陳 遠(yuǎn)

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第四醫(yī)院消化內(nèi)科，浙江 義烏 322000)

白術(shù)內(nèi)酯I抑制胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的機制

陳 遠(yuǎn)

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第四醫(yī)院消化內(nèi)科，浙江 義烏 322000)

目的 探討白術(shù)內(nèi)酯I對人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的抑制作用及其機制。方法 MTT實驗和集落形成實驗檢測白術(shù)內(nèi)酯I對MGC-803細(xì)胞增殖的抑制作用；Western印跡檢測白術(shù)內(nèi)酯I對人胃癌MGC-803細(xì)胞中Notch1、Hey1、Jagged1和Hes1蛋白表達(dá)的影響；實時定量PCR分析白術(shù)內(nèi)酯I對人胃癌MGC-803細(xì)胞中Notch1、Hey1、Jagged1和Hes1 mRNA水平表達(dá)的影響。結(jié)果 MTT實驗和集落形成實驗表明，白術(shù)內(nèi)酯I抑制人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖，并且呈時間、劑量依賴性(P<0.05)；Western印跡實驗表明白術(shù)內(nèi)酯I抑制Notch信號通路中Notch1、Hey1、Jagged1和Hes1蛋白表達(dá)水平；實時定量PCR結(jié)果顯示白術(shù)內(nèi)酯I抑制Notch1、Hey1、Jagged1和Hes1 mRNA表達(dá)水平(P<0.05)。結(jié)論 白術(shù)內(nèi)酯I通過抑制Notch信號通路從而抑制人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖，白術(shù)內(nèi)酯I可能用于治療胃癌的新型治療策略。

白術(shù)內(nèi)酯I；胃癌MGC-803細(xì)胞；Notch信號通路

盡管手術(shù)切除以及化學(xué)治療都在胃癌治療方面取得較好的效果，但胃癌患者的生存情況仍然很不理想。白術(shù)(Rhizoma Atractylodis Macrocephalae)是一種菊科植物，屬于中國傳統(tǒng)藥材，在治療消化失調(diào)、胃病以及厭食等方面有良好效果〔1〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)還具有其他活性，例如抗感染、抗腫瘤等〔2～5〕。本文用不同濃度的白術(shù)內(nèi)酯(AT)-Ⅰ處理人胃癌細(xì)胞系MGC-803，并檢測Notch1、Hey1、Jagged1和Hes1 mRNA和蛋白水平表達(dá)的變化，以探究AT-I對胃癌細(xì)胞的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 AT-I購自Must Bio-technology(中國)。AT-I固體粉末溶解在二甲基亞砜中制成儲備液(100 mmol/L)，避光-20℃儲存。人重組堿性成纖維生長因子(bFGF)和上皮生長因子(EGF)購自R&D公司。Hey1、Jagged1、Notch1、Hes1抗體購自CST公司。β-actin購自Santa Cruz公司。

1.2 細(xì)胞來源以及培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞系MGC-803購自中國Cell Resource Center of Life Sciences。用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，并且在此基礎(chǔ)上加入10%胚牛血清(FBS，Hyclone)和100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素(Invitrogen，美國)。細(xì)胞培養(yǎng)在5% CO2以及37℃環(huán)境中。

1.3 方法

1.3.1 噻唑藍(lán)(MTT)實驗檢測細(xì)胞活性 將人胃癌細(xì)胞系MGC-803培養(yǎng)在96孔板中，培養(yǎng)密度為0.5×105，接種24 h，并且設(shè)置4個副孔。然后分兩組處理，第一組用不同濃度AT-I(0、25、50、100 μmol/L)處理MGC-803細(xì)胞48 h;第二組用50 μmol/L AT-I處理MGC-803細(xì)胞24、48、72 h。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞，用20 μl 5 mg/ml MTT試劑處理MGC-803細(xì)胞，放在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。丟棄MTT溶液，每孔加200 μl DMSO溶液，放在搖床上搖蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測490 nm處吸光值。

1.3.2 集落形成實驗 將MGC-803細(xì)胞接種到24孔板中，每個孔接種200～300個細(xì)胞，用不同濃度AT-I(0、25、50、100 μmol/L)處理細(xì)胞，每個濃度設(shè)置4個副孔。7 d之后，無水乙醇固定15 min，然后0.1%結(jié)晶紫(W/V)染色10 min。之后PBS洗3次，每次5 min，然后在帶有拍攝功能的顯微鏡下拍攝。

1.3.3 Western印跡 將MGC-803細(xì)胞原有的培養(yǎng)基棄掉，用PBS洗2次。每個小皿加入100 μl裂解液，在冰上裂解30 min。根據(jù)BSA(0.5 mg/ml)標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測不同濃度AT-I(0、25、50、100 μmol/L)處理后的細(xì)胞濃度。制備上樣蛋白，即20 μl樣品+5 μl上樣緩沖液上樣于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠中，之后電轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂牛奶室溫在孵育盒中將PVDF膜封閉1 h，PBS洗3次，每次5 min。孵育抗-CD44、抗-Hey1、抗-Jagged1、抗-Notch1，放在4℃過夜。PBS洗3次，每次5 min。孵育相應(yīng)的二抗，PBS洗3次，每次10 min。在膜上均勻撒化學(xué)發(fā)光液，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中顯影。

