潘寶龍 巫 玲 馬潤玫

(昆明醫(yī)科大學(xué)，云南 昆明 650031)

脂肪因子Omentin-1、Visfatin體外表達(dá)與老年2型糖尿病胰島素抵抗的關(guān)系

潘寶龍 巫 玲 馬潤玫

(昆明醫(yī)科大學(xué)，云南 昆明 650031)

目的 探討脂肪因子Omentin-1、Visfatin與老年2型糖尿病(T2DM)胰島素抵抗(IR)的內(nèi)在聯(lián)系。方法 復(fù)蘇、傳代及誘導(dǎo)分化老年人源T2DM前脂肪細(xì)胞，構(gòu)建 Omentin-1、Visfatin過表達(dá)載體，進(jìn)行載體轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)和提?。灰?個(gè)不同過表達(dá)梯度(1.0、2.5、5.0 μg)轉(zhuǎn)染傳代脂肪細(xì)胞，以無轉(zhuǎn)染組為對(duì)照；Q-PCR檢測Omentin-1、Visfatin、胰島素受體底物 (IRS)-1/2、磷脂酰肌醇-3激酶〔PI3K(P85a)〕 mRNA表達(dá)，Western印跡檢測Omentin-1、Visfatin、IRS-1、IRS-2、PI3K(P85a) 蛋白表達(dá)及IRS-1/2酪氨酸磷酸化水平，〔3H〕-2-脫氧-D-葡萄糖攝取測定細(xì)胞葡萄糖攝取率的變化。結(jié)果 ①Omentin-1、Visfatin mRNA及蛋白表達(dá)隨轉(zhuǎn)染濃度梯度升高而表達(dá)量增加，所構(gòu)建的Omentin-1、Visfatin過表達(dá)載體有效；②隨Omentin-1表達(dá)增加，IRS-1及PI3K(P85a) mRNA和蛋白表達(dá)及IRS-1磷酸化程度均出現(xiàn)明顯增加，IRS-2未出現(xiàn)明顯變化；③隨Visfatin表達(dá)增加，IRS-1/2、PI3K(P85a) mRNA、蛋白表達(dá)及IRS-1/2磷酸化程度未出現(xiàn)明顯變化；④脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取率隨Omentin-1表達(dá)增加而升高，而與Visfatin過表達(dá)濃度變化無明顯關(guān)系。結(jié)論 Omentin-1表達(dá)可能通過某種途徑激活了胰島素受體后信號(hào)傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致了IRS-1和PI3K活化和表達(dá)，從而發(fā)揮其胰島素增敏作用；Visfatin在老年T2DM血清中的高表達(dá)，很可能只是一種肥胖、T2DM糖脂代謝紊亂的補(bǔ)償機(jī)制，與T2DM IR的發(fā)生沒有必然聯(lián)系。

2型糖尿病(T2DM)；Omentin-1；Visfatin；胰島素抵抗；胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路

2型糖尿病(T2DM)的病因尚不明確，胰島素抵抗(IR)是目前公認(rèn)的T2DM發(fā)病的生理病理基礎(chǔ)，而胰島素信號(hào)通路異常是IR發(fā)生的主要原因〔1，2〕。近年來，來源于脂肪組織的脂肪因子與T2DM的關(guān)系已成為新的研究熱點(diǎn)〔3，4〕。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，老年T2DM患者血清中脂肪因子Omentin-1明顯降低，與體重指數(shù)(BMI)、空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)及胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)呈明顯負(fù)相關(guān)；而脂肪因子Visfatin明顯升高，與T2DM患者BMI、FPG、血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)呈明顯正相關(guān)，提示兩者可能與T2DM的IR存在關(guān)聯(lián)〔5〕。為進(jìn)一步探討脂肪因子Omentin-1、Visfatin與老年T2DM IR是否存在必然聯(lián)系，課題組在前期研究基礎(chǔ)上，以體外培養(yǎng)老年T2DM脂肪細(xì)胞為載體，檢測Omentin-1、Visfatin不同程度過表達(dá)狀態(tài)下，脂肪細(xì)胞中胰島素受體下游信號(hào)分子胰島素受體底物(IRS)-1/2、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K) mRNA及蛋白表達(dá)，IRS-1/2酪氨酸磷酸化水平的變化及細(xì)胞葡萄糖攝取率的變化，從胰島素經(jīng)典信號(hào)傳導(dǎo)通路(IRS-1/2、PI3K)探討Omentin-1、Visfatin與T2DM IR的內(nèi)在聯(lián)系。

