杜國華 王宏旭 劉子良

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所藥理室 新藥作用機制研究與藥效評價北京市重點實驗室，北京 100050)

姜黃素治療帕金森病的機制

杜國華 王宏旭 劉子良

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所藥理室 新藥作用機制研究與藥效評價北京市重點實驗室，北京 100050)

目的 研究姜黃素治療帕金森病(PD)的作用機制。方法 采用MPTP誘發(fā)小鼠亞急性PD模型，通過蛋白質組學研究鑒定出小鼠中腦差異蛋白，發(fā)現(xiàn)姜黃素的作用靶點，并采用Western印跡進行驗證。用脂多糖刺激C6神經(jīng)膠質瘤細胞研究蛋白的表達。結果 在MPTP誘發(fā)的小鼠PD模型中，蛋白質組學鑒定出星形膠質細胞激活標志物膠質纖維酸性蛋白(GFAP)高表達，姜黃素給藥可以下調GFAP的表達，Western印跡驗證GFAP的表達與蛋白質組學結果一致。在脂多糖刺激的C6神經(jīng)膠質瘤細胞中GFAP的表達明顯升高，姜黃素給藥后可以降低GFAP的表達。結論 星形膠質細胞介導的炎癥反應參與PD發(fā)病，姜黃素可通過抑制星形膠質細胞的激活產(chǎn)生抗感染作用，進而發(fā)揮其神經(jīng)保護作用。

帕金森??；膠質纖維酸性蛋白；姜黃素；神經(jīng)炎癥

帕金森病(PD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，主要病理改變?yōu)榛颊吆谫|致密體部位多巴胺能神經(jīng)元變性，導致紋狀體內多巴胺含量顯著降低，從而產(chǎn)生運動障礙。PD的發(fā)病原因很多，其中由小膠質細胞和星形膠質細胞激活引起神經(jīng)炎癥在PD發(fā)病過程中起重要作用〔1〕。膠質纖維酸性蛋白(GFAP)是星形膠質細胞特有的中間絲成分，除了維持細胞正常形態(tài)功能之外，還參與多種病理過程，如神經(jīng)退行性病、腦外傷、腦卒中、癲癇等。GFAP在星形膠質細胞激活后表達明顯升高，因此GFAP常被用作星形膠質細胞活性狀態(tài)的一種標志〔2〕。姜黃素具有抗氧化、抗感染、抗癌、清除自由基等多種藥理活性。近年研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對神經(jīng)退行性疾病有治療作用，可能與其抑制神經(jīng)炎癥有密切的關系〔3〕。但是姜黃素通過何種途徑抑制炎癥反應尚不十分明確。本文通過蛋白質學研究尋找姜黃素給藥后對MPTP誘發(fā)的PD模型小鼠腦內差異蛋白并進行驗證，從炎癥角度闡明姜黃素對PD的治療作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 姜黃素和所有進口試劑均購于美國Sigma和Promega公司；固相pH梯度干膠條(18 cm，linear，pH3～10)、IPG緩沖液(pH3～10)均購自Amersham Pharmacia Biotech公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。所有溶液均用Milli Q水配制。雄性C57小鼠，體重23～25 g，購于維通利華實驗動物技術有限公司。動物自由進食進水，適應1 w后進行實驗，實驗中所有操作均遵循北京市實驗動物倫理委員會的規(guī)定。C6神經(jīng)膠質瘤細胞購自協(xié)和細胞中心。Ettan IPGphor3等電聚焦儀、Ettan DALTsix垂直電泳槽、ImageScanner Ⅲ掃描儀(美國GE公司)；MALDI-TOF-TOF質譜儀(美國Applied Biosystems公司)；高內涵圖像分析系統(tǒng)(美國GE公司)；化學發(fā)光系統(tǒng)(美國GE公司)。

1.2 PD模型的建立和給藥 小鼠隨機分為對照組、PD模型組、姜黃素組，每組20只。MPTP(Sigma)溶于生理鹽水，30 mg/kg腹腔注射，1次/d，連續(xù)5 d。姜黃素100 mg/kg于MPTP注射前1 h灌胃給藥，在MPTP停止注射后繼續(xù)給藥7 d。對照組腹腔注射相同量的生理鹽水。

