李 歡 焦峰軍 白 鋒

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科，甘肅 蘭州 730030)

Toll樣受體2對(duì)人主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用

李 歡 焦峰軍1白 鋒

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科，甘肅 蘭州 730030)

目的 探討Toll樣受體(TLR2)調(diào)控Notch1信號(hào)通路對(duì)人主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用。方法 從正常主動(dòng)脈瓣組織及主動(dòng)脈瓣狹窄病人的主動(dòng)脈瓣組織中分離出主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測(cè)200 ng/ml的TLR2激活物脂多糖(LPS)干預(yù)細(xì)胞24 h后白細(xì)胞介素(IL)-6、巨細(xì)胞趨化因子(MCP)-1和細(xì)胞間黏附因子(ICAM)-1濃度；Western印跡檢測(cè)200 ng/ml的LPS干預(yù)細(xì)胞2、4、8、12 h后NICD1蛋白表達(dá)，ELISA檢測(cè)Jagged1濃度；60 nmol/L的人Notch1特異性siRNA沉默Notch1及200 ng/ml的LPS刺激細(xì)胞24 h后，Western印跡檢測(cè)NICD1及 ICAM-1蛋白表達(dá)；5 μg/ml的Jagged1及200 ng/ml的LPS處理細(xì)胞，ELISA檢測(cè)IL-6、MCP-1和 ICAM-1濃度。結(jié)果 正常主動(dòng)脈瓣組織及主動(dòng)脈狹窄病人瓣膜組織的主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后IL-6、MCP-1和VCAM-1的濃度均顯著高于無(wú)LPS刺激組，主動(dòng)脈狹窄病人瓣膜組織的主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞中IL-6、MCP-1和VCAM-1的濃度均顯著高于正常組(P<0.01)；LPS刺激能誘導(dǎo)NICD1的生成及增加，具有時(shí)間依賴(lài)性，且主動(dòng)脈狹窄病人瓣膜組織的主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中NICD1生成量多于正常組；主動(dòng)脈狹窄病人瓣膜組織的主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中Jagged1濃度顯著高于正常組，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)增加；沉默Notch1信號(hào)通路能減弱NICD1的蛋白表達(dá)，且能減少炎癥因子ICAM-1的蛋白表達(dá)；Jagged1激活Notch信號(hào)通路能誘導(dǎo)產(chǎn)生低水平的IL-6、MCP-1、ICAM-1，而能明顯增強(qiáng)TLR2誘導(dǎo)的IL-6、MCP-1、ICAM-1的水平。結(jié)論 TLR2能誘導(dǎo)人主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及活化Notch1信號(hào)通路，主動(dòng)脈瓣狹窄的主動(dòng)脈瓣組織間質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)更明顯，沉默Notch1信號(hào)通路可減弱TLR2誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，激活Notch信號(hào)通路則增強(qiáng)TLR2誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

Toll樣受體(TLR)2；Notch信號(hào)通路；主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞；炎癥反應(yīng)

鈣化性主動(dòng)脈瓣疾病(CAVD)是老年人群常見(jiàn)的一種心臟瓣膜疾病〔1〕，臨床上藥物治療效果不佳，目前手術(shù)治療是唯一的治療手段，但手術(shù)治療風(fēng)險(xiǎn)大且費(fèi)用高〔2,3〕。流行病學(xué)及組織病理學(xué)研究顯示，CAVD的發(fā)病是一個(gè)由多因素參與的復(fù)雜病變，包括糖尿病、脂質(zhì)代謝異常、骨化反應(yīng)及鈣化、炎癥等〔4,5〕。但有研究者認(rèn)為CAVD是一種慢性炎癥疾病，且有大量研究證實(shí)CAVD與炎癥有密切的關(guān)系〔6〕。研究指出，腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β等炎癥因子能促進(jìn)CAVD的發(fā)生發(fā)展，也有研究提出口腔細(xì)菌感染可引起CAVD〔7〕。Toll樣受體(TLRs)是模式識(shí)別受體因子(PRRs)家族中高度保守的跨膜受體，能夠識(shí)別各種病原體，TLRs被激活后可參與炎癥反應(yīng)〔8〕。TLR2是重要的TLRs之一，在人CAVD中有功能TLR2的表達(dá)，TLR2受到刺激后可誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)〔1〕。Notch信號(hào)通路在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生、炎癥等生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其中Notch1的表達(dá)最廣泛〔9〕。近些年的研究顯示細(xì)菌產(chǎn)物可激活Notch1受體，從而對(duì)細(xì)胞功能進(jìn)行調(diào)節(jié)〔10〕。本研究旨在證實(shí)TLR2是否可調(diào)控Notch1信號(hào)通路對(duì)人主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料 正常主動(dòng)脈瓣組織由2015年9～12月蘭州大學(xué)第二醫(yī)院進(jìn)行心臟移植術(shù)患者移植出來(lái)的心臟中獲得，其中男6例，女4例，平均年齡(61±6.7)歲。主動(dòng)脈瓣狹窄的主動(dòng)脈瓣組織由同時(shí)期在蘭州大學(xué)第二醫(yī)院進(jìn)行主動(dòng)脈瓣膜置換術(shù)患者被置換出的主動(dòng)脈瓣膜中獲得，其中男5例，女3例，平均年齡(64±12.3)歲。所有組織的取得均得到捐獻(xiàn)者同意，并簽訂知情同意書(shū)。

