韋俊杰 李呂力 李曉峰 李燕華 陳 淵 張麗香 范秉林 陳 志 封 渾

(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 南寧 530021)

依達(dá)拉奉對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦紅蛋白和14-3-3γ蛋白的影響

韋俊杰 李呂力 李曉峰 李燕華 陳 淵 張麗香 范秉林 陳 志 封 渾

(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 南寧 530021)

目的 探索依達(dá)拉奉對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦紅蛋白(Ngb)和14-3-3γ蛋白的影響。方法 采用大腦中動(dòng)脈閉塞法建立大鼠腦缺血再灌注模型，將48只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和依達(dá)拉奉預(yù)處理組；采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清Ngb和14-3-3γ水平，采用蛋白免疫印跡、免疫組化檢測(cè)腦組織中Ngb和14-3-3γ表達(dá)。結(jié)果 模型組大腦和血清的Ngb和14-3-3γ水平均高于假手術(shù)組(P<0.05)，依達(dá)拉奉預(yù)處理組大腦和血清的Ngb和14-3-3γ水平均高于模型組(P<0.05)。結(jié)論 依達(dá)拉奉能通過上調(diào)腦缺血再灌注大鼠血清和腦組織中Ngb和14-3-3γ水平發(fā)揮腦保護(hù)作用。

依達(dá)拉奉；腦缺血再灌注；大腦中動(dòng)脈閉塞；腦紅蛋白；14-3-3γ蛋白

依達(dá)拉奉具有清除自由基、抗凋亡、抑制黏附因子等作用〔1，2〕。缺血性腦卒中最有效的治療手段是超急性期的血管再通治療(溶栓和取栓等)，但是血管再通后會(huì)出現(xiàn)缺血再灌注損傷，導(dǎo)致病情加重，而神經(jīng)保護(hù)性蛋白能通過阻斷腦缺血再灌注病理損害的發(fā)生，防止或減輕缺血引起的腦損害。腦缺血后會(huì)誘導(dǎo)腦紅蛋白(Ngb)和14-3-3γ蛋白等神經(jīng)保護(hù)蛋白生成增多〔3〕。本實(shí)驗(yàn)擬探討依達(dá)拉奉是否通過調(diào)節(jié)Ngb 和 14-3-3γ蛋白表達(dá)對(duì)腦缺血再灌注損傷起到神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物和分組 健康清潔級(jí)成年雄性SD大鼠共48只，體重280～320 g，購于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和依達(dá)拉奉預(yù)處理組，每組16只。

1.2 主要試劑 依達(dá)拉奉溶液由南京先聲藥業(yè)公司提供，規(guī)格5 ml∶10 mg。Ngb、14-3-3γ兔抗大鼠多克隆抗體分別購自武漢博士德、美國(guó)ABGENT公司，Ngb、14-3-3γ 的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒均購于武漢華美公司。

1.3 方法

1.3.1 制模及干預(yù) 模型組和依達(dá)拉奉預(yù)處理組采用石蠟線栓法制作大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷模型，3.5%水合氯醛(10 ml/kg)腹腔注射麻醉后，將大鼠放在操作臺(tái)上，仰臥固定四肢，取頸部正中切口，剪毛消毒皮膚，剪開皮膚并鈍性分離組織肌肉，動(dòng)作輕柔避免損傷刺激迷走神經(jīng)，暴露頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈,結(jié)扎頸外動(dòng)脈，從頸總動(dòng)脈插線栓入頸內(nèi)動(dòng)脈，深度約20 mm，絲線固定，清創(chuàng)縫合傷口。缺血 2 h后再緩慢拔出栓子，使栓子頭端回到頸總動(dòng)脈內(nèi)即可。假手術(shù)組僅暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈后縫合，不做其余處理。依達(dá)拉奉預(yù)處理組于術(shù)前3 d開始，每日3 ml/kg體重分兩次腹腔注射依達(dá)拉奉溶液，直至動(dòng)物解剖。假手術(shù)組和模型組均于同時(shí)間段腹腔注射等體積的生理鹽水。

1.3.2 神經(jīng)功能評(píng)分 參照5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),待大鼠麻醉清醒后予以評(píng)分。0分，沒有神經(jīng)功能缺失癥狀；1 分，輕度局灶性神經(jīng)功能缺損(不能夠完全伸展左側(cè)前肢)；2分，中度局灶神經(jīng)功能缺損(向左側(cè)轉(zhuǎn)圈)；3分，重度神經(jīng)功能缺損(向左側(cè)傾斜)；4分，不能夠自發(fā)行走，意識(shí)水平降低。1～3分為模型制作成功，剔除死亡與不成功的動(dòng)物并重新選取SD大鼠制模成功后補(bǔ)充。

1.3.3 血清采集及檢測(cè) 缺血再灌注24 h后用3.5%水合氯醛(10 ml/kg)腹腔注射麻醉后經(jīng)心臟取靜脈血2 ml，3 000 r/min離心10 min后分離血清，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 ELISA 血清Ngb和14-3-3γ濃度檢測(cè)采用ELISA試劑盒按說明書進(jìn)行操作。在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量光密度值(OD值)。以標(biāo)準(zhǔn)物濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，用Curve Exert1.3軟件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算出樣本的實(shí)際濃度值。

