宋 伍 劉 智 羅浩銘 張 馳 姜 爽

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117)

5'-α、β-亞甲基-二磷酸腺苷對阿爾茨海默病小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦透析液中腺苷水平的影響

宋 伍 劉 智 羅浩銘 張 馳 姜 爽

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117)

目的 探討5′核苷酸酶(CD73)抑制劑5′-α，β-亞甲基-二磷酸腺苷(APCP)對Aβ1～42誘導(dǎo)的阿爾茨海默病(AD)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力和海馬細(xì)胞外液腺苷的影響。方法 50只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、APCP低劑量組(1 mg/kg)、中劑量組(3 mg/kg)及高劑量組(10 mg/kg)。側(cè)腦室注射Aβ1～42制備AD模型。采用自發(fā)活動、Y迷宮測定、筑巢實(shí)驗(yàn)Morris水迷宮考察學(xué)習(xí)記憶和工作記憶能力；在體腦微透析結(jié)合高效液相檢測細(xì)胞外液腺苷含量。結(jié)果 CD73抑制劑APCP能夠顯著提高AD小鼠工作學(xué)習(xí)記憶能力并提高小鼠的中樞興奮性；AD小鼠海馬腺苷水平顯著高于空白組，單次和長期給APCP均能顯著降低海馬細(xì)胞外腺苷含量(均P<0.05)。結(jié)論 CD73抑制劑APCP改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力與減少海馬細(xì)胞外腺苷含量有關(guān)。

5'核苷酸酶；阿爾茨海默病

腺苷作為一種神經(jīng)遞質(zhì)在腦內(nèi)的變化與阿爾茨海默病(AD)的病情密切相關(guān)〔1〕。有研究認(rèn)為AD發(fā)病過程伴隨著腺苷受體興奮，進(jìn)而通過受體介導(dǎo)的信號通路引起一系列神經(jīng)病理變化導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷〔2〕。因此，抑制或逆轉(zhuǎn)腺苷介導(dǎo)的損傷可能會成為AD預(yù)防和治療的有效策略。從神經(jīng)遞質(zhì)角度分析，腦內(nèi)突觸間隙腺苷水平受細(xì)胞外5′核苷酸酶(CD73)調(diào)控，由囊泡釋放的ATP和ADP在細(xì)胞外代謝〔3，4〕，抑制CD73酶可能會通過減少腺苷水平起到防治AD的作用。此外，CD73在免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)生長、抗腫瘤等方面具有重要作用，在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制中越來越被重視〔5〕。本研究旨在探討CD73抑制劑5′-α，β-亞甲基-二磷酸腺苷(APCP)對AD小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力及腦透析液中核苷水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 雄性昆明種小鼠，體重(25±2)g，由長春中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供；Aβ1～42和APCP購于美國Sigma公司；人工腦脊液(Ringer液)組成：NaCl 147 mmol/L，KCl 4 mmol/L，CaCl22.3 mmol/L，其他試劑均為市售分析純。小鼠腦立體定位儀：深圳市瑞沃德生命科技有限公司；高效液相：美國Waters 2795；紫外檢測器：美國Waters 2487；Morris水迷宮：由上海軟隆科技有限公司提供。

1.2 造模與給藥 50只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、APCP低、中、高劑量組。每組動物麻醉后固定頭部，側(cè)腦室緩慢注射人工腦脊液(空白組)或Aβ1～42(每只1.5 nmol/5 μl)。隨后空白組和模型組每天注射生理鹽水(0.1 ml/10 g)，APCP低、中、高劑量組每日分別腹腔注射APCP(1、3、10 mg/kg)，1次/d。Aβ1～42注射后第8天進(jìn)行自發(fā)活動和Y迷宮測定，第9～14天進(jìn)行筑巢實(shí)驗(yàn)，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后(第14天)進(jìn)行腦微透析實(shí)驗(yàn)，隨后進(jìn)行高效液相色譜檢測。另取小鼠60只用于Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為空白組、模型組、APCP低、中、高劑量組和陽性藥多奈哌齊組(1 mg/kg)，造模方法同上。給藥14 d后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。24只小鼠隨機(jī)分為4組，每組6只，用于急性APCP對腺苷水平影響的檢測。

1.3 自發(fā)活動 小鼠自發(fā)活動箱尺寸為30×30×45 cm3，箱體底部和壁為黑色，頂部有紅外光源和攝像機(jī)。實(shí)驗(yàn)開始時，將小鼠放入箱中，小鼠自由活動5 min后開始記錄，自主活動共采集30 min。

