武迎磊 趙天 李明

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·論著·

燈盞花素對(duì)大鼠動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)作用的研究

武迎磊 趙天 李明

目的 研究燈盞花素(breviscapine，Bre)對(duì)大鼠動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)作用。方法 采用高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合腹腔注射維生素D3(VD3)的方法建立動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型，分別于造模過(guò)程同步灌胃給予Bre 6、12、24 mg·(kg·d)-1和辛伐他汀SV 1.8 mg·(kg·d)-1，共12周，并設(shè)模型組和正常對(duì)照組。計(jì)算各組大鼠心臟指數(shù)(cardiac index，CI)，通過(guò)HE染色觀察主動(dòng)脈形態(tài)變化并進(jìn)行病變分級(jí)，生化分析法測(cè)定血清血脂指標(biāo)，比色法測(cè)定血漿炎癥細(xì)胞因子含量水平和血清中抗氧化酶活性及丙二醛(MDA)含量。結(jié)果 與模型組比較發(fā)現(xiàn)Bre 12、24 mg·(kg·d)-1組動(dòng)脈粥樣硬化大鼠CI顯著降低(P<0.05)；Bre各組大鼠主動(dòng)脈病變呈不同程度改善，Bre 24 mg·(kg·d)-1組大鼠主動(dòng)脈病變分級(jí)水平顯著降低(P<0.05)；Bre 12、24 mg·(kg·d)-1組血清血脂指標(biāo)TC、TG、LDL-C含量顯著降低(P<0.05)，血漿炎癥細(xì)胞因子CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6含量明顯降低(P<0.05)，血清抗氧化酶SOD、CAT活性顯著升高且MDA含量顯著降低(P<0.05)；Bre 24 mg·(kg·d)-1組血清血脂指標(biāo)HDL-C含量和抗氧化酶GSH-Px活性均顯著升高(P<0.05)，血漿中炎癥細(xì)胞因子IL-10含量顯著升高(P<0.05)。結(jié)論 Bre對(duì)大鼠動(dòng)脈粥樣硬化具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與Bre能夠有效調(diào)節(jié)血脂、抑制炎癥反應(yīng)和降低氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

燈盞花素； 動(dòng)脈粥樣硬化； 血脂； 炎癥； 氧化應(yīng)激

隨著生活水平的提高、飲食結(jié)構(gòu)的改變以及老齡化的加劇，中國(guó)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病率逐年升高；動(dòng)脈粥樣硬化是高血壓、冠心病、心肌梗死等多種心血管系統(tǒng)疾病的病理基礎(chǔ)，其病理機(jī)制非常復(fù)雜，與多種因素有關(guān)，其中血脂代謝紊亂、炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激損傷是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的核心機(jī)制[1-3]。燈盞花素(breviscapine，Bre)是中國(guó)傳統(tǒng)中藥品種燈盞花(首載于《滇南本草》)的主要活性成分，屬于黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、改善血液循環(huán)等多種生物學(xué)活性[4-6]，但Bre是否對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化具有一定的保護(hù)作用尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型并同步給予Bre進(jìn)行干預(yù)治療，研究Bre對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠的保護(hù)作用并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

燈盞花素片(breviscapine，Bre)購(gòu)自廣州彼迪藥業(yè)有限公司(規(guī)格：20 mg/片，生產(chǎn)批號(hào)：20150917)；辛伐他汀片(simvastatin，SV)購(gòu)自山東羅欣藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司(規(guī)格：20 mg/片，生產(chǎn)批號(hào)：1511024)；總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerides，TG)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL-C)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL-C)試劑盒均購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(Catalase，CAT)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；蘇木精-尹紅(hematoxylin-Eosin，HE)試劑盒，C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)試劑盒購(gòu)自北京博奧森科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用SD大鼠(清潔級(jí)，雄性，鼠齡6周齡，體質(zhì)量180～220 g)購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(冀)2013-1-003。