1.3.5 蘇木素-伊紅(HE)染色 隨機(jī)取10只大鼠麻醉后經(jīng)左心室插管灌注生理鹽水，繼以4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(PBS)灌注，待灌注充分后解剖分離出大腦，將大腦浸泡在4℃的4%多聚甲醛中固定24 h，逐級(jí)予乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，切片行HE染色。經(jīng)脫蠟、脫水、蘇木素染色、伊紅液染色、封片后，置于200倍光學(xué)顯微鏡下觀察大腦梗死灶周邊區(qū)域。

1.3.6 免疫組化 取上述蠟塊行4 μm連續(xù)切片，經(jīng)脫蠟，脫水，抗原修復(fù)，血清封閉后，加入抗Ngb(1∶200)、抗14-3-3γ(1∶100)的一抗，4℃孵育過夜。加生物素標(biāo)記二抗孵育，清洗后再加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液孵育，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后在光學(xué)顯微鏡下觀察。陰性對(duì)照除以PBS代替一抗外，余步驟相同。陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。選取梗死灶周邊的5個(gè)隨機(jī)視野(40×10倍)，用Image pro-plus 6.0軟件對(duì)選定的視野進(jìn)行半定量檢測(cè)，測(cè)定每個(gè)視野的積分光密度值(IOD)和陽性面積(area)，計(jì)算平均積分光密度(IOD/area)。

1.3.7 蛋白免疫印跡 隨機(jī)取6只大鼠，麻醉后立即冰上取腦組織，加組織裂解液后勻漿、離心后提取總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法定量蛋白,取5 μg 蛋白加入SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，確定片段大小后，電印跡轉(zhuǎn)染到聚偏氟乙烯膜，封閉液(含5%脫脂奶粉的TBST)室溫1 h，繼之用目的蛋白Ngb(1∶5 000)、14-3-3γ(1∶5 000)和GAPDH(1∶10 000)的一抗4℃過夜孵育，TBST沖洗，再用結(jié)合辣根過氧化物酶的二抗孵育?；瘜W(xué)發(fā)光法顯現(xiàn)蛋白帶，拍照，用 Lab4.3對(duì)條帶進(jìn)行密度分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件行成組t檢驗(yàn)、單因素方差分析；兩組間差異比較當(dāng)方差齊時(shí)采用SNK檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Games-Howell檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色結(jié)果 假手術(shù)組腦組織HE染色未見病理性改變。模型組的梗死灶內(nèi)可見大量細(xì)胞壞死,組織溶解后留下空洞，梗死灶周圍均可見細(xì)胞數(shù)明顯減少、細(xì)胞腫脹,部分細(xì)胞的細(xì)胞核固縮、深染或溶解。依達(dá)拉奉預(yù)處理組梗死灶周圍的病理性損傷比模型組明顯減輕。見圖1。

2.2 血清Ngb 和14-3-3γ的濃度 模型組血清Ngb和14-3-3γ的濃度均高于假手術(shù)組(P<0.05)，而依達(dá)拉奉預(yù)處理組血清Ngb和14-3-3γ濃度均高于模型組(P<0.05)。見表1。

圖1 3組腦組織HE染色結(jié)果(×200)

組別Ngb14?3?3γ假手術(shù)組4123±794027±005模型組6694±11201)057±0101)依達(dá)拉奉預(yù)處理組11384±56701)2)095±0391)2)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05;與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.3 大腦Ngb和14-3-3γ的免疫組化表達(dá) 模型組大腦梗死灶附近的Ngb和14-3-3γ水平均高于假手術(shù)組(P<0.05)。相對(duì)于模型組，依達(dá)拉奉預(yù)處理組大腦的Ngb和14-3-3γ水平均明顯升高(P<0.05)。見表2，圖2，圖3。

2.4 大腦Ngb和14-3-3γ的蛋白表達(dá) 模型組患側(cè)大腦的Ngb和14-3-3γ蛋白表達(dá)均高于假手術(shù)組(P<0.05)。依達(dá)拉奉預(yù)處理組大腦的Ngb和14-3-3γ蛋白表達(dá)相對(duì)模型組均明顯升高(P<0.05)。見圖4，表3。

表2 3組大腦Ngb 和14-3-3γ的免疫組化表達(dá)

圖2 3組腦組織Ngb免疫組化(DAB，×200)

圖3 3組腦組織14-3-3γ免疫組化(DAB，×200)

組別Ngb14?3?3γ假手術(shù)組046±011035±016模型組068±0181)057±0211)依達(dá)拉奉預(yù)處理組094±0231)2)086±0241)2)