M99細(xì)胞培養(yǎng)基、胰酶及胰酶終止液均購(gòu)自美國(guó)Lonza公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；兔抗人細(xì)胞間黏附因子(ICAM)-1抗體、Notch1 siRNA、scrambled siRNA 均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、Notch1胞內(nèi)段(NICD1)抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；脂多糖(LPS)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；Jagged1酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購(gòu)自中國(guó)USCN公司；IL-6、巨細(xì)胞趨化因子(MCP)-1、ICAM-1 ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱HERAcell型購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；垂直電泳槽DYCZ-24EN購(gòu)自北京六一儀器；倒置熒光顯微鏡CK2-TRC-3型購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 人主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng) 去除主動(dòng)脈瓣組織周?chē)募∪饨M織，無(wú)菌條件下獲取主動(dòng)脈瓣膜，移至超凈臺(tái)上剝離內(nèi)皮層。間質(zhì)層切成0.5～1 mm3的小塊，置于M199培養(yǎng)基(含有1 g/L BSA和2 g/L Ⅳ型膠原酶)中，37℃消化2 h后，200 r/min離心30 s，去掉不能消化的組織，再加入5倍體積的M199培養(yǎng)基，1 500 r/min離心10 min，2次洗滌并離心后，棄掉上清，重懸細(xì)胞。細(xì)胞鋪于細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入含有胎牛血清的培養(yǎng)液，置于37℃、50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀(guān)察到細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代。所有試驗(yàn)細(xì)胞均為第4～6代。

1.2.2 細(xì)胞干預(yù)處理 將消化傳代的人主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞覆蓋度達(dá)到80%～90%時(shí)換成不含胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液中加入干預(yù)藥物，干預(yù)到達(dá)預(yù)定時(shí)間后收取培養(yǎng)液，并終止反應(yīng)。收取培養(yǎng)液和細(xì)胞裂解液。IL-6、MCP-1和ICAM-1 3個(gè)炎癥反應(yīng)因子測(cè)定試驗(yàn)使用200 ng/ml的LPS干預(yù)24 h；Notch1活化及配體Jagged1的測(cè)定使用200 ng/ml的LPS干預(yù)2、4、8、12 h；沉默Notch1信號(hào)通路試驗(yàn)先用siRNA處理細(xì)胞48 h，再進(jìn)行其他干預(yù)試驗(yàn)。Notch1配體Jagged1干預(yù)試驗(yàn)先用5 μg/ml的Jagged1溶液覆蓋在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后種植上人主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞，觀(guān)察到細(xì)胞貼壁后用200 ng/ml的LPS處理細(xì)胞24 h，收集樣品備用。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)IL-6、MCP-1、ICAM-1及Jagged1濃度 按照ELASA試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行試驗(yàn)。具體步驟：將包被的抗體按說(shuō)明書(shū)稀釋后，每個(gè)反應(yīng)孔中加入0.1 ml，常溫過(guò)夜培養(yǎng)。第2天棄去反應(yīng)孔中溶液，緩沖液洗滌3次，3 min/次。加入100 μl封閉液封閉2 h，倒出封閉液，緩沖液洗滌3次，3 min/次。將100 μl上清樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加到反應(yīng)孔中，室溫孵育2 h，緩沖液洗滌3次，3 min/次。加入100 μl已稀釋液的檢測(cè)抗體于各個(gè)反應(yīng)孔中，室溫孵育2 h，緩沖液洗滌3次，3 min/次。每個(gè)反應(yīng)孔中加入100 μl酶標(biāo)抗體，室溫孵育30 min后，緩沖液洗滌3次，3 min/次。加入100 μl新鮮配置的底物稀釋液，室溫避光孵育30 min，加入50 μl 2N硫酸終止反應(yīng)。光密度儀(Bio-Rad)在450 nm波長(zhǎng)讀取光密度值。Jagged1濃度測(cè)定根據(jù)Jagged1試劑盒說(shuō)明進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。