1 材料和方法

1.1 人前脂肪細(xì)胞復(fù)蘇及傳代培養(yǎng) 將之前凍存細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇和傳代，具體操作方法參考文獻(xiàn)〔6〕。老年人T2DM大網(wǎng)膜前脂肪細(xì)胞的獲取，主要由老年T2DM腹腔手術(shù)患者提供，符合人體試驗(yàn)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得患者的知情同意。

1.2 人源Omentin-1、Visfatin過表達(dá)載體構(gòu)建 由廣州復(fù)能基因公司協(xié)助構(gòu)建，制作感受態(tài)細(xì)胞，Omentin-1、Visfatin質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染大腸桿菌，篩選陽性克隆及擴(kuò)大培養(yǎng)，抽提無內(nèi)毒素級(jí)別質(zhì)粒，最終得到濃度為Omentin-1：0.495 μg/μl，Visfatin：0.601 μg/μl。

1.3 Omentin-1、Visfatin過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)脂肪細(xì)胞 將Omentin-1和Visfatin過表達(dá)載體分別按照0、1.0、2.5、5.0 μg 4個(gè)濃度梯度轉(zhuǎn)染T2DM人源第3代傳代脂肪細(xì)胞，每個(gè)濃度轉(zhuǎn)染6孔，文中所有檢測均為6孔同時(shí)檢測，以均值表示結(jié)果。

1.4 Q-PCR 檢測細(xì)胞中mRNA 表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后，提取細(xì)胞總蛋白和總RNA，按照設(shè)置以Q-PCR分別檢測Omentin-1、Visfatin、IRS-1、IRS-2、PI3K的mRNA表達(dá)。Omentin-1上游引物：5'-AGCAGGGCAGCAAAGCAG-5'，下游引物：5'-TGGGGGACTTATTGGGCAC-5';Visfatin上游引物:5'-AGCTGTTCCTGAGGGCTTTGTCAT-5',下游引物:5'-TGGCCACTGTGATTGGATACCAGG-5';GAPDH上游引物：5'-CGACAGTCAGCCGCATCT-3',下游引物：5'-ATGAGTCCTCCACGATACCAA-3';PI3K(P85a)上游引物：5'-GGCTGCTAGCCTGCTCTG-3',下游引物：5'-CTTCCTIAAGTCACGCACGAT-3';IRS-2上游引物：5'-AAAACGACCACAGTCCTACCTC-3',下游引物：5'-CACCTCCCACACCCAATACA-3';IRS-1上游引物：5'-AATGTCTGTTGTAAAGAGTGGAGC-3',下游引物：5'-GAACTCAGCTCAACATCAGGTAT-3'。按2-△△ct計(jì)算各樣本相對(duì)拷貝值。

1.5 Western印跡檢測細(xì)胞中蛋白表達(dá) 用BCA蛋白定量試劑盒測定樣品中蛋白含量，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育抗體及顯影。分別按組檢測細(xì)胞中Omentin-1、Visfatin、IRS-1、IRS-2、PI3K的蛋白表達(dá)。檢測不同濃度Omentin-1、Visfatin過表達(dá)載體組的IRS-1、IRS-2酪氨酸磷酸化水平。

1.6 〔3H〕-2-脫氧-D-葡萄糖(〔3H〕-2DG)攝取測定法檢測Omentin-1、Visfatin不同濃度質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后葡萄糖的攝取率 〔3H〕-2DG攝取率=計(jì)數(shù)分鐘衰變數(shù)×2/蛋白濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度Omentin-1、Visfatin過表達(dá)組細(xì)胞中mRNA 及蛋白表達(dá) >0、1.0、2.5、5.0 μg Omentin-1組mRNA表達(dá)量分別為1.00、34.11、207.72、1 104.35，蛋白表達(dá)量分別為1.00、1.44、1.96、4.57；0、1.0、2.5、5.0 μg Visfatin組mRNA表達(dá)量分別為1.00、7.57、1 107.52、8 995.76，蛋白表達(dá)量分別為1.00、2.67、4.59、4.98。Omentin-1、Visfatin mRNA及蛋白表達(dá)隨過表達(dá)梯度升高而升高，構(gòu)建的Omentin-1、Visfatin過表達(dá)載體有效。