1.4 Morris水迷宮 采用軟件記錄訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)和定位航行實(shí)驗(yàn)中小鼠的逃避距離和逃避潛伏期。

1.5 Y迷宮實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)開始時，小鼠任意面對某一臂放入中心區(qū)域，自由探索10 min，記錄每只小鼠進(jìn)入臂的總次數(shù)和順序。

1.6 筑巢實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)開始前動物單籠飼養(yǎng)3 d，自由飲水?dāng)z食。在第4天，將同規(guī)格等量的衛(wèi)生紙裁剪成2×2 cm2的小塊置于籠內(nèi)。2 d后進(jìn)行筑巢實(shí)驗(yàn)檢測。評分方法：將籠子底部區(qū)域平均分成6個區(qū)域(2×3)，碎紙屑占滿一個格計1分，占1/4～3/4計0.5分。

1.7 腦微透析實(shí)驗(yàn) 用水合氯醛麻醉實(shí)驗(yàn)小鼠，固定于腦立體定位儀，切開頭部皮膚，暴露顱骨。用腦立體定位儀確定海馬位置：前囟后2.1 mm，垂直向下2.5 mm，旁開1.8 mm。將透析探針由一側(cè)植入腦內(nèi)，小鼠蘇醒后24 h可進(jìn)行灌流透析。透析探針一側(cè)與自動灌流泵連接，另一側(cè)連接EP管(200 μl)。灌流速度為4 μl/min，透析開始后棄去前2 h的透析液，每15 min收集樣品。基礎(chǔ)值測定至少保證連續(xù)3個樣品含量誤差<5%。液相條件：色譜柱C18(4.6 μm×250 mm)；流動相0.02 mol/L NaH2PO4，2%乙腈，pH調(diào)至4；波長260 nm；流速1 ml/min。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 自發(fā)活動 與空白組(1 264.76±86.10)相比，模型組30 min內(nèi)自發(fā)活動(1 149.15±78.33)無顯著變化(P>0.05)；與模型組相比，APCP中、高劑量組自發(fā)活動數(shù)(1 546.82±143.09，1 581.03±130.58)顯著增加(P<0.05)，而低劑量組(1 202.56±138.64)與模型組無顯著性差異(P>0.05)。

2.2 筑巢實(shí)驗(yàn) 相比空白組(1.35±0.14)，模型組小鼠筑巢評分(2.46±0.32)顯著增高(P<0.01)；與模型組相比，APCP中、高劑量組筑巢評分(1.63±0.26，1.52±0.14)顯著降低(P<0.05)。低劑量組為(2.74±0.30)。

2.3 Y迷宮 與空白組相比，模型組小鼠完成穿梭次數(shù)增加，正確進(jìn)入壁時間縮短(P<0.05)；與模型組相比，APCP高劑量組顯著縮短穿梭次數(shù)及增加正確入壁時間，中劑量組能夠顯著增加正確入壁時間(P<0.05)。見表1。

2.4 Morris水迷宮 見圖1。與空白組相比，模型組小鼠在水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)的逃避潛伏期和逃避距離顯著增加(P<0.05)。與模型組相比，APCP中劑量組在第3、4、5天顯著縮短逃避潛伏期和第4、5天的逃避距離(P<0.05)；APCP高劑量組顯著降低第5天的逃避潛伏期和逃避距離(P<0.05)。陽性藥多奈哌齊對Aβ誘導(dǎo)的逃避潛伏期和逃避距離也有顯著降低作用(P<0.05)。低劑量APCP無顯著作用。

表1 APCP對Y迷宮中工作能力的影響

與空白組比較：1)P<0.05，與模型組比較：2)P<0.05，下圖同

圖1 APCP對AD小鼠在Morris水迷宮中逃避潛伏期和逃避距離的影響

2.5 APCP急性給藥對海馬細(xì)胞外腺苷釋放的影響 急性給予生理鹽水或APCP，基礎(chǔ)值設(shè)為100%，與生理鹽水相比，APCP高劑量組急性給藥在120 min內(nèi)顯著降低海馬細(xì)胞外透析液中腺苷釋放水平(P<0.05)，最大降低至基礎(chǔ)值(52.73±9.02)%。見圖2。

