朱穎潔+郭磊+劉易+龔瑩+邱澤武+吳劍峰+謝劍煒

摘 要 建立了一種快速、簡便的基于殼層隔絕納米粒子和在線裂解捕集技術(shù)的血液氰化物表面增強拉曼光譜（SERS）檢測方法。構(gòu)建了新型在線裂解吹掃捕集裝置，通過濃H2SO4酸化，將全血中結(jié)合態(tài)氰化物裂解，并轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性的HCN氣體，經(jīng)N2吹掃至堿液中形成NaCN，實現(xiàn)了中毒血液中氰化物的高效裂解與捕集； 在強堿性條件下，以殼層隔絕金納米粒子為基底，極大地削弱了氰化物的溶金效應(yīng)，使得檢測信號穩(wěn)定，存在時間由普通金納米粒子的5 min提高至1 h； 方法檢出限達10 μg/L，線性范圍為100～2000 μg/L。將此方法應(yīng)用于氰化物染毒大鼠及真實氰化物中毒患者全血的快速檢測，為氰化物中毒快速檢測提供了一種靈敏、特異、可靠的新方法。

關(guān)鍵詞 殼層隔絕納米粒子； 氰化物； 中毒血液樣品； 在線裂解吹掃捕集； 表面增強拉曼光譜

1 引 言

氰化物是一種廉價、速殺的血液性毒劑，中毒事件屢有發(fā)生[1～3]。氰化物吸收入體后，氰根可迅速與細(xì)胞線粒體內(nèi)高鐵細(xì)胞色素氧化酶結(jié)合，生成氰化高鐵細(xì)胞色素氧化酶，使其失去傳遞氧的作用，造成組織缺氧，最終導(dǎo)致機體窒息，甚至死亡[4]。氰化物屬于劇毒物質(zhì)，人體口服途徑的急性中毒致死劑量為0.48～3.37 mg/kg體重（氰根）[5]，在數(shù)分鐘內(nèi)即出現(xiàn)急性中毒癥狀。因此，盡早發(fā)現(xiàn)、及時干預(yù)是有效救治的基本原則，而血液氰化物含量的現(xiàn)場快速檢測是指導(dǎo)中毒救治的首要前提。

目前，針對氰化物中毒生物樣本常用的檢測方法包括目視比色法[6，7]、分光光度法[8]、氣相色譜法[9]、離子色譜法[10]及色譜質(zhì)譜法[11]等。其中，目視比色法和分光光度法等多利用氰化物和顯色物質(zhì)間的定量反應(yīng)，靈敏度在0.01～ 1 mg/L水平，特異性較差； 而色譜（質(zhì)譜）等方法中，氰化物（氰根或氧化物）自身屬于高極性小分子物質(zhì)，除需衍生化或選擇特殊類型的色譜柱外，中毒生物樣品前處理過程復(fù)雜、耗時，使得上述方法僅適用于實驗室檢測。表面增強拉曼光譜（Surfaceenhanced Raman spectroscopy， SERS）技術(shù)具有靈敏度高、指紋譜準(zhǔn)確識別、檢測速度快、適用于現(xiàn)場快速檢測等優(yōu)點[12～16]，本課題組前期亦發(fā)展了芥子氣[17]、光氣[18]、百草枯[19]等化學(xué)毒劑毒物的SERS現(xiàn)場快速檢測方法。SERS技術(shù)在氰化物中毒現(xiàn)場檢測方面具有較大潛力。

本研究基于有孔殼層隔絕納米粒子（Pinhole shellisolated nanoparticles，pinSHINs），結(jié)合便攜式拉曼光譜，建立了一種血液氰化物快速SERS檢測新方法。PinSHINs極薄的有孔SiO2殼層能夠有效保護金核，極大地削弱了Au-CN配位形成可溶性復(fù)合物Au（CN）所導(dǎo)致的“溶金”效應(yīng)，使其具有比普通金納米粒子（AuNPs）更優(yōu)越的穩(wěn)定性[20，21]。