1.2.4 Western印跡檢測(cè)GAPDH、ICAM-1、NICD1蛋白表達(dá) 細(xì)胞干預(yù)達(dá)到預(yù)定時(shí)間后，收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞，適量的裂解液冰上裂解30 min，收集細(xì)胞，4℃ 14 000 r/min離心15 min，收集上清。BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，充分混勻蛋白樣品與上樣緩沖液，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，4℃轉(zhuǎn)膜過(guò)夜。取出聚偏氟乙烯(PVDF)膜用5%脫脂奶粉封閉后，分別以GAPDH、ICAM-1、NICD1作為一抗(1 000倍稀釋)，4℃孵育過(guò)夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)清洗后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(2 000倍稀釋)，37℃孵育1 h，TBST洗膜。用ImageJ軟件對(duì)掃描結(jié)果進(jìn)行定量分析。

1.2.5 沉默及激活Notch1信號(hào)通路對(duì)人主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響 將種植在培養(yǎng)板中生長(zhǎng)的人主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)液換成無(wú)抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%以上時(shí)，將培養(yǎng)液吸出，換成分別含有60 nmol/L人Notch1的特異性siRNA和5 μg/ml的Jagged1，然后分別加入60 μl/ml轉(zhuǎn)染劑和無(wú)血清無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中，對(duì)照組加入相同濃度的Scrambled siRNA及培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染6 h后，將細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，200 ng/ml的LPS刺激24 h，收集樣品備用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)的組間比較進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 TLR2介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)對(duì)主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中IL-6、MCP-1和VCAM-1的影響 正常組及主動(dòng)脈瓣狹窄組經(jīng)LPS刺激24 h后IL-6、MCP-1和VCAM-1的濃度均顯著高于無(wú)LPS刺激組，主動(dòng)脈瓣狹窄組IL-6、MCP-1和VCAM-1的濃度均顯著高于正常組(P<0.01)。說(shuō)明主動(dòng)脈瓣狹窄病人瓣膜組織的主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞比正常組織細(xì)胞有更強(qiáng)的炎癥反應(yīng)。見(jiàn)表1。

表1 TLR2介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)對(duì)主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中IL-6、MCP-1和VCAM-1的影響

與無(wú)LPS刺激比較：1)P<0.01；與正常組LPS刺激24 h比較：2)P<0.01

2.2 刺激TLR2對(duì)主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞Notch1信號(hào)通路的影響 200 ng/ml的LPS刺激兩種細(xì)胞0、2、4、8、12 h，能誘導(dǎo)NICD1的生成及增加，具有時(shí)間依賴(lài)性，且主動(dòng)脈瓣狹窄病人瓣膜組織的間質(zhì)細(xì)胞中NICD1生成量多于正常組織細(xì)胞。主動(dòng)脈瓣狹窄病人瓣膜組織的間質(zhì)細(xì)胞中Jagged1濃度顯著高于正常組織細(xì)胞，并隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加。見(jiàn)圖1，表2，表3。

圖1 NICD1蛋白在正常組和主動(dòng)脈瓣狹窄組瓣膜組織間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)

組別nLPS0hLPS2hLPS4hLPS8hLPS12h正常組100020±00010060±00050114±00071478±00263112±0369主動(dòng)脈瓣狹窄組80003±00010154±00071)1326±00231)2524±03321)4678±04111)

與LPS 0 h比較：1)P<0.01，下表同

表3 刺激TLR2對(duì)主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞Jagged1濃度的影響

2.3 沉默Notch1信號(hào)通路對(duì)刺激TLR2產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)的影響 沉默Notch1信號(hào)通路能減弱NICD1的蛋白表達(dá)，且能減少炎癥因子ICAM-1的蛋白表達(dá)。見(jiàn)圖2。

2.4 激活Notch1信號(hào)通路對(duì)刺激TLR2產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)的影響 Jagged1能誘導(dǎo)產(chǎn)生低水平的IL-6、MCP-1、ICAM-1，并能明顯增強(qiáng)TLR2誘導(dǎo)的IL-6、MCP-1、ICAM-1的水平。見(jiàn)表4。

圖2 沉默Notch1信號(hào)通路對(duì)刺激TLR2產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)的影響

組別IL?6MCP?1ICAM?1對(duì)照組1623±3782568±543942±287LPS15426±12351)8116±11491)4561±10241)Jagged13278±4321)4138±12261)1423±1971)LPS+Jagged122367±22711)2)12435±20181)2)6988±7451)2)