1.3.4 總RNA提取和cDNA合成 不同濃度AT-I(0、25、50、100 μmol/L)處理細(xì)胞，用TrizolTM試劑盒(Invitrogen公司)提取總RNA。通過核酸蛋白分析儀測量吸光度值，計算A260/A280比值(每一個RNA樣品均A260/A280比值大于1.8)。cDNA合成用PrimeScriptTMRT 試劑盒以及gDNA Eraser(Takara)合成。

1.3.5 實時定量PCR分析 相關(guān)靶基因的計算通過相對循環(huán)閾值(CT)計算，以GAPDH為內(nèi)參。引物：Notch1：正義：5′-GTCAACGCCGTAGATGACCT-3′；反義：5′-TCTCCTCCCTGTTGTTC-TGC-3′。Hes1：正義：5′-AAGGCGGACATTCTGGAAAT-3′；反義：5′-GTCACCTCGTTCATGCACTC-3′。Hey1：正義：5′-TGGATCACCTGAAAATGCTG-3′；反義：5′-TTGTTGAGATGCGAAACCAG-3′。Jagged1：正義：5′-GATCCTGTCCATGCAGAACG-3′；反義：5′-GGATCTGATACTCAAAGTGG-3′。GAPDH：正義：5′-CAGGGCTGCTTTTAACTC-3′；反義：5′-GGAAGATGGTGATGGGAT-3′。所有的定量都統(tǒng)一到β-actin的mRNA水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism5.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 AT-I抑制人胃癌細(xì)胞系MGC-803增殖 與對照組(0 μmol/L組)相比〔(91.60±4.93)%〕，不同濃度AT-I組的細(xì)胞存活率都顯著降低〔(25、50、100 μmol/L組分別為(76.05±9.35)%、(55.26±5.51)%、(45.43±5.23)%，P<0.05〕，且這種抑制呈時間〔作用24、48、72 h存活率分別為(72.53±5.51)%、(55.26±5.51)%、(38.52±3.70)5〕、劑量依賴性。集落形成實驗表明，與對照組(0 μmol/L組)比較，不同濃度AT-I組的細(xì)胞密度都顯著降低(P<0.05)，且具有濃度依賴性。見圖1。

2.2 Western印跡檢測AT-I對MGC-803細(xì)胞Notch信號的影響 與對照組(0 μmol/L組)比較，MGC-803細(xì)胞中Notch1、Hey1、Jagged1和Hes1蛋白表達(dá)在AT-I 50、100 μmol/L兩個濃度時顯著降低(P<0.05)。見圖2。

圖1 AT-I作用后集落形成實驗結(jié)果

1)P<0.05，2)P<0.01，下圖同圖2 AT-I對MGC-803細(xì)胞Notch信號通路的影響

2.3 實時定量PCR分析AT-I對MGC-803細(xì)胞Notch信號的影響 在50、100 μmol/L兩個濃度時，Notch1、Hey1、Jagged1和Hes1 mRNA水平都顯著低于對照組(0 μmol/L組)(P<0.05)。見圖3。

圖3 實時定量PCR分析Notch1、Jagged1、Hey1和Hes1 mRNA水平

3 討 論

AT-I是桉烷型倍半萜內(nèi)酯，是白術(shù)中主要的天然復(fù)合物，吸引了越來越多的關(guān)注。有研究表明AT-I通過線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡〔6〕。此外，還有研究報道AT-I抗黑色素瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化，通過Ras途徑抑制細(xì)胞遷移，并且調(diào)節(jié)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號通路〔7〕。

Notch信號是進(jìn)化保守途徑，介導(dǎo)小范圍細(xì)胞與細(xì)胞之間相互作用，并且與一系列細(xì)胞過程有關(guān)，包括細(xì)胞命運的決定、細(xì)胞分化、增殖和死亡〔8，9〕。當(dāng)膜結(jié)合配基Jagged，結(jié)合到Notch受體，γ-分泌酶調(diào)節(jié)的切割隨后釋放細(xì)胞內(nèi)的Notch，然后Notch能夠轉(zhuǎn)錄到核內(nèi)，從而激活Notch轉(zhuǎn)錄的靶基因，例如Hes1/Hey1〔10〕。證據(jù)表明Notch在胃癌發(fā)生、發(fā)展、存活中發(fā)揮著重要的作用〔11〕。Notch信號在干細(xì)胞自我更新時發(fā)揮關(guān)鍵作用〔12〕。證據(jù)表明Notch信號具有維持多種腫瘤細(xì)胞中干細(xì)胞樣特征的作用，包括膠質(zhì)瘤、肝癌、胰腺癌和前列腺癌〔13〕。Notch1高水平的表達(dá)與腫瘤患者的不良生存率有關(guān)，在胃癌中，Notch信號主要涉及其中的發(fā)展過程〔14〕。

本研究表明AT-I調(diào)節(jié)Notch信號，包括Notch1、Hey1、Jagged1和Hes1活性。因此，AT-I介導(dǎo)的細(xì)胞增殖至少部分是通過Notch信號調(diào)節(jié)。

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〔2016-09-11修回〕

(編輯 袁左鳴)

陳 遠(yuǎn)(1988-)，女，碩士，住院醫(yī)師，主要從事胃癌研究。

R28

A

1005-9202(2017)10-2383-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.016