1.3 小鼠中腦蛋白樣品的制備和雙向凝膠電脈(2-DE)分離 小鼠斷頭取腦，冰上分離中腦，用非變性裂解液提取中腦總蛋白，考馬斯亮藍進行蛋白定量。按照操作指南將制得的蛋白樣品進行分離，然后考馬斯亮藍染色，脫色，采用LabScan6.01軟件控制的ImageScannerⅢ掃描儀掃描，得到對照組、PD組和姜黃素組的圖譜。

1.4 質譜鑒定 切取2-DE凝膠上的GFAP蛋白質點置于Eppendorf管進行膠內酶切，經(jīng)過脫色、還原、烷基化、酶解等步驟的處理獲得樣品，將制備好的樣品與基質α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-CHCA)混勻點樣，于ABI 4800 plus MALDI-TOF-TOF質譜儀進行蛋白質肽質量指紋譜的分析及鑒定。采用反射模式(800～4 000)、正離子譜測定，獲取一級質譜圖。質譜信號單次掃描累加50次，并用基質峰和胰蛋白酶自動降解離子峰作為內標校正質譜峰，以多肽質量標準(ABI公司)為外標進行校正。對一級質譜獲得的高豐度肽段進行二級質譜分析，用Mascot軟件進行肽段鑒定，選擇Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫進行搜索。

1.5 Western印跡檢測中腦GFAP蛋白的表達 小鼠中腦用非變性裂解液勻漿。勻漿液離心后煮沸5 min。10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后轉移到PVDF膜上。轉移上蛋白的PVDF膜在5%的TBST配制的脫脂奶粉4℃封閉過夜，室溫下與TBST稀釋的一抗孵育2 h，用TBST洗3遍。然后在TBST稀釋的辣根過氧化酶耦聯(lián)的二抗中孵育1.5 h，洗3遍后，在LAS4000化學發(fā)光系統(tǒng)檢測，Gel-Pro Analyzer 4.0分析條帶灰度。

1.6 細胞培養(yǎng)和給藥 C6神經(jīng)膠質瘤細胞以DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時加入終濃度為2.5%滅活的胎牛血清和15%的馬血清。在37℃，5%CO2/95%空氣，100%相對濕度下生長。細胞每隔2～3 d傳代一次，培養(yǎng)24～36 h后開始實驗。所用的消化液為0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA(溶于Dulbecco溶液中)。處于對數(shù)生長期的細胞，以3×103個/孔接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，24 h后加姜黃素10 μmol/L，1 h后加脂多糖(LPS)500 ng/ml，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行下面的細胞學實驗。

1.7 GFAP熒光標記檢測 C6神經(jīng)膠質瘤細胞經(jīng)LPS刺激和與姜黃素共孵育后，細胞以4%的多聚甲醛固定15 min，然后用0.1%Triton-PBS透化，3%羊血清封閉1 h，加GFAP一抗(1∶100)共孵育4℃過夜，加FITC標記的熒光二抗(1∶200)室溫孵育2 h，采用高內涵圖像分析系統(tǒng)Analyzer1000觀察藥物刺激后GFAP蛋白的表達，并采集圖像。

1.8 統(tǒng)計學方法 用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，兩組間比較行LSD-SNK檢驗。

2 結 果

2.1 小鼠中腦差異蛋白表達和蛋白鑒定 圖1所示為對照組、PD組、姜黃素組2-DE蛋白表達圖。采用ImageMaster6.01軟件對凝膠進行強度校正、點檢測、背景消減和匹配等分析，發(fā)現(xiàn)一些差異蛋白，切取差異蛋白點進行質譜鑒定，圖1中圈出的蛋白質點一級質譜分析獲得的肽質量指紋圖(PMF)如圖2。將PMF數(shù)據(jù)通過Mascot軟件查詢SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫。查詢條件為：肽片段分子質量最大容許誤差控制在±0.02 D，選擇胰酶，酶解片段不完全選擇為1個，物種來源選擇鼠，離子選擇〔M+H〕+，固定修飾選擇脲甲基半胱氨酸。初步確定該蛋白質為GFAP。對一級質譜獲得的高豐度肽段，如m/z1 296.711 4，m/z1 539.817 5和m/z1 475.780 6進行二級質譜分析，用Mascot軟件進行肽段鑒定，選擇Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫進行搜索，進一步確認該蛋白質為GFAP(分子量49 927.5 kD，蛋白代碼P03995，pI 5.27)。表1為應用串聯(lián)質譜數(shù)據(jù)和PMF聯(lián)合檢索的結果?；谝陨洗_認，圖1中蛋白質點為GFAP。軟件分析2-DE圖譜可知，動物水平GFAP蛋白表達的變化為：PD模型組高于對照組，姜黃素組低于PD模型組。以上結果表明炎癥參與MPTP誘發(fā)PD模型的機制中，表現(xiàn)為星形膠質細胞的激活，即GFAP蛋白表達升高。姜黃素可通過抑制星形膠質細胞活化而抑制炎癥反應，保護多巴胺能神經(jīng)元。

