蒙君麗 宋蓀陽(yáng) 董曉杰

(1.唐山市畜牧水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心,河北唐山 063000; 2.唐山市船檢處,河北唐山 063000)

水產(chǎn)品中隱性孔雀石綠的測(cè)定

蒙君麗1宋蓀陽(yáng)1董曉杰2

(1.唐山市畜牧水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心,河北唐山 063000; 2.唐山市船檢處,河北唐山 063000)

運(yùn)用酶聯(lián)免疫法（ELISA）對(duì)水產(chǎn)品中隱性孔雀石綠測(cè)定的方法進(jìn)行研究。結(jié)果表明，向樣品中分別添加0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 μg/kg 6個(gè)不同質(zhì)量濃度的隱性孔雀石綠時(shí)，平均回收率為78.2%～110%，檢出限0.5 μg/kg，定量限1.5 μg/ kg。同時(shí)采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）驗(yàn)證，結(jié)果與ELISA結(jié)果一致。該方法準(zhǔn)確度較好，適合水產(chǎn)品中隱性孔雀石綠的快速檢測(cè)。

酶聯(lián)免疫吸附法 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法 水產(chǎn)品 隱性孔雀石綠 快速檢測(cè)

孔雀石綠（malachite Green，MG）是一種合成的三苯基甲烷類染料，進(jìn)入機(jī)體后，通過(guò)生物轉(zhuǎn)化，還原成脂溶性隱性孔雀石綠（leucomalachite green，LMG），在組織中殘留時(shí)間較長(zhǎng)[1]，具有潛在的致癌性[2-3]，所以實(shí)驗(yàn)室常用隱性孔雀石綠作為標(biāo)記檢測(cè)物。鑒于隱性孔雀石綠的危害性，目前許多國(guó)家都將其列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物。加拿大于1992年就禁止將其作為漁場(chǎng)殺菌劑。1993年美國(guó)FDA已經(jīng)將隱性孔雀石綠列為優(yōu)先研究的致癌性化學(xué)物質(zhì)，并規(guī)定在食用水產(chǎn)品中禁止檢出孔雀石綠和隱性孔雀石綠[4]。歐盟于2002年6月頒布法令禁止在漁場(chǎng)中使用孔雀石綠[5]。中國(guó)于2002年將孔雀石綠列入《食品動(dòng)物禁用的漁藥及其化合物清單》中，禁止用于所有食用動(dòng)物的養(yǎng)殖中。本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)隱性孔雀石綠作為對(duì)象進(jìn)行研究。

目前隱性孔雀石綠的主要檢驗(yàn)方法有分光光度法、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[6-9]、高效液相色譜法（LC）[10-12]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[13-16]等。酶聯(lián)免疫吸附法是一種半定量的方法，其檢測(cè)結(jié)果不能作為最終的確證，因此該方法還具有一定的局限性，需要采用液相色譜和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法進(jìn)行確證。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高，定量準(zhǔn)確，但由于其成本高，檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)操作儀器設(shè)備人員要求較高，因此并不適用所有實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。采用ELISA快速篩選與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的確證方法相結(jié)合，既節(jié)約了成本，縮短了檢測(cè)時(shí)間，又提高了檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。適合實(shí)驗(yàn)室樣品的大批量檢測(cè)，同時(shí)又可以進(jìn)行確證檢測(cè)，更適合實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際操作。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑及主要設(shè)備

水產(chǎn)品取魚(yú)肌肉部分，混合，勻漿，備用。

乙腈（色譜純），購(gòu)自天津市福晨化學(xué)試劑廠；中性氧化鋁（分析純，100～200目），購(gòu)自天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；乙酸銨（分析純），購(gòu)自天津市津科精細(xì)化工研究所。

酶標(biāo)儀MK3由Thermo公司制造；液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀4000Q TRAP由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制造；色譜柱Shim-pack XR-ODSⅢ由日本島津公司生產(chǎn)；酶聯(lián)免疫試劑盒由美國(guó)Beacon公司生產(chǎn)；氮?dú)獯蹈蓛x由天津艾維歐科技發(fā)展有限公司制造；微量移液器由Thermo公司制造；中性氧化鋁柱（500 mg/3 ml）由美國(guó)Waters公司生產(chǎn)。