但是考慮到與血細(xì)胞中細(xì)胞色素氧化酶結(jié)合的氰化物難以被直接檢測，常用強酸使結(jié)合態(tài)氰化物釋放產(chǎn)生HCN，再進行衍生化及分光光度法測定[8，22，23]，較為復(fù)雜、耗時。本研究構(gòu)建了血液中氰化物的在線裂解吹掃捕集方法，以濃H2SO4酸化全血樣品，將結(jié)合態(tài)氰化物裂解，并轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性的HCN氣體，經(jīng)N2吹掃至堿液中形成NaCN，繼而直接對堿液進行SERS檢測，其靈敏度高、特異性強，操作方便快速，檢出限達10 μg/L。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

所有SERS光譜于iRaman型便攜式拉曼光譜儀（美國 B&W TEK公司）上測定（激光波長785 nm，分辨率4.5 cm）。紫外可見吸收光譜（UVVis）于Cary 300型紫外可見分光光度計上（美國Varian公司）獲得。

NaCN（純度為99%，申領(lǐng)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所毒劑庫）； Na2SiO3（美國Sigma公司）； NaOH（國藥集團北京化學(xué)試劑公司）； 3氨丙基三乙氧基硅烷（ATPMS，美國Alfa Aesar公司）； 消泡劑為本課題組自制（主要成分為脂肪酸酯）； 真空封泥（酒泉祁天特種油品有限公司）； 15 mL離心管及96孔酶標(biāo)板（美國Corning公司）； 肝素化采血管（江蘇宇力醫(yī)療器械有限公司）。除特殊說明外，所有化學(xué)試劑均為分析純或以上。所有溶液均由超純水（MilliQ A10，美國Millipore公司）配制。雄性SD大鼠（SPF級180～200 g，北京維通利華動物實驗公司，許可證號：SCXK（京）20120001），飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心SPF級動物房。氰化物中毒患者全血樣品由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院中毒救治科提供。

2.2 實驗方法

2.2.1 殼層隔絕金納米粒子的制備 首先用Frens檸檬酸鈉還原法[24]合成粒徑約為55 nm的金納米粒子（AuNPs），向制備好的55 nm AuNPs中加入1 mmol/L APTMS溶液，攪拌15 min，再加入Na2SiO3溶液 （0.54%， w/w） 并攪拌3 min，使AuNPs表面包覆生成SiO2殼層?？刂芅a2SiO3溶液的pH>11，即可生成1～2 nm厚的有孔SiO2殼層[25]。

2.2.2 NaCN標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱量NaCN 10.00 mg，用0.01 mol/L NaOH溶液溶解并定容至10 mL， 得1.00 g/L NaCN對照品溶液，于4℃保存。使用時，以0.01 mol/L NaOH溶液稀釋得到濃度為0.005、0.05、0.5、5和50 mg/L的工作溶液。

2.2.3 血液氰化物在線裂解吹掃捕集裝置的構(gòu)建 血液氰化物在線裂解吹掃捕集裝置分為揮發(fā)裝置（A）、吸收裝置（B）和尾氣吸收裝置（C）三部分（圖1），3只15 mL離心管經(jīng)相同孔徑導(dǎo)管相連，導(dǎo)管連接處均經(jīng)真空泥密封，氣密性檢測表明裝置無漏氣。在裝置（A）中加入濃H2SO4，使結(jié)合態(tài)氰化物酸化裂解，生成HCN氣體，經(jīng)氮氣吹掃至裝置（B），被其中的NaOH溶液充分吸收，形成NaCN，對吸收液進行SERS檢測； 裝置（C）連有一段活性炭管，以吸收多余的尾氣。在優(yōu)化條件下，裝置（A）中添加1 mL待測樣品、4 mL 12 mol/L H2SO4溶液和200 μL消泡劑（快速消除吹掃血樣時產(chǎn)生的大量泡沫，防止堵塞管路），裝置（B）和（C）中均加入1 mL 0.1 mol/L NaOH溶液。

