的H2-K1雙等位基因敲除的mES細(xì)胞可以被注射到小鼠早期胚胎內(nèi)。通過對小鼠的飼養(yǎng)、繁殖以及鑒定，可以得到H2-K1雙等位基因敲除的基因工程小鼠。這為MHCⅠ類基因人源化小鼠的研發(fā)打下基礎(chǔ)。這與本實(shí)驗(yàn)組的研發(fā)HLA基因人源化小鼠的目的相符。我們在進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)的同時(shí)在利用基因置換技術(shù)開展HLA轉(zhuǎn)基因小鼠的研究，計(jì)劃將H2基因敲除小鼠與HLA轉(zhuǎn)基因小鼠交配，得到新一代HLA基因人源化小鼠。這一系列HLA基因人源化小鼠模型將為腫瘤免疫治療提供研究平臺(tái)。

綜上所述，本研究聯(lián)合使用CRISPR/Cas9技術(shù)、電穿孔轉(zhuǎn)染法等技術(shù)得到兩株H2-K1雙等位基因敲除的mES細(xì)胞，同時(shí)也證實(shí)所設(shè)計(jì)的兩個(gè)靶位點(diǎn)的有效性。這些獲得的mES細(xì)胞株、所設(shè)計(jì)的靶位點(diǎn)以及打靶載體都為MHCⅠ類基因人源化小鼠的研發(fā)以及病毒疫苗、基因治療等研究提供很好的工具。

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TheH2-K1geneknockoutofmouseEScells
throughCRISPR/Cas9technology

CHENRuijun1，LIWeiran1，HUANGYijun1，LIUJianzhong1，LILiangping1,2

(1.Department of Biology, Zhongshan School of Medicine, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China; 2.Central Laboratory, The First Affiliated Hospital, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

The CRISPR/Cas9 technology was used to achieve theH2-K1geneknockoutofmouseEScells,whichwillbeusefulforgenerationofMHCclassⅠgenehumanizedmice.Inthisstudy,twosgRNAsweredesigned,whicharetargetingtotheExon2andExon3ofH2-K1,respectively.TheplasmidsexpressingthesgRNAswereconstructedusingpX330asthematrixplasmid.InordertoknockoutH2-K1,theconstructedplasmidsandpSUPER-purowerecotransfectedintothemEScellsthroughelectroporation.Afterscreeningbypuromycin,theresultofgenetargetingwasdeterminedbyPCR，andH2-K1knockoutmouseEScellswerefurtherconfirmedthroughsequencingandflowcytometry.WefoundthatH2-K1inthemouseEScellwasknockedoutusingCRISPR/Cas9technology.ThroughPCR, 4clonesweredeterminedasonealleleknockout(19.0%),2clonesweredeterminedastwoalleleknockout(9.5%). 2cloneswerefurtherconfirmedastwoalleleknockoutclonesbysequencingandflowcytometry.ThegeneratedH2-K1knockoutmouseEScellswouldprovideareferencefortheknockoutandreplacementofMHCclassⅠgene.

H2-K1gene;CRISPR/Cas9technology;mEScell;geneknockout

2016-09-05 基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31270920；81472824)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B060300004)

陳瑞俊(1989年生)，男；研究方向：腫瘤免疫學(xué)；E-mail：347770864@qq.com

李亮平(1961年生)，男；研究方向：腫瘤免疫學(xué)；E-mail：lilping2@mail.sysu.edu.cn，liangping_li@jnu.edu.cn

10.13471/j.cnki.acta.snus.2017.02.002

R

A

0529-6579(2017)02-0005-07