圖1 小鼠中腦蛋白的2-DE圖譜

圖2 GFAP的質譜鑒定

組別肽段數(shù)得分置信度(CI%)總離子得分總離子得分CI%序列覆蓋率(%)對照組580999846910012PD模型組56699565559997312姜黃素組78199988639999617

2.2 Western印跡驗證GFAP蛋白的表達 PD模型組小鼠中腦GFAP表達(0.67±0.07)與對照組相比明顯升高(0.28±0.04，P<0.01)，給予小鼠姜黃素可顯著降低GFAP的表達(0.36±0.03,P<0.01)，見圖3，與蛋白質組學結果一致。

2.3 免疫熒光技術檢測C6神經(jīng)膠質瘤細胞GFAP蛋白表達的變化 LPS刺激后GFAP表達與對照組相比明顯增加，給予姜黃素后可明顯降低GFAP的表達，表明該藥可抑制C6神經(jīng)膠質瘤細胞的激活而抑制炎癥反應，見圖4。

圖3 Western印跡驗證各組GFAP的表達

圖4 C6神經(jīng)膠質瘤細胞GFAP的高內涵觀察圖像(FITC，×200)

3 討 論

膠質細胞激活引起的炎癥在PD的發(fā)病中起著重要作用〔4〕。PD患者和動物模型中腦黑質部位存在不同程度的星形膠質細胞的激活〔5，6〕，激活的星形膠質細胞可誘導CD23的表達，后者進一步激活誘導型一氧化氮合酶(iNOS)產(chǎn)生NO，引起炎癥反應，從而損傷多巴胺能神經(jīng)元〔7〕，造成多巴胺能神經(jīng)元大量丟失。目前已上市治療PD的藥物，如L-多巴只能是改善癥狀，不能阻止疾病的進程。而姜黃素是從姜科植物中提取的一種多酚類物質，具有抗氧化〔8〕、抗感染〔8〕、抗癌、清除自由基等多種藥理活性。研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可通過多種機制發(fā)揮神經(jīng)保護〔9，10〕，其中抗感染作用有與抑制核轉錄因子κB的活性密切相關〔11〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)姜黃素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如腦缺血、神經(jīng)退行性疾病〔3〕中都有保護作用，可能與其抑制神經(jīng)炎癥有關。研究發(fā)現(xiàn)MPTP誘發(fā)的PD模型中腦內有炎癥反應的參與〔12〕。姜黃素可抑制炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-α的產(chǎn)生，抑制星形膠質細胞的激活，從而減輕多巴胺能神經(jīng)元的損傷〔13〕。但是姜黃素抑制膠質細胞介導炎癥的靶點尚不明確，本研究表明姜黃素可抑制星形膠質細胞的激活，這與GFAP在腦損傷和PD疾病中表達上調等文獻報道一致〔13，14〕。姜黃素能夠抑制GFAP的表達，表明姜黃素具有明顯抑制炎癥的作用。

綜上所述，GFAP是星形膠質細胞的活化標志物，它的高表達與炎癥反應密切相關。姜黃素可抑制GFAP的表達而抑制炎癥反應，因此姜黃素是一種有效的神經(jīng)保護劑，有希望用于治療神經(jīng)退行性疾病。然而，神經(jīng)退行性疾病往往涉及多種復雜機制，因此，姜黃素是否還通過其他生物分子或信號網(wǎng)絡而對神經(jīng)退行性疾病有效，仍需要更多體內外實驗深入研究。

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〔2015-12-11修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

杜國華(1967-)，女，副研究員，博士，主要從事蛋白質和生物信息學研究。

R742.5

A

1005-9202(2017)10-2387-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.017