2.2.4 SERS檢測 取1 mL pinSHINs，5000 r/min離心5 min，去除上清液，與200 μL吸收液混合，移入96孔酶標(biāo)板，進行SERS檢測。便攜式拉曼光譜儀參數(shù)為：激光功率90 mW，積分時間10 s。

2.2.5 NaCN染毒動物實驗 依據(jù)口服常用染毒劑量[26]及預(yù)實驗數(shù)據(jù)，按3 mg/kg（50%半數(shù)致死劑量LD50）的劑量向插管SD雄性大鼠灌胃染毒NaCN生理鹽水溶液，在注射之前抽取血液，設(shè)為“零”時間點。在注射后5 min，15 min， 30 min， 60 min， 2 h， 4 h和6 h各抽取血液500 μL于肝素化采血管中，按2.2.3和2.2.4節(jié)進行檢測。

3 結(jié)果與討論

3.1 PinSHINs的表征

以 UVVis 吸收光譜、TEM及 HRTEM 對 pinSHINs 進行表征（圖2）。pinSHINs的最大紫外吸收峰位于536 nm處，半峰寬較窄，說明粒徑分布較均勻，計算得到的粒徑約為60 nm[27]； TEM表征下pinSHINs的粒徑約為55 nm； HRTEM表征下其Au核外包裹了約為1 nm的SiO2 殼層，在此厚度下，殼層中分布有大量孔隙[25]，氰根可通過孔隙與Au核表面直接接觸[21]，保持了對氰根響應(yīng)信號的良好增強性能。

3.2 血液氰化物在線裂解吹掃捕集與SERS檢測

目前已報道的氰化物SERS檢測方法中，多存在“溶金”效應(yīng)，檢測信號僅可穩(wěn)定存在5 min[28]； 且目前尚無血液中氰化物的SERS檢測報道。其難點在于，血液中的氰化物大部分與血細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素氧化酶生成結(jié)合態(tài)[29]，難以直接檢測。構(gòu)建的在線裂解吹掃捕集裝置，以濃H2SO4酸化樣品，可將細(xì)胞中結(jié)合態(tài)氰化物裂解并轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性的HCN氣體，經(jīng)N2吹掃至堿液中，形成NaCN，無需任何復(fù)雜反應(yīng)，后續(xù)采用pinSHINs為基底，可對堿性吸收液直接進行SERS檢測，即可得到靈敏且穩(wěn)定的氰根指紋譜信號（圖3A）。

經(jīng)優(yōu)化后確定，濃H2SO4濃度12 mol/L、NaOH吸收液濃度0.1 mol/L、N2吹掃時間20 min為結(jié)合態(tài)氰化物裂解捕集最佳條件。將本方法與本課題組已報道的氰化物在線氫化產(chǎn)氣吹掃方法進行比較[19]，捕集效率提高了10倍（約為77%～81%）（圖3B）。

不同濃度NaCN（100～2000 μg/L）染毒全血實驗結(jié)果表明，2135 cm處SERS峰強度與NaCN濃度存在良好線性響應(yīng)（y=17x+4393； R2=0.997）（圖4A），定量下限低于臨床上發(fā)生中毒反應(yīng)時血液氰化物濃度（200 μg/L）[9]。低、中、高濃度（200、1000和1500 μg/L）下，本方法相對回收率為91%、106%和108%，RSD值為4.9%、7.6%和4.8%，表明方法可靠性和穩(wěn)定性較好。本方法的檢出限為10 μg/L，低于人血液氰化物致死濃度（LD100）1000 μg/L[27]兩個數(shù)量級，即可檢測到0.01 LD100，適合于檢測各種程度的氰化物中毒血液樣品。