1.3 動(dòng)物模型的制備與分組

參照楊宏輝等[7]報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法制備動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型：除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠均通過(guò)喂養(yǎng)高脂飼料結(jié)合腹腔注射維生素D3(VD3)的方法建立大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型，共12周；造模過(guò)程及主動(dòng)脈大體解剖圖片見圖1：與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠呈現(xiàn)精神萎靡、毛發(fā)脫落等狀態(tài)，主動(dòng)脈大體解剖呈現(xiàn)血管萎縮、血管壁增厚、多處鈣化等病理現(xiàn)象；選取80只模型大鼠隨機(jī)分為模型組、Bre 6、12、24 mg·(kg·d)-1組和SV 1.8 mg·(kg·d)-1組，各組均16只(n=16)，造模過(guò)程中各治療組同步灌胃給藥(12周)，另設(shè)正常對(duì)照組和模型組(同步給予等體積生理鹽水)。

1.4 心臟指數(shù)(cardiac index，CI)的計(jì)算

分別稱量各組大鼠體質(zhì)量，麻醉后取各組大鼠心臟組織并稱量其質(zhì)量，然后計(jì)算CI：CI(%)=(心臟質(zhì)量/體質(zhì)量)×100%。

1.5 主動(dòng)脈形態(tài)結(jié)構(gòu)改變的觀察及病變分級(jí)

麻醉后剝?nèi)∪L(zhǎng)主動(dòng)脈，經(jīng)4%多聚甲醛液中固定、常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、常規(guī)HE染色、復(fù)染和封片處理后，通過(guò)顯微鏡觀察主動(dòng)脈形態(tài)結(jié)構(gòu)改變；主動(dòng)脈病變標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：結(jié)構(gòu)正常；1級(jí)：內(nèi)膜有少量泡沫細(xì)胞積聚，無(wú)明顯的凸起斑塊；2級(jí)：內(nèi)膜可見大量泡沫細(xì)胞積聚，有明顯的粥樣斑塊，部分斑塊融合成片；3級(jí)：內(nèi)膜表面幾乎全被粥樣斑塊覆蓋，斑塊內(nèi)可見組織壞死、鈣化，斑塊底部肌層萎縮變薄。

圖1 造模過(guò)程照片及主動(dòng)脈大體解剖圖片

1.6 血清血脂指標(biāo)水平、炎癥細(xì)胞因子含量、抗氧化酶活性及MDA含量的測(cè)定

麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定血漿中炎癥細(xì)胞因子(CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10)含量水平；經(jīng)離心(1500 r/min，10分鐘)處理后取血清，通過(guò)全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C含量水平；通過(guò)紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定血清中抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性和MDA含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料多組間均數(shù)比較采用one-way ANOVA檢驗(yàn)，主動(dòng)脈病變分級(jí)采用秩和檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠CI計(jì)算結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠CI顯著升高(P<0.05)，與模型組比較發(fā)現(xiàn)經(jīng)Bre 12、24 mg·(kg·d)-1或SV 1.8 mg/(kg·d)干預(yù)能夠顯著降低動(dòng)脈粥樣硬化大鼠CI(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠

注： 與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

2.2 各組大鼠主動(dòng)脈形態(tài)結(jié)構(gòu)改變及病變分級(jí)結(jié)果

如圖2所示：模型組大鼠主動(dòng)脈較正常對(duì)照組呈現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞受損、慢性炎癥病變、泡沫細(xì)胞形成并伴有粥樣硬化斑塊形成等明顯的病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)改變；與模型組比較發(fā)現(xiàn)經(jīng)Bre干預(yù)能夠明顯減輕動(dòng)脈粥樣硬化病變程度，以Bre 24 mg·(kg·d)-1組效果最為顯著。評(píng)價(jià)主動(dòng)脈病變分級(jí)：模型組大鼠主動(dòng)脈病變2級(jí)及以上共14例(87.5%)，其病變分級(jí)較正常對(duì)照組顯著升高(P<0.05)；Bre 24 mg·(kg·d)-1組和SV 1.8 mg·(kg·d)-1組主動(dòng)脈病變分級(jí)較模型組均顯著降低(P<0.05)。見表2。