1.2 ELISA方法

取約5.00 g已均質(zhì)樣品于50ml離心管中，加入10ml乙腈，充分振蕩，于4 000r/min離心 5min。加入3 g中性氧化鋁，4 000r/min離心5min，移取上清液于10 ml玻璃管中，45℃氮?dú)獯蹈?，加?.5ml稀釋好的試劑a（試劑盒自帶），混合，靜置30min，稱取0.1g試劑b（試劑盒自帶）加入到玻璃管中，混合，靜置10 min，取50 μl上清液，加入0.95 ml樣品稀釋液并混勻，供ELISA測(cè)定。

1.3 LC-MS/MS方法

1.3.1 LC-MS/MS樣品前處理

參照文獻(xiàn)[18]方法進(jìn)行提取和凈化進(jìn)行。

1.3.2 LC-MS/MS測(cè)定條件

液相色譜條件：C18色譜柱為50 mm×2 mm，1.6 μm；柱溫為40℃；進(jìn)樣量為2 μl；流速為0.25 ml/min；流動(dòng)相A為1 mmol/L乙酸銨；流動(dòng)相B為乙腈。

質(zhì)譜條件：詳見(jiàn)表1和表2。

表1 質(zhì)譜條件

表2 特征離子對(duì)

1.4 計(jì)算

1.4.1 ELISA結(jié)果計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣品的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出樣品所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣品中隱性孔雀石綠及其代謝物的實(shí)際濃度。

1.4.2 LC-MS/MS計(jì)算方法

其中：c為由曲線計(jì)算得到的樣品中隱性孔雀石綠含量，ng/ ml；v為定容體積，ml；m為樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 ELISA試劑盒質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.1.1 準(zhǔn)確度、精密度

采用基質(zhì)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，依據(jù)濃度和吸光度的線性關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)添加樣的檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算得出試劑盒的準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果如表3所示。

表3 ELlSA試劑盒準(zhǔn)確度和精密度

2.1.2 檢出限

對(duì)添加不同濃度孔雀石綠的樣品進(jìn)行檢測(cè)，在濃度小于0.5 μg/kg時(shí)，均為未檢出。添加濃度在0.5 μg/kg以上時(shí)，都可以檢出。因此本試劑盒的檢出限定為0.5 μg/kg。

2.2 ELISA結(jié)果與LC-MS/MS結(jié)果比較

經(jīng)液質(zhì)檢測(cè)無(wú)隱性孔雀石綠的40個(gè)樣品中，添加0.5、1.0、1.5和 2.0 μg/kg 4個(gè)不同濃度的隱性孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度做10個(gè)添加樣。結(jié)果表明，ELISA對(duì)40個(gè)不同濃度添加樣的檢測(cè)中，檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，并且添加回收率在70%～120%之間。

同時(shí)，對(duì)這40個(gè)樣品采用LC-MS/MS進(jìn)行確證，隱性孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜保留時(shí)間、特征離子豐度比的比較，得出添加質(zhì)量濃度在0.5、1.0、1.5和2.0 μg/kg時(shí)，樣品中隱性孔雀石綠的保留時(shí)間、定性離子與定量離子的峰面積比均與標(biāo)準(zhǔn)品一致。說(shuō)明采用ELISA測(cè)得的這40批水產(chǎn)品樣品中均含有隱性孔雀石綠，ELISA結(jié)果與LC-MS/MS結(jié)果相符，能夠較準(zhǔn)確地檢測(cè)含有隱性孔雀石綠的陽(yáng)性水產(chǎn)樣品。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用ELISA對(duì)水產(chǎn)品中隱性孔雀石綠的檢測(cè)方法進(jìn)行研究。濃度在0.5～4.0μg/kg的添加樣，回收率為78.2%～110%。通過(guò)對(duì)陰性對(duì)照組的檢測(cè)，結(jié)果全部為陰性，證明ELISA無(wú)假陽(yáng)性。測(cè)定ELISA檢測(cè)限為0.5μg/kg，定量限為1.5μg/kg。通過(guò)對(duì)陽(yáng)性對(duì)照組的檢測(cè)，采用與陰性對(duì)照組的同一批樣品中添加0.5、1.0、1.5和2.0 μg/kg 4個(gè)不同濃度的隱性孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品，LCMS/MS對(duì)該結(jié)果進(jìn)行確證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ELISA結(jié)果與LC-MS/ MS結(jié)果較為一致，證明ELISA法的準(zhǔn)確性。ELISA檢測(cè)水產(chǎn)品中隱性孔雀石綠，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)間短，成本低，適合實(shí)驗(yàn)室水產(chǎn)樣品的大批量檢測(cè)。