與生理鹽水比較：1)P<0.05圖2 APCP急性給藥對海馬細(xì)胞外腺苷釋放的影響

2.6 APCP給藥14 d對AD小鼠海馬細(xì)胞外腺苷基礎(chǔ)水平的影響 與生理鹽水組〔(276.76±34.52)μmol/L〕相比，模型組腺苷水平〔(383.42±21.08)μmol/L〕顯著增高(P<0.05)，APCP中、高劑量組細(xì)胞外腺苷基礎(chǔ)水平〔(211.56±16.00)、(229.05±24.66)μmol/L〕顯著降低(P<0.05)。APCP低劑量組腺苷水平〔(256.42±54.12)μmol/L〕變化不明顯。

3 討 論

近些年大量研究證實(shí)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腺嘌呤核苷酸(ATP、ADP)和腺嘌呤核苷(腺苷)作為神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)，通過作用于各自的特異性受體在神經(jīng)退行性疾病，特別是AD發(fā)病和保護(hù)中發(fā)揮了重要的作用〔3〕。從“嘌呤能信號系統(tǒng)”變化的角度尋找與AD相關(guān)的新的病理靶點(diǎn)，不僅為解釋神經(jīng)系統(tǒng)生理功能及其病理過程提供了新的思路，也將成為有效防治AD的重要策略之一。本研究發(fā)現(xiàn)CD73抑制劑APCP能夠顯著改善AD模型小鼠工作記憶能力，并提高小鼠的中樞興奮性。此外，AD小鼠海馬腺苷水平較高，單次給藥和長期給APCP能夠顯著降低海馬細(xì)胞外腺苷含量。

目前對腺苷及腺苷受體在AD發(fā)病過程中的作用仍有爭議，特別是A1受體和A2a受體頗受關(guān)注?，F(xiàn)有研究證實(shí)，AD病程中腦內(nèi)腺苷A1受體的表達(dá)下降是比較明確的〔6，7〕，而腺苷A2a受體在AD模型動物腦內(nèi)表達(dá)反而有增高趨勢〔8〕。盡管腺苷受體的變化趨勢仍有爭議，但腺苷受體在AD發(fā)病和防治中的作用研究結(jié)果卻一致表現(xiàn)為抑制腺苷受體對AD的保護(hù)作用。本研究通過工具藥APCP抑制CD73活性，通過減少突觸間隙腺苷水平同樣起到保護(hù)作用。

與上述腺苷受體的作用相反，ATP受體特別是P2Y受體拮抗劑能夠損傷學(xué)習(xí)記憶功能，而其激動劑對AD起到保護(hù)作用。如在AD病人的尸檢中發(fā)現(xiàn)P2Y2受體表達(dá)減少〔9〕；沉默P2Y2受體基因增加了AD小鼠的死亡率，增加了神經(jīng)功能缺陷及導(dǎo)致Aβ更多堆積〔10〕。Kim等〔11〕發(fā)現(xiàn)，P2Y2受體上調(diào)和激活能夠增加小膠質(zhì)細(xì)胞對Aβ1～42的吞噬和攝取?？梢?，CD73是細(xì)胞外嘌呤能傳導(dǎo)的“平衡點(diǎn)”，從而參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)嘌呤能神經(jīng)遞質(zhì)釋放的調(diào)節(jié)，因而有望成為AD治療的潛在靶點(diǎn)。盡管筆者發(fā)現(xiàn)了APCP導(dǎo)致透析液中腺苷水平下降，但與此同時腦內(nèi)ATP、ADP作為P2Y受體的配體也可能會增加，這也可能是APCP發(fā)揮作用的另一種機(jī)制。

本研究結(jié)果推測在AD的發(fā)病過程中，腦內(nèi)核苷-核苷酸受體的平衡被打破，表現(xiàn)為腺苷受體下調(diào)和P2Y受體上調(diào)，同時伴隨有遞質(zhì)釋放的失衡和CD73表達(dá)與功能的異常，最終導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。因此，抑制CD73活性，改善嘌呤神經(jīng)能平衡可能是治療AD的策略之一。盡管APCP在AD中的研究罕有報道，但其在抗腫瘤的研究中作用確切，同時有較高的可行性和機(jī)體耐受性，具有較好的應(yīng)用前景。

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〔2016-11-07修回〕

(編輯 曲 莉/滕欣航)

國家自然科學(xué)基金(No.81603324)；吉林省教育廳“十三五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(吉教科合字2016第27號)

姜 爽(1982-)，男，博士，副教授，主要從事中藥對糖尿病分子通路機(jī)制的研究。

宋 伍(1984-)，男，博士，講師，主要從事中樞神經(jīng)藥理研究。

R749

A

1005-9202(2017)10-2368-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.009