A：正常對(duì)照組；B：模型組；C：Bre 6 mg·(kg·d)-1組；D：Bre 12 mg·(kg·d)-1組；E：Bre 24 mg·(kg·d)-1組；F：SV 1.8 mg·(kg·d)-1組

圖2 各組大鼠主動(dòng)脈形態(tài)結(jié)構(gòu)變化(HE×400) 表2 各組大鼠主動(dòng)脈病變分級(jí)結(jié)果±s)

注： 與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

2.3 各組大鼠血清中血脂指標(biāo)

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中血脂指標(biāo)TC、TG、LDL-C含量顯著升高且HDL-C含量顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，Bre 12、24 mg·(kg·d)-1組動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血清中TC、TG、LDL-C含量顯著降低(P<0.05)，Bre 24 mg·(kg·d)-1組HDL-C含量顯著升高(P<0.05)。見表3。

2.4 各組大鼠血漿中炎癥細(xì)胞因子含量測(cè)定結(jié)果

與正常對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血漿中炎癥細(xì)胞因子(CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6)含量水平顯著升高(P<0.05)，炎癥細(xì)胞因子IL-10含量水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較發(fā)現(xiàn)經(jīng)Bre12、24 mg·(kg·d)-1干預(yù)能夠顯著降低動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血漿中CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6含量(P<0.05)，經(jīng)Bre 24 mg·(kg·d)-1干預(yù)能夠顯著升高IL-10含量(P<0.05)。見表4。

2.5 各組大鼠抗氧化酶活性和MDA含量

與正常對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清中抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)；與模型組比較發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Bre 12、24 mg·(kg·d)-1干預(yù)能夠顯著提高動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血清SOD、CAT活性(P<0.05)，顯著降低MDA含量(P<0.05)；經(jīng)Bre 24 mg·(kg·d)-1干預(yù)能夠顯著提高GSH-Px活性(P<0.05)。見表5。

3 討論

血脂代謝異常以及由其所引發(fā)的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、血液流變學(xué)指標(biāo)改變是動(dòng)脈粥樣硬化疾病的重要發(fā)病機(jī)制[8-9]。血脂水平升高致使血液黏稠度升高，影響血液流變學(xué)指標(biāo)和血液動(dòng)力學(xué)指標(biāo)[8]；并且血脂代謝失調(diào)將導(dǎo)致血管內(nèi)膜脂質(zhì)沉積、形成“斑塊”而逐漸發(fā)展成為動(dòng)脈粥樣硬化[9]。鄭楚等[10]和王苑銘等[11]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)藥物調(diào)節(jié)血脂以及改善血液流變學(xué)能夠有效緩解動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)生和發(fā)展。

表3 TGP對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血清中血脂水平的影響±s)

注： 與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

表4 各組大鼠血漿中炎癥細(xì)胞因子含量±s)

注： 與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

表5 各組大鼠抗氧化酶活性和MDA含量±s)

注： 與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C含量水平是臨床血脂分析的常用指標(biāo)；其中TG、LDL-C含量增高將損害血管內(nèi)皮光滑性，從而增加引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化甚至誘發(fā)急性心肌梗死的危險(xiǎn)性；而HDL-C能夠促進(jìn)TC代謝而表現(xiàn)出對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用。病理生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[12]，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生及進(jìn)展程度與血漿中TC、TG、LDL-C含量密切相關(guān)。血液中TC、TG含量增加會(huì)附著于紅細(xì)胞膜而致使紅細(xì)胞膜硬化，而影響紅細(xì)胞的變形能力，導(dǎo)致細(xì)胞膜流動(dòng)性下降，進(jìn)而引發(fā)血液流變學(xué)指標(biāo)異常，這也可能是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化疾病發(fā)生的重要病理機(jī)制之一[13-15]。