[1] 邱緒建，林洪，王聯(lián)珠，等.孔雀石綠及其代謝物無(wú)色孔雀石綠在鯽魚(yú)肌肉中的代謝規(guī)律[J].中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，36（5）：745-748.

[2] 翟毓秀，郭瑩瑩，耿霞，等.孔雀石綠的代謝機(jī)理及生物毒性研究進(jìn)展[J].中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，37（1）：27-32.

[3] 龐楠楠，白玉，劉虎威.孔雀石綠與水產(chǎn)安全[J].大學(xué)化學(xué)，2009，24（1）：59-61.

[4] Alderman， D. J.Malachite green：A review[J].J Fish Dis，1985，（8）：289-298.

[5] Commission of the European Communities. Commission Decision 2002/675/EC：Implementin Council Directive 96/23 /EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results[S].European Commission：Belgium，2002.

[6] 邢瑋瑋，王榕妹，王俊卿，等.酶聯(lián)免疫吸附分析法測(cè)定水產(chǎn)品及水中孔雀石綠和無(wú)色孔雀石綠[J].化學(xué)研究與應(yīng)用，2010，22（1）：42-46.

[7] 陳力.無(wú)色孔雀石綠殘留快速檢測(cè)技術(shù)的建立及應(yīng)用[D].上海海洋大學(xué)，2012.

[8] 黃向榮，鐘松清，萬(wàn)譯，等.快速檢測(cè)魚(yú)樣中隱性孔雀石綠的酶聯(lián)免疫法研究[J].當(dāng)代水產(chǎn)，2014，（9）：81-83.

[9] 王敏.無(wú)色孔雀石綠單克隆抗體的制備及ELISA檢測(cè)方法的建立[D].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[10] 李會(huì)榮，李桂華，宮玲玲，等.高效液相色譜法快速測(cè)定飼料中孔雀石綠和無(wú)色孔雀石綠的研究[J].中國(guó)飼料，2010，（13）：35-37.

[11] 周兵，陳璐，李英華.幾種水產(chǎn)品中無(wú)色孔雀石綠殘留量的測(cè)定[J].廣州化工，2011，39（21）：115-118.

[12] 黃金田，呂富，鄭浩，等.孔雀石綠及其代謝物隱性孔雀石綠在中華絨螯蟹體中的消除規(guī)律[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，5（2）：326-328．

[13] 朱寬正，王鵬，林雁飛.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫以及它們的隱色代謝物殘留[J].色譜，2007，25（1）：66-69.

[14] 朱漢強(qiáng).食品中孔雀石綠和隱性孔雀石綠的LC/MS/MS定量分析[J].中國(guó)化工貿(mào)易，2012，2（2）：116-118.

[15] 戶江濤，楊宇，張海珍，等.超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)水體中孔雀石綠及其代謝物隱性孔雀石綠的含量[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2014，2（3）：7-9.

[16] 徐彥輝，顧亮，蔣俊，等.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定養(yǎng)殖水體中孔雀石綠及其代謝物[J].化學(xué)分析計(jì)量，2011，4（2）：49-51.

蒙君麗（1973-），女，水產(chǎn)高級(jí)工程師，研究方向：為水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)。