與對(duì)照組比較：1)P<0.01；與LPS和Jagged1組比較：2)P<0.01

3 討 論

CAVD發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前已發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、炎癥等參與該病的發(fā)生發(fā)展。這些因素均可以對(duì)主動(dòng)脈瓣膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞，導(dǎo)致鈣鹽沉積，并使瓣膜鈣化〔11〕。已有研究證實(shí)炎癥對(duì)CAVD的發(fā)生發(fā)展起到重要作用〔12〕。有研究顯示CAVD中表達(dá)有功能的TLR2受體，用TLR2激活物L(fēng)PS刺激TLR2受體可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)〔13〕。LPS是一種經(jīng)典的促炎物質(zhì)，能夠誘導(dǎo)正常瓣膜細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化〔14〕。本研究中為了證實(shí)用LPS刺激TRL4受體后，正常主動(dòng)脈瓣組織及主動(dòng)脈瓣狹窄的主動(dòng)脈組織中主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞對(duì)炎癥刺激的反應(yīng)有何不同，結(jié)果顯示，主動(dòng)脈瓣狹窄的主動(dòng)脈組織中主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞IL-6、MCP-1和ICAM-1的濃度均顯著高于正常組。IL-6、MCP-1、ICAM-1能夠促進(jìn)白細(xì)胞浸潤(rùn)，ICAM-1不僅能參與促進(jìn)白細(xì)胞浸潤(rùn)，還能作為受體，與淋巴細(xì)胞功能相關(guān)分子(LFA)-1結(jié)合參與細(xì)胞信號(hào)通路傳導(dǎo)，使胞外信號(hào)到胞內(nèi)，使機(jī)體產(chǎn)生持續(xù)的炎癥反應(yīng)〔15〕。這說(shuō)明主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)參與了CAVD的發(fā)生，主動(dòng)脈瓣狹窄的主動(dòng)脈組織中主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞對(duì)炎癥刺激更明顯表明主動(dòng)脈瓣狹窄的主動(dòng)脈瓣組織中主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞本身有一定的促炎作用。

Notch信號(hào)通路是一個(gè)高度保守的信號(hào)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化和成熟有重要作用，其受體是單跨膜蛋白，配體包括Jagged-1、Jagged-2、Deltalike-1、Deltalike-2、Deltalike-3、Deltalike-4。Notch1受體與Jagged-1配體結(jié)合后，Notch1蛋白被γ-分泌酶切割，釋放出胞內(nèi)的活性片段NICD，NICD進(jìn)入細(xì)胞核后可與Maml家族的激活因子及DNA結(jié)合蛋白(CSL)結(jié)合從而形成起始轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，啟動(dòng)Hes、Hey基因家族靶基因的轉(zhuǎn)錄，作為下游基因Math-1等的阻遏子發(fā)揮作用〔16～18〕。TLR2及Notch1是與炎癥刺激有密切相關(guān)的兩條通路〔19〕，刺激TLR2對(duì)主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞Notch1信號(hào)通路的產(chǎn)生是否有影響呢？本文結(jié)果顯示，LPS刺激能誘導(dǎo)NICD1的生成及增加，具有時(shí)間依賴(lài)性，且主動(dòng)脈瓣狹窄病人瓣膜組織的主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中NICD1生成量多于正常組織細(xì)胞，主動(dòng)脈瓣狹窄病人瓣膜組織的主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中Jagged1濃度顯著高于正常組織細(xì)胞，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)增加。這說(shuō)明TRL4受體能引起Notch1信號(hào)通路的活化。

研究顯示，TLRs可激活Notch1等轉(zhuǎn)錄因子，引起IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥有關(guān)因子及趨化因子的分泌，也有研究證實(shí)LPS刺激TLRs后能引起Notch1的核轉(zhuǎn)位及使免疫細(xì)胞激活而發(fā)生轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致促炎因子釋放，從而導(dǎo)致細(xì)胞的增殖和凋亡〔20～22〕。沉默及激活主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞Notch1信號(hào)通路對(duì)刺激TLRs產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)還未可知。本研究通過(guò)沉默和激活Notch1信號(hào)通路，檢測(cè)Notch1信號(hào)通路對(duì)刺激TLR2產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)的影響，結(jié)果顯示，沉默Notch1信號(hào)通路能減弱NICD1的蛋白表達(dá)，且能減少炎癥因子ICAM-1的蛋白表達(dá)，而激活Notch1信號(hào)通路能增強(qiáng)IL-6、MCP-1、ICAM-1的水平。這說(shuō)明TLR2誘導(dǎo)產(chǎn)生的主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)與Notch1的調(diào)控有關(guān)。

綜上，TLR2能誘導(dǎo)人主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及活化Notch信號(hào)通路，主動(dòng)脈瓣狹窄的主動(dòng)脈瓣組織的主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)更為明顯，沉默Notch信號(hào)通路減弱TLR2誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，激活Notch信號(hào)通路則增強(qiáng)TLR2誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

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〔2016-11-09修回〕

(編輯 袁左鳴)

白 鋒(1963-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事心血管內(nèi)科臨床研究。

李 歡(1983-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事心血管內(nèi)科臨床研究。

R541.1

A

1005-9202(2017)10-2392-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.019

1 咸陽(yáng)市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科