2.2 不同濃度Omentin-1過表達(dá)組IRS-1、IRS-2、PI3K(P85a)mRNA表達(dá)情況 隨Omentin-1表達(dá)(0、1.0、2.5、5.0 μg)增加IRS-1(依次為1.00、1.41、1.61、2.97)，PI3K(P85a) mRNA(依次為1.00、1.04、1.21、20.06)也呈現(xiàn)明顯增加，而IRS-2 mRNA(依次為1.00、0.92、0.98、0.95)未發(fā)生明顯變化。

2.3 不同濃度Visfatin過表達(dá)組IRS-1、IRS-2、PI3K(P85a)的mRNA表達(dá)情況 隨Visfatin表達(dá)增加(0、1.0、2.5、5.0 μg)，IRS-1(依次為1.00、0.93、0.98、0.96)、IRS-2(依次為1.00、0.90、0.97、0.97)、PI3K(P85a)mRNA(依次為1.00、0.93、0.85、0.94)表達(dá)均未見明顯變化。

2.4 不同濃度Omentin-1過表達(dá)組IRS-1、IRS-2、PI3K蛋白表達(dá) 隨Omentin-1表達(dá)增加(0、1.0、2.5、5.0 μg)，IRS-1(依次為0.59、0.82、1.43、1.77)、PI3K(P85a)(依次為0.14、0.29、0.54、0.76)蛋白表達(dá)明顯增加，IRS-2蛋白表達(dá)(依次為0.70、0.78、0.75、0.79)未見明顯變化。見圖1。

圖1 Omentin-1過表達(dá)組IRS-1、IRS-2、PI3K(P85a)蛋白表達(dá)

2.5 不同濃度Visfatin過表達(dá)組IRS-1、IRS-2、PI3K蛋白表達(dá) 隨Visfatin表達(dá)增加(0、1.0、2.5、5.0 μg)，IRS-1(依次為1.66、1.71、1.67、1.69)、IRS-2(依次為1.51、1.42、1.49、1.53)、PI3K(P85a)(依次為1.44、1.39、1.43、1.49) 蛋白表達(dá)無明顯變化，見圖2。

2.6 不同濃度Omentin-1過表達(dá)組的IRS-1、IRS-2酪氨酸磷酸化水平 隨Omentin-1表達(dá)增加(0、1.0、2.5、5.0 μg)，IRS-1磷酸化程度明顯升高(依次為0.56、0.61、1.21、1.34)，IRS-2磷酸化程度(依次為1.19、1.04、1.14、0.97)未發(fā)生明顯變化，見圖3。

2.7 不同濃度Visfatin過表達(dá)組的IRS-1、IRS-2酪氨酸磷酸化水平 隨Visfatin表達(dá)增加(0、1.0、2.5、5.0 μg)，IRS-1(依次為1.28、1.31、1.30、1.35)、IRS-2(依次為0.62、0.56、0.51、0.57)酪氨酸磷酸化程度均未出現(xiàn)明顯變化，見圖4。

2.8 〔3H〕-2-脫氧-D-葡萄糖攝取測定檢測不同濃度Omentin-1、Visfatin過表達(dá)組脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取率 隨Omentin-1表達(dá)增加，脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取率明顯上升(0 μg為1，1.0 μg為1.21，2.5 μg為1.26，5.0 μg為1.44)；而隨Visfatin表達(dá)增加，脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取率變化不明顯(0 μg為1，1.0 μg為0.97，2.5 μg為0.97，5.0 μg為1.01)。

圖2 Visfatin過表達(dá)組IRS-1、IRS-2、PI3K(P85a)蛋白表達(dá)

圖3 Western印跡檢測IRS-1、IRS-2磷酸化水平

圖4 Visfatin過表達(dá)組IRS-2磷酸化水平

3 討 論

T2DM容易出現(xiàn)多種并發(fā)癥，包括大血管并發(fā)癥(如動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病)，外周血管病變，慢性微血管并發(fā)癥(腎臟病變、視網(wǎng)膜病變等)，周圍神經(jīng)及自主神經(jīng)病變，非酮癥高血糖高滲性昏迷等〔7〕。