常用的AuNPs易與氰化物發(fā)生“溶金”效應(yīng)，且在強堿性條件下會過度團聚，導(dǎo)致檢測信號迅速衰減，而pinSHINs由于其外層包裹的SiO2殼層，有效削弱了“溶金”效應(yīng)，且能耐受較寬的pH范圍，因此穩(wěn)定性得到了有效改善，SERS檢測信號1 h后依然可保持80%以上，如圖4B所示。5個批次pinSHINs的穩(wěn)定性采用低、中、高（200、1000和1500 μg/L）3個濃度NaCN加標(biāo)全血樣品進行評估，氰根信號強度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為 6.2%、8.1%和7.7%，表明制備的pinSHINs具有良好的重復(fù)性。

3.3 染毒大鼠全血及臨床樣品氰化物濃度的檢測應(yīng)用實例

利用本方法檢測了50% LD50的NaCN灌胃染毒大鼠不同時間點的全血樣品中氰化物濃度。如圖5A所示， NaCN灌胃10 min后，全血氰化物濃度迅速增加至最大值（2613 μg/L），血液中氰化物半衰期為56 min，與文獻＼[24＼]報道基本相符； 10～30 min氰化物在體內(nèi)的代謝迅速下降； 30～100 min氰化物代謝緩慢降低； 6 h后，氰化物濃度趨于本底值。未染毒大鼠全血中檢測到少量內(nèi)源性氰化物（經(jīng)濃縮富集估算約30 μg/L），可通過隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線排除其干擾。

將本方法用于臨床快速篩查氰化物中毒。分析了3份氰化物中毒患者全血樣品，一份為口服KAl（CN）4藥片39 h后的采集血樣（1#），另兩份為注射網(wǎng)購含氰化鉀或氯化琥珀膽堿的“捕狗藥”后的采集血樣（2#，3#），患者送醫(yī)時均深度昏迷，多臟器功能損傷，嚴(yán)重者呼吸心跳已經(jīng)停止。按照本方法進行測定，1#和2#測得氰化物的濃度分別為910和530 μg/L，3#未檢出氰化物（考慮為氯化琥珀膽堿）（圖5B）。 為臨床及時救治提供了參考。

4 結(jié) 論

基于殼層隔絕納米粒子的強堿耐受性和能夠有效克服“溶金”效應(yīng)的優(yōu)勢，以及所構(gòu)建的在線裂解吹掃捕集裝置，建立了一種氰化物快速檢測SERS新方法，實現(xiàn)中毒全血結(jié)合態(tài)氰化物的有效解離、揮發(fā)及吸收，達到了快速、高靈敏定量檢測中毒血液中氰化物的目的。本方法已應(yīng)用于氰化物灌胃染毒大鼠及臨床氰化物中毒血液樣本檢測，且所有SERS檢測均于便攜式拉曼光譜儀上完成，顯示出在氰化物中毒現(xiàn)場快速檢測良好的應(yīng)用前景。預(yù)期除血液樣品外，本方法亦可適用于食品、環(huán)境復(fù)雜基質(zhì)中的氰化物檢測。

References

1 Barillo D J， Goode R， Esch V. J. Burn Care Rehabil.， 1994， 15（1）： 46-57

2 Baud F J， Barriot P， Toffis V， Riou B， Vicaut E， Lecarpentier Y， Bourdon R， Astier A， Bismuth C. N. Engl. J. Med.， 1991， 325（25）： 1761-1766

3 Gleadow R M. Plant Biol.， 2014， 65（65）： 155-185

4 Conn E E. Effects of Poisonous Plants on Livestock. New York： Academic Press， 1978： 301-310

5 Joint F A O. World Health Organization， WHO Expert Committee on Food Additives. Safety Evaluation of Certain Food Additives and Contaminants： Prepared by the Seventy Fourth Meeting of the Joint FAO＼[R/OL＼]. 2012： 299＼[2011119＼]

6 Chaudhary M T， Sarwar M， Tahir A M， Tahir M A， Mustafa G， Wattoo S A， Imran M， Subhani A. Australian J. Forensic Sci.， 2015， 48（1）： 42-49