氧化應(yīng)激損傷也是動(dòng)脈粥樣硬化疾病的重要病理機(jī)制[2-3,16]，Considine MJ等[17]研究發(fā)現(xiàn)活性氧簇(ROS)生成的活性氧和NO將破壞血管壁的光滑性，從而形成斑塊、破裂與形成血栓。常態(tài)下ROS的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡，其中體內(nèi)抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)在維持ROS平衡中發(fā)揮著重要的作用[18-19]；抗氧化酶活性低下則會(huì)導(dǎo)致ROS過(guò)剩，進(jìn)而引發(fā)動(dòng)脈血管的過(guò)氧化損傷；所以過(guò)氧化終產(chǎn)物MDA的含量也能夠間接反映動(dòng)脈血管氧化應(yīng)激損傷程度。

燈盞花素是一種具有多種藥理學(xué)作用的天然黃酮類化合物[3-5]，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)Bre干預(yù)能夠有效降低動(dòng)脈粥樣硬化大鼠CI，抑制主動(dòng)脈病變，改善血脂(降低TC、TG、LDL-C含量并提高HDL-C含量)，降低炎癥細(xì)胞因子CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6含量并提高炎癥細(xì)胞因子IL-10含量而抑制炎癥反應(yīng)，提高抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性而抑制氧化應(yīng)激損傷，提示Bre對(duì)大鼠動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展具有一定的抑制作用，其機(jī)制可能與Bre能夠有效調(diào)節(jié)血脂、抑制炎癥和降低氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

[1] 聶永梅，成敏，陳槐卿. 動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中血脂、血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)和血管內(nèi)膜的動(dòng)態(tài)變化[J]. 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2005，22(1)：10-14．

[2] Landmesser U，Spiekermann S，Dikalov S，et al. Vascular oxidative stress and endothelial dysfunction in patients with chronic heart failure：role of xanthine-oxidase and extracellular superoxide dismutase[J]. Circulation，2002，106(24)：3073-3078.[3] Stocker R，Keaney JF.Role of oxidative modifications in atherosclerosis[J]. Physiological Reviews，2004，84(4)：1381-1478.[4] 丁寧. 燈盞花素注射液對(duì)痛風(fēng)患者抗氧化能力的影響研究[J]. 中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2016，10(10)：150-151.

[5] 李軍，吳立友，王朝陽(yáng). 燈盞花素注射液對(duì) 2 型糖尿病早期腎病患者相關(guān)炎癥因子的影響[J]. 中藥藥理與臨床，2011，27(3)：110-112.

[6] 金桂蘭，覃慧林，石孟瓊，等. 燈盞花素對(duì)小鼠局灶性腦缺血損傷的保護(hù)作用及與腦組織P-糖蛋白表達(dá)研究[J]. 中藥藥理與臨床，2015，31(1)：76-79.

[7] 楊宏輝，高傳玉，徐予，等. 動(dòng)脈粥樣硬化SD大鼠模型的建立[J]. 醫(yī)藥論壇雜志，2009，30(2)：18-22.

[8] 張鳳華，楚溪，張俊芳，等. 調(diào)脂通脈湯對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23(2)：355-356.

[9] Schfers M，Schober O，Hermann S. Matrix-metalloproteinases as imaging targets for inflammatory activity in atherosclerotic plaques[J]. J Nucl Med，2010，51(5)：663-666.

[10] 鄭楚，楊冬業(yè)，徐勤，等. 三七花總皂苷對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠血脂及血液流變學(xué)影響[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(12)：162-164.

[11] 王苑銘，張朝寧，余臣祖，等. 大黃多糖對(duì)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血脂代謝及主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)的影響[J]. 中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2012，19(9)：48-49.

[12] 張晶，關(guān)欣，王偉，等. 血脂代謝與頸動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定性斑塊的相關(guān)性[J]. 中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2012，20(9)：833-836.