目前對(duì)于基因表達(dá)與疾病的關(guān)系研究多以體外實(shí)驗(yàn)方式進(jìn)行，常見的是細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型。學(xué)術(shù)界針對(duì)脂肪展開的生物學(xué)研究，多數(shù)實(shí)驗(yàn)樣本均采用嚙齒類動(dòng)物脂肪細(xì)胞〔8，9〕。尤其對(duì)于人脂肪細(xì)胞的研究，更多是采用了小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞。不可忽視的一個(gè)影響因素是，嚙齒類動(dòng)物與人類存在明顯的遺傳學(xué)差異，且兩者之間的代謝途徑也迥然不同，因而，將其作為實(shí)驗(yàn)樣本往往難以避免潛在的實(shí)驗(yàn)缺陷問題，從而影響數(shù)據(jù)和結(jié)論的科學(xué)性。相對(duì)而言，作為一種特異化的前體細(xì)胞，人體中的前脂肪細(xì)胞具有增殖和向脂肪細(xì)胞定向分化的能力，在人的一生中均存在并持續(xù)作用，且與糖尿病、肥胖、動(dòng)脈硬化等代謝類疾病的關(guān)系較為密切〔10〕。

本研究結(jié)果充分說明：(1)所構(gòu)建T2DM網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞原代培養(yǎng)及增殖分化模型真實(shí)有效，具有正常生理功能和表達(dá)能力；(2)所構(gòu)建Omentin-1、Visfatin過表達(dá)載體有效，隨梯度增加而表達(dá)增加。

目前眾多研究理論認(rèn)為，IR主要由受體后信號(hào)傳導(dǎo)的異常引起〔11，12〕。胰島素受體的信號(hào)傳導(dǎo)主要經(jīng)過兩個(gè)途徑，即PI3K途徑和Ras-絲分裂原激活的蛋白激酶(Ras-MAPK)途徑。PI3K途徑是胰島素受體信號(hào)傳導(dǎo)的經(jīng)典途徑，也是胰島素對(duì)代謝調(diào)節(jié)的主要途徑，主要作用于葡萄糖攝取，糖原合成和降解的調(diào)節(jié)；Ras-MAPK途徑主要與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控有關(guān)，主要作用于細(xì)胞生長和分化的調(diào)節(jié)〔13〕。兩條途徑相互獨(dú)立，在一定條件下，也能相互激活。其中，IRS是胰島素信號(hào)通路的關(guān)鍵物質(zhì)。目前已發(fā)現(xiàn)的IRS分子包括4個(gè)亞型(IRS-1、IRS-2、IRS-3、IRS-4)。IRS-1是胰島素信號(hào)傳導(dǎo)的“船塢”蛋白，目前研究認(rèn)為ISR-1的表達(dá)可能與具有T2DM家族史的患者密切相關(guān)，ISR-1表達(dá)不足或者磷酸化異?？蓪?dǎo)致胰島素對(duì)抗〔14〕。IRS-2在胰島素對(duì)抗，T2DM的發(fā)生中起著極其重要的作用，一旦IRS-2的表達(dá)出現(xiàn)異常，機(jī)體將很快出現(xiàn)糖尿病樣癥狀〔15〕。

本研究結(jié)果提示，Omentin-1與T2DM IR存在緊密聯(lián)系，表現(xiàn)為隨Omentin-1表達(dá)程度的增加，細(xì)胞中IRS-1和PI3K(P85a)也隨之升高，并且伴隨IRS-1磷酸化程度明顯升高，這些變化導(dǎo)致了胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路的活化，提高了機(jī)體對(duì)胰島素敏感性，促進(jìn)了網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞等對(duì)葡萄糖的攝取。而Visfatin與IRS-1、IRS-2、PI3K(P85a)并不存在明顯關(guān)聯(lián)，Visfatin的表達(dá)增強(qiáng)，并不會(huì)導(dǎo)致胰島素受體下游信號(hào)分子IRS-1、IRS-2、PI3K(P85a)的變化，即Visfatin與T2DM伴IR患者PI3K經(jīng)典途徑基本不存在關(guān)系，Visfatin的升高不會(huì)導(dǎo)致T2DM的IR，不存在因和果的關(guān)系。

Omentin分為Omentin-1及Omentin-2，Omentin-1由網(wǎng)膜脂肪組織中的血管基質(zhì)細(xì)胞分泌入血，或作用于周圍脂肪細(xì)胞發(fā)揮其生物學(xué)作用。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)道，重組Omentin-1可促進(jìn)皮下及網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，提高胰島素敏感性，是胰島素“增敏因子”，但具體機(jī)制尚不明確〔16〕。本課題通過胰島素受體后信號(hào)傳導(dǎo)通路的表達(dá)研究，對(duì)此機(jī)制做出了一定的解釋。本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)，隨老年T2DM患者體重增加(BMI值增高)及HOMA-IR的升高，血清Omentin-1下降就越明顯，Omentin-1表達(dá)降低提示IR的發(fā)生，并且與IR程度呈反比。結(jié)合課題組前期研究，可以認(rèn)為Omentin-1與T2DM IR存在緊密的聯(lián)系，是機(jī)體的保護(hù)因子，對(duì)肥胖、T2DM等具有拮抗作用，Omentin-1的表達(dá)可能通過某種途徑激活了IRS-1/PI3K(P85a)信號(hào)通路，間接導(dǎo)致了IRS-1和PI3K的活化和表達(dá)，并且促進(jìn)了IRS-1的磷酸化，從而提高脂肪細(xì)胞葡萄糖的攝取，發(fā)揮其胰島素增敏作用，而與IRS-2沒有明顯關(guān)系，Omentin-1水平的下降是引起老年T2DM IR的重要因素之一。