3 討 論

缺血性腦血管病病理生理機(jī)制復(fù)雜，其中腦缺血后再灌注損傷危害極大，腦缺血恢復(fù)血液再灌注后,其病理損傷反而進(jìn)一步加重，而神經(jīng)保護(hù)性蛋白能通過抑制凋亡等作用，從而防止或減輕缺血再灌注引起的腦損害，減少腦組織死亡和促進(jìn)組織修復(fù)〔4〕。本研究結(jié)果說明依達(dá)拉奉對(duì)腦缺血再灌注大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，依達(dá)拉奉能促進(jìn)腦缺血再灌注大鼠腦組織Ngb和14-3-3γ的生成。

14-3-3γ蛋白主要表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星型膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中，研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死患者梗死灶的14-3-3γ蛋白表達(dá)明顯升高，提示14-3-3γ蛋白在腦梗死灶發(fā)揮著重要作用〔5〕。在體外缺血模型中，14-3-3γ蛋白能抑制缺氧缺糖條件下神經(jīng)元或星型膠質(zhì)細(xì)胞的病理損傷及死亡〔6，7〕，本研究發(fā)現(xiàn)，依達(dá)拉奉能提高腦缺血灶的14-3-3γ蛋白表達(dá)，說明其腦保護(hù)作用機(jī)制之一是上調(diào)14-3-3γ的表達(dá)。Ngb是主要存在于神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的一種攜氧球蛋白,類似于血紅蛋白、肌紅蛋白等，可以和氧氣、二氧化碳等多種氣體配體結(jié)合，但Ngb比血紅蛋白對(duì)氧具有更高的親和力〔8〕。通過人腦組織的免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，腦卒中患者缺血半暗帶腦組織的Ngb表達(dá)較正常對(duì)照明顯增高〔9〕。Khan等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)的Ngb能有效減少缺血再灌注小鼠的腦梗死面積，說明Ngb對(duì)缺血性腦卒中具有腦保護(hù)作用。本研究也說明其腦保護(hù)作用機(jī)制之一是促進(jìn)Ngb的生成。

依達(dá)拉奉對(duì)Ngb和14-3-3γ的調(diào)節(jié)作用可能涉及以下機(jī)制：Ngb既是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的攜氧球蛋白，又是氧自由基的清除劑〔11〕；依達(dá)拉奉能清除缺血再灌注后的氧自由基，從而減少氧自由基對(duì)Ngb的消耗，促進(jìn)Ngb的高表達(dá)。14-3-3γ蛋白在腦缺血再灌注中多作為一種信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)分子發(fā)揮作用〔3〕，Ye等〔12〕學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，沉默Ngb的表達(dá)會(huì)下調(diào)氧化損傷后神經(jīng)細(xì)胞的14-3-3γ表達(dá)，說明Ngb對(duì)14-3-3γ的表達(dá)有促進(jìn)作用。本研究中依達(dá)拉奉可上調(diào)腦缺血再灌注大鼠的腦組織14-3-3γ的表達(dá)，該作用機(jī)制可能與其上調(diào)Ngb表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)14-3-3γ的生成有關(guān)。

通過本次研究發(fā)現(xiàn)，依達(dá)拉奉能上調(diào)腦缺血再灌注大鼠血清和大腦的Ngb和14-3-3γ蛋白表達(dá)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。然而本研究主要是體內(nèi)試驗(yàn)，還需完善體外試驗(yàn)進(jìn)一步了解依達(dá)拉奉的調(diào)節(jié)機(jī)制，以期發(fā)現(xiàn)更多腦缺血的有效治療靶點(diǎn)和作用機(jī)制。

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〔2016-06-07修回〕

(編輯 郭 菁)

Effect of edaravone on neuroglobin and 14-3-3γ protein in rats with middle cerebral artery ischemia-reperfusion

WEI Jun-Jie,LI Lü-Li,LI Xiao-Feng,etal.

Department of Neurology,Guangxi Zhuang Autonomous Region People's Hospital,Nanning 530021,Guangxi,China

Objective To explore the effect of edaravone on neuroglobin(Ngb) and 14-3-3γ protein in rats with middle cerebral artery ischemia-reperfusion(I/R).Methods Rat model of I/R and reperfusion were established by the cerebral artery occlusion method. 48 male SD rats were randomly divided into sham operation,model and edaravone-pretreated groups. The expressions of Ngb and 14-3-3γ were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA),immunohistochemistry and Western blot.Results The Ngb and 14-3-3γ levels of brain and serum in model group were higher than those of sham operation group (P<0.05),while Ngb and 14-3-3γ expressions were higher in edaravone-pretreated group compared to those of model group (P<0.05). Conclusions Edaravone has a protective effect against middle cerebral artery I/R by enhancing Ngb and 14-3-3γ.

Edaravone;Cerebral ischemia-reperfusion;Cerebral artery occlusion;Neuroglobin;14-3-3γ protein

國(guó)家自然科學(xué)基金(81460192);廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2011GXNSFA018185)

李呂力(1959-)，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事腦血管疾病研究。

韋俊杰(1987-)，男，碩士，住院醫(yī)師，主要從事腦血管疾病研究。

R743.3

A

1005-9202(2017)10-2394-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.004