[13] 王燕. 血液流變學(xué)指標(biāo)與高脂血癥的關(guān)系[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2007，4(12)：1179-1180.

[14] 袁慶芳，石國(guó)鋒. 瑞舒伐他汀鈣對(duì)腦梗死患者動(dòng)脈粥樣硬化和腦血流動(dòng)力學(xué)的影響[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，22(20)：2178-2180.

[15] 蔡勁，施園. 針灸對(duì)頸動(dòng)脈粥樣硬化形態(tài)和血流動(dòng)力學(xué)影響的臨床研究[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013，31(8)：1695-1697.

[16] Fatar M，Stroick M，Griebe M，et al. Matrix metallproteinases in cerebrovascular diseases[J]. Cerebrovaso Dis，2005，20(3)：141-151.

[17] Considine MJ，Sandalio LM，F(xiàn)oyer CH. Unravelling how plants benefit from ROS and NO reactions，while resisting oxidative stress[J]. Ann Bot，2015，116(4)：469-473.

[18] Lartigue A，Burlat B，Coutard B，et al. The megavirus chilensis Cu，Zn-superoxide dismutase：the first viral structure of a typical CCS-independent hyperstable dimeric enzyme[J]. J Virol， 2014，2588(14)：254-261.

[19] Li X，Zhao L，Yue L，at al. Evidence for the protective effects of curcumin against oxyhemoglobin-induced injury in rat cortical neurons[J]. Brain Res Bull，2016，120：34-40.

(本文編輯： 董歷華)

Protective effects and mechanism of breviscapine on atherosclerosis rats

WUYinglei，ZHAOTian，LIMing.

ThethirdhospitalofXingtai，Xingtai054000,China

LIMing，E-mail：czhlm2016@163.com

Objective To investigate the protective effects and mechanism of breviscapine(Bre) on atherosclerosis rats. Methods The atherosclerosis models were made by high-fat diet and intraperitoneal injection with VD3, and at the same time, the rats were treated with Bre [6, 12, 24 mg·(kg·d)-1] and simvastatin [SV, 1.8 mg·(kg·d)-1], course of the treatment was 12 weeks; the rats were divided into normal control group and model group. The cardiac index(CI) was calculated；the histopathological changes and lesion classification of abdominal aorta was observed by HE staining; the serum lipids in serum were detected; the level of inflammatory cytokines in serum were determined; the activity of antioxidase and the content of MDA in serum were determined. Results Compared with model group, the CI of Bre [12, 24 mg·(kg·d)-1] groups were significantly decreased (P<0.05); the histopathological changes were significantly improved; the level of TC, TG, LDL-C in serum of Bre [12, 24 mg·(kg·d)-1] groups were significantly decreased (P<0.05)；the level of CRP, TNF-α, IL-1β, IL-6 in plasma were significantly decreased (P<0.05); the activity of SOD, CAT in serum were significantly increased while the content of MDA was significantly decreased (P<0.05，P<0.05); the level of HDL-C and the activity of GSH-Px in Bre 24 mg·(kg·d)-1group was significantly increased (P<0.05), the level of IL-10 was significantly increased (P<0.05). Conclusion Bre has protective effects on atherosclerosis rats, which perhaps related to its effects of reducing cholesterol, improving the anti-inflammatory and antioxidant capacity.

Breviscapine; Atherosclerosis; Blood lipid; Inflammation; Oxidative stress

054000 邢臺(tái)市第三醫(yī)院藥劑科(趙天、武迎磊)；滄州市食品藥品檢驗(yàn)所(李明)

武迎磊(1984- )，本科，主管藥師。研究方向：臨床藥學(xué)。E-mail：yimy21@126.com

李明(1983- )，本科，主管藥師。研究方向：藥物分析藥理學(xué)研究。E-mail：czhlm2016@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.06.007

2016-10-05)