研究認(rèn)為，Visfatin是與肥胖、IR及T2DM密切相關(guān)的脂肪因子之一，在T2DM患者，由于IR的存在，血糖水平不斷增高，血糖的升高可刺激脂肪組織分泌更多Visfatin來提高胰島素敏感性〔17，18〕。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)BMI、TG、FPG、OGTT 2 h是老年T2DM血清Visfatin的獨(dú)立預(yù)測因子，本研究結(jié)果認(rèn)為Visfatin與T2DM胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路受體下游分子IRS-1、IRS-2、PI3K(P85a)不存在明顯關(guān)聯(lián)，Visfatin的升高并不會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗及T2DM的發(fā)生，相反，Visfatin在T2DM血清及網(wǎng)膜脂肪組織中的高表達(dá)，很可能只是一種肥胖、T2DM糖脂代謝紊亂的補(bǔ)償機(jī)制，僅作為一種肥胖及糖脂代謝紊亂的生物學(xué)標(biāo)志，與T2DM患者IR的發(fā)生沒有必然聯(lián)系。

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〔2016-12-11修回〕

(編輯 李相軍)

Effect of Omentin-1 and Visfatin over expression in vitro on insulin signal transduction pathway of type 2 diabetes

PAN Bao-Long, WU Ling, MA Run-Mei.

Kunming Medical University, Kunming 650031, Yunnan, China

Objective To investigate the relationship between Omentin-1, Visfatin and insulin resistance in type 2 diabetes (T2DM) from the classic insulin signaling pathways (PI3K pathway).Methods T2DM preadipocyte cells were recoveried, extended and differentiated to build Omentin-1, Visfatin over expression carrier, and then were transformated, cultivated and the plasmids were extracted. Adipocytes were transfected with 3 different over expression levels (1.0 μg, 2.5 μg ,5.0 μg) and extended, with no transfection group was selected as control group. The expressions of Omentin-1, Visfatin, insulin receptor substrate (IRS)-1/2, phosphatidy inositol 3 kinase 〔PI3K (P85a)〕mRNA were examined by Q-PCR, protein expression of Omentin-1,Visfatin, IRS-1, IRS-2, PI3K (P85a) and IRS-1/2 phosphorylation levels were detected by Western blot, glucose uptake rates in different concentration of plasmid transfection was detected with 〔3H〕-2-deoxidation-D-glucose uptake assay.Results Omentin-1 and Visfatin mRNA and protein expression were increased with increasing of concentration of plasmid transfection, which indicated that the constructed over expression carrier of Omentin-1 and Visfatin were effective. With the Omentin-1 expression increasing, the mRNA and protein expression of IRS-1 and PI3K (P85a) increased obviously, so did the IRS-1 phosphorylation, but IRS-2 had no obvious changes. With the Visfatin expression increasing, all of the mRNA, protein and phosphorylation in IRS-1/2 and PI3K (P85a) had no obvious changes. Glucose uptake rate of adipocytes elevated with the increasing expression of Omentin-1 and had no obvious changes with Visfatin increasing expression. Conclusions The expression of Omentin-1 might activate signaling pathways of IRS-1 and PI3K (P85) by some way and lead to the excitation and expression of IRS-1 and PI3K indirectly, which plays a role of insulin sensitization. The high expression of Visfatin in T2DM serum may be probably a compensation mechanism of obesity and sugar lipid metabolic disorder of T2DM, there is no connection with the occurrence of insulin resistance.

Type 2 diabetes mellitus (T2DM); Omentin-1;Visfatin;Insulin resistance (IR);Insulin signaling pathways

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81160082)

馬潤玫(1962-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)及胰島素抵抗研究。

潘寶龍(1973-)，男，在讀博士，副教授，主要從事胰島素抵抗研究。

R587.1

A

1005-9202(2017)10-2356-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.006