7 XU Hong， SONG YinSheng， CAO WenTing， ZHANG ChunLing. Chin J Health Lab Tec， 2015， 25（11）： 1705-1707

徐 虹， 宋寅生， 曹文婷， 張春玲. 中國衛(wèi)生檢驗雜志， 2015， 25（11）： 1705-1707

8 Lundquist P， Srbo B. Clin. Chem.， 1989， 35（4）： 617-619

9 Calafat A M. Stanfill S B. J. Chromatogr. B， 2002， 772（1）： 131-137

10 Chinaka S， Takayama N， Michigami Y， Ueda K. J. Chromatogr. B， 1998， 713（2）： 353-359

11 Lacroix C， Saussereau E， Boulanger F， Goullé J P. J. Anal. Toxicol.， 2011， 35（3）： 143-147

12 Zhu Q X， Cao Y B， Cao Y Y， Chai Y F， Lu F. Anal. Bioanal.Chem.， 2014， 406（7）： 1877-1884

13 LUO ZhiXun， FANG Yan. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2006， 26（2）： 358-364

駱智訓(xùn)， 方 炎. 光譜學(xué)與光譜分析， 2006， 26（2）： 358-364

14 LIU JiangMei， LIU WenHan， TENG YuanJie， YUAN RongHui. Chin. J. Lumin， 2015， 36（12）： 1477-1484

劉江美， 劉文涵， 滕淵潔， 袁榮輝. 發(fā)光學(xué)報， 2015， 36（12）： 1477-1484

15 ZUO Qi， CHEN Yao， SHI CaiXia， CHEN ZengPing. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（11）： 1656-1663

左 奇， 陳 瑤， 石彩霞， 陳增萍. 分析化學(xué)， 2015， 43（11）： 1656-1663

16 Shi Y E， Wang W S， Zhan J H. Nano Res.， 2016， 9（8）： 2487-2497

17 GAO Jing， WU JianFeng， GAO HaiYue， GUO Lei， XIE JianWei. Chinese J. Anal. Chem.， 2014， 42（10）： 1465-1470

高 敬， 吳劍峰， 高海月， 郭 磊， 謝劍煒. 分析化學(xué)， 2014， 42（10）： 1465-1470

18 Gao H Y， Wu J F， Zhu Y J， Guo L， Xie J W. J. Raman. Spectrosc.， 2015， 47（2）： 233-239

19 Zhu Y J， Wu J F， Gao H Y， Liu G K， Tian Z Q， Feng J L， Guo L， Xie J W. RSC Adv.， 2016， 6（65）： 59919-59926

20 Li J F， Huang Y F， Ding Y， Yang Z L， Li S B， Zhou X S， Fan F R， Zhang W， Zhou Z Y， Ren B. Nature， 2010， 464（7287）： 392-395

21 Gao J， Guo L， Wu J F， Feng J L， Wang S M， Lai F L， Xie J W， Tian Z Q. J. Raman. Spectrosc.， 2014， 45（8）： 619-626

22 Lundquist P， Rosling H， Srbo B. Clin. Chem.， 1985， 31（4）： 591-595

23 Hughes C， Lehner F， Dirikolu L， Harkins D， Boyles J， McDowell K， Tobin T， Crutchfield J， Sebastian M， Harrison L. Toxicol. Mechanisms Method， 2008， 13（2）： 129-138

24 Frens G. Nature， 1973， 241（105）： 20-22

25 Li J F， Tian X D， Li S B， Anema J R， Yang Z L， Ding Y， Wu Y F， Zeng Y M， Chen Q Z， Ren B. Nat. Protoc.， 2013， 8（1）： 52-65

26 Sousa A B， Manzano H， Sotoblanco B， Górniak S L. Arch. Toxicol.， 2003， 77（6）： 330-334

27 Haiss W， Thanh N T K， Aveyard J， Fernig D G. Anal. Chem.， 2007， