蔡云 許昕

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益腎祛濁方對PCOS模型大鼠胰島素抵抗及性激素的影響

蔡云 許昕

目的 建立由來曲唑聯(lián)合高脂飼料誘導的多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)-胰島素抵抗(insulin resistarce,IR)大鼠模型，觀察益腎祛濁方對PCOS大鼠胰島素抵抗及性激素水平的影響。 方法 將72只6周齡SD雌性大鼠隨機分為6組：空白組、模型組、益腎祛濁方高劑量組、益腎祛濁方中劑量組、益腎祛濁方低劑量組及西藥二甲雙胍組，每組12只。除空白組外，其余各組采用來曲唑聯(lián)合高脂飼料法建立PCOS-IR大鼠模型。造模成功后，給予灌服益腎祛濁方，以西藥二甲雙胍作為對照，觀察用藥后各組大鼠空腹胰島素、性激素水平及卵巢結(jié)構(gòu)變化。 結(jié)果 (1)體重：在造模過程中，除空白組外，各組大鼠體重均明顯增加。造模后，經(jīng)過中藥或二甲雙胍灌藥，各組大鼠與模型組比較體重增長幅度減慢，甚至較前略有減輕。(2)性激素：造模后，模型組黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、睪酮(testosterone，T)、黃體生成素/卵泡刺激素(luteinizing hormone/follicle stimulating hormone，LH/FSH)水平較空白組升高；卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)方面，各組無明顯差異(P>0.05)；用藥后益腎祛濁方各劑量組的T、LH、LH/FSH水平較模型組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，二甲雙胍組與模型組比較，T、LH、LH/FSH水平無明顯差異(P>0.05)。(3)代謝指標：與模型組比較，益腎祛濁方高、中劑量組及西藥二甲雙胍組的空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；益腎祛濁方低劑量組與模型組比較FINS水平無明顯差異(P>0.05)。(4)卵巢組織：益腎祛濁方各劑量組對卵巢多囊樣改變均有不同程度改善，使小卵泡數(shù)目減少，顆粒細胞層增厚；二甲雙胍組改善卵巢組織效果不如益腎祛濁方組明顯。 結(jié)論 益腎祛濁方能夠有效改善PCOS-IR模型大鼠內(nèi)分泌及代謝紊亂狀態(tài)，且恢復(fù)卵巢內(nèi)卵泡結(jié)構(gòu)，使顆粒細胞增殖，促進卵泡發(fā)育，整體效果優(yōu)于二甲雙胍組。

多囊卵巢綜合征； 胰島素抵抗； 中藥； 益腎祛濁方； 二甲雙胍

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是婦科常見的內(nèi)分泌與代謝功能異常的復(fù)雜性疾病，以持續(xù)無排卵或稀發(fā)排卵、高雄激素和/或高胰島素血癥、胰島素抵抗為特征，主要表現(xiàn)為月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)、不孕、肥胖、多毛、痤瘡等[1-2]。胰島素抵抗(insulin resistance，IR)指機體生理水平胰島素(insulin，INS)促進器官組織和細胞吸收利用葡萄糖的效能下降時的代謝狀態(tài)，是機體靶細胞對正常水平的INS反應(yīng)低下的一種病理改變，具有空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)水平增高，而空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)正常，胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model of assessment for insulin resistance index，HOMA-IR)≥2.69等特征。姚元慶等[3]根據(jù)Carmiona的研究結(jié)果估計PCOS患者廣泛存在IR，其發(fā)生率高達50%～70%，IR已成為PCOS的基本病理特征。PCOS-IR是目前婦科內(nèi)分泌領(lǐng)域研究的熱點之一，也是較為棘手的難題。本研究基于“腎主生殖”“沖脈隸于陽明”的中醫(yī)理論，在前期臨床研究[2]基礎(chǔ)上進行動物實驗，旨在研究益腎祛濁方對PCOS-IR大鼠空腹胰島素、性激素水平及卵巢組織形態(tài)等方面的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取6周齡SPF級SD雌性大鼠72只，體重150～160 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2014-0004。

1.2 實驗用藥

來曲唑(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：HI9991001)；羧甲纖維素鈉(安徽山河藥用輔料股份有限公司，批號：160301)；鹽酸二甲雙胍腸溶片(北京利齡恒泰藥業(yè)有限公司，批號：H11021560)。

益腎祛濁方由菟絲子15 g、桑寄生24 g、續(xù)斷24 g、敗醬草15 g、生薏苡仁24 g、生石膏15 g、茯苓20 g、太子參24 g、澤蘭9 g、桃仁9 g、枳殼9 g、炙甘草6 g組成。制備成中藥水煎劑，按成人服用劑量折算成大鼠用量，設(shè)定為中劑量[4]。高劑量濃度為中劑量的2倍，中劑量濃度為低劑量的2倍。

1.3 實驗試劑

血清卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、睪酮(testosterone，T)、雌二醇(estradiol，E2)、FINS和甘油三酯(triglyceride，TG)等放免試劑盒，均由北京北方生物技術(shù)研究所有限公司提供；羅氏活力型血糖儀(德國羅氏診斷有限公司)。

1.4 造模方法

參考Kafali等[5]的來曲唑造模法，在來曲唑灌胃基礎(chǔ)上，加用高脂飼料，建立多囊卵巢綜合征胰島素抵抗大鼠模型。之前筆者已采用此法成功誘導出PCOS-IR大鼠模型，此大鼠同時具有卵巢多囊樣改變、高雄激素血癥、肥胖及胰島素抵抗等典型病理特征，證實此造模方法是適用于研究PCOS-IR的動物模型。

具體方法：所有實驗大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2天，空白組給予普通飼料喂養(yǎng)，每日灌胃0.5%羧甲纖維素鈉溶液；其他各組每日灌胃來曲唑溶液[來曲唑1 mg/(kg·d)溶于0.5%羧甲纖維素鈉]，同時給予高脂飼料喂養(yǎng)(配方：普通飼料61.5%、豬油12%、蔗糖5%、奶粉5%、花生5%、雞蛋10%、麻油1%、食鹽0.5%)，連續(xù)灌胃30天。

1.5 治療方式

30天造模結(jié)束后，除空白組外的60只大鼠完全隨機分為：模型組、益腎祛濁方高劑量組、益腎祛濁方中劑量組、益腎祛濁方低劑量組及西藥二甲雙胍組，每組12只。中、西藥治療組大鼠給予相應(yīng)組別藥物灌胃，具體如下：益腎祛濁方高劑量組按益腎祛濁方40 g/kg灌胃，每日1次，連續(xù)15天；中劑量組按益腎祛濁方20 g/kg灌胃，每日1次，連續(xù)15天。低劑量組按益腎祛濁方10 g/kg灌胃，每日1次，連續(xù)15天。模型組及空白組給予等量生理鹽水，每日1次，連續(xù)灌服15天。期間空白組繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)，其他各組繼續(xù)采用高脂飼料喂養(yǎng)。

1.6 檢測指標

1.6.1 大鼠體重變化 每周定時測量大鼠體重并記錄數(shù)據(jù)，繪制大鼠體重變化曲線。

1.6.2 性激素與代謝指標 各組大鼠灌胃結(jié)束后，禁食24小時，于次日以2%戊巴比妥鈉(0.2 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，腹主動脈取血，離心后收集血清。血清性激素(T、FSH、LH、E2)及相關(guān)代謝指標(FINS、TG等)均采用放免法測定，嚴格按照試劑盒說明書操作。計算LH/FSH比值和胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR，計算公式：HOMA-IR=FPG(mmol/L)×FINS(mIU/L)/22.5。

1.6.3 卵巢組織學觀察 卵巢組織以4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋；以4 μm厚度切片，常規(guī)脫蠟、水化后蘇木素染色5～10分鐘；1%鹽酸酒精分化，1%伊紅溶液染色，脫水，透明中性樹膠封片，顯微鏡下觀察各組大鼠卵巢組織學變化。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況

所有實驗大鼠經(jīng)灌胃后，無震顫、驚厥、流涕、呼吸困難等異常生命特征，試驗周期內(nèi)無一只大鼠死亡，其飲食、活動等均無顯著異常狀況。

2.2 大鼠體重

6組大鼠實驗開始前的體重無明顯差異。造模過程中(至第28天)，除空白組外，其余各組大鼠體重增長明顯。造模后，經(jīng)過中藥或二甲雙胍治療(第35天至禁食處死當天)，各組大鼠與模型組比較體重增長幅度減緩，甚至較前略有減輕。見表1和圖1。

2.3 性激素水平

模型組LH、T、LH/FSH水平較空白組升高；FSH水平在各組間無明顯差異(P>0.05)。灌藥結(jié)束后，空白組及益腎祛濁方各劑量組的LH、T、LH/FSH比值均低于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，二甲雙胍組與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

圖1 各組大鼠體重增長趨勢圖

2.4 代謝指標

2.4.1 FINS 與模型組比較，益腎祛濁方高、中劑量組及西藥二甲雙胍組的空腹胰島素水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；益腎祛濁方低劑量組同模型組相比，F(xiàn)INS水平無明顯差異(P>0.05)。二甲雙胍組與益腎祛濁方高、中劑量組相比，F(xiàn)INS水平無明顯差異(P>0.05)。

2.4.2 FPG 各組間空腹血糖水平無明顯差異，亦無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4.3 TG 各組間甘油三酯水平無明顯差異，無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4.4 HOMA-IR 空白組、益腎祛濁方高劑量組、中劑量組和二甲雙胍組的胰島素抵抗指數(shù)低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；中藥低劑量組與模型組比較，HOMA-IR水平無明顯差異(P>0.05)。見表3。2.5 卵巢組織學改變

光學鏡下，空白組大鼠卵巢內(nèi)有多個黃體，顆粒細胞呈多層，形態(tài)完整，排列整齊，顆粒細胞層較厚。模型組可見較多早期發(fā)育的小卵泡及閉鎖卵泡，囊狀擴張顯著，顆粒細胞層減少，甚至消失，黃體較少，卵巢呈典型多囊樣改變。益腎祛濁方各劑量組對卵巢多囊樣改變均有不同程度的改善，小卵泡數(shù)目減少，顆粒細胞層增厚等。二甲雙胍組對改善卵巢組織多囊樣改變有一定影響，但效果不如中藥組明顯。見圖2。

表1 各組大鼠體重比較

表2 各組大鼠性激素指標比較

注： 與模型組比較，aP<0.05。

表3 各組大鼠代謝指標比較

注： 與模型組比較，aP<0.05。

注：A空白組； B模型組； C益腎祛濁方高劑量組； D益腎祛濁方中劑量組； E益腎祛濁方低劑量組； F二甲雙胍組

圖2 各組大鼠卵巢組織學改變HE染色圖(×40)

3 討論

自1980年Burghen首次報道PCOS患者存在高胰島素血癥以來，越來越多的臨床證據(jù)表明IR是PCOS的顯著特征[6]，PCOS-IR具有高發(fā)性、異質(zhì)性、終身性和難治性等特點，且存在糖尿病、代謝綜合征等遠期并發(fā)癥風險，嚴重威脅患者身心健康。目前，西醫(yī)常首選雙胍類藥物治療本病，二甲雙胍是胰島素增敏劑，可增加外周組織對葡萄糖的攝取和利用，抑制肝糖原異生和糖原分解，改善外周組織對胰島素的敏感性[7]。二甲雙胍治療PCOS-IR不僅改善胰島素抵抗狀態(tài)，還可促進排卵和受孕，但遠期效果并不理想，并且口服二甲雙胍常出現(xiàn)腹瀉、惡心、腹脹、胃部不適等不良反應(yīng)，部分患者難以堅持服藥。中藥治療PCOS-IR，同樣可使患者恢復(fù)排卵功能，調(diào)整月經(jīng)周期，提高生殖能力，不良反應(yīng)相對較少，具有良好的療效。

中醫(yī)學無與PCOS-IR相對應(yīng)的病名，根據(jù)其臨床特征，將本病歸屬于“閉經(jīng)”“月經(jīng)稀發(fā)”“月經(jīng)過少”“經(jīng)期延長”及“不孕”等范疇。多數(shù)學者認為，本病與臟腑功能失調(diào)及痰濕、血瘀關(guān)系密切。本實驗以補腎健脾，祛濁調(diào)經(jīng)為治療法則，結(jié)果證實益腎祛濁方能顯著降低PCOS-IR大鼠空腹胰島素水平，改善高雄激素血癥、LH升高、LH/FSH比值異常等內(nèi)分泌紊亂狀態(tài)，亦能一定程度糾正卵巢多囊樣病變。實驗數(shù)據(jù)表明，該方既能通過補益腎氣恢復(fù)卵巢局部卵泡質(zhì)量，使體內(nèi)性激素水平趨向正常周期性變化，又能通過祛濁清除胃腸積滯，抑制過多雄激素的產(chǎn)生，增強脾運而逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗，最終遏制高雄激素血癥與高胰島素血癥之間此增彼漲的惡性循環(huán)，改善卵巢排卵功效，恢復(fù)月經(jīng)與生殖能力。西藥二甲雙胍組雖能有效降低大鼠FINS水平，但異常激素指標改善并不明顯。本研究證明益腎祛濁方在改善PCOS大鼠胰島素抵抗及性激素水平方面，較西藥二甲雙胍組更具有優(yōu)勢。

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(本文編輯： 韓虹娟)

Effects ofYishenQuzhuodecoction on insulin resistance and hormones of rats with PCOS

CAIYun，XUXin.

Departmentofgynecology，BeijingHospitalofTraditionalChineseMedicine，CapitalMedicalUniversity,Beijing10010，China

XUXin，E-mail：xuxindoudou1959@163.com

Objective The PCOS-IR rat model was induced by letrozole combined with high fat diet, and the effect ofYishenQuzhuodecoction on insulin resistance and hormones were observed in PCOS rats. Methods 72 6-week-old SD female rats were randomly divided into 6 groups：blank group, model group,YishenQuzhuodecoction high dose group,YishenQuzhuodecoction middle dose group,YishenQuzhuodecoction low dose group, western medicine group, 12 rats in each group. After the rat model was successfully established, theYishenQuzhuodecoction and western medicine melbine (Metformin Hydrochloride) was used to treat. The levels of insulin and hormones were observed, and the change of ovary structure was observed.Results (1)Effect on the weight of rats: model group was significantly elevated, body weight of rats in each treatment group was decreased after treatment.(2)The influence on testosterone(T), luteinizing hormone(LH), luteinizing hormone/follicle stimulating hormone (LH / FSH): the levels of T and LH / FSH in model group was significantly increased, the levels of T ,LH and LH / FSH in allYishenQuzhuodecoction groups were reduced.(3)On serum insulin (FINS) in rats: compared with the blank group, the level of FINS of model group was significantly increased, the level of FINS in all treatment groups was decreased except theYishenQuzhuodecoction low dose group.(4)Ovarian tissue:YishenQuzhuodecoction groups have different degrees of improvement on polycystic ovary in rats, the number of small follicles was reduced, granular cell layer was thickened; the effect of metformin group was not as obvious as the Chinese medicine group.ConclusionYishenQuzhuodecoction can effectively improve the endocrine and metabolism of PCOS-IR rats, and can restore the structure of ovarian follicles, can promote the proliferation of granulosa cells and follicular development, the overall effect is better than metformin group.

Polycystic ovary syndrome； Insulin resistance； Traditional Chinese medicine；YishenQuzhuodecoction； Metformin Hydrochloride

國家自然科學基金(81674010)

100010 首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院婦科[蔡云(碩士研究生)、許昕]

蔡云(1989- )，女，2014級在讀碩士研究生。研究方向：中醫(yī)藥治療多囊卵巢綜合征胰島素抵抗。E-mail：caiyun0717@126.com

許昕(1959- )，女，碩士，主任醫(yī)師。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療排卵障礙性疾病。E-mail：xuxindoudou1959@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.06.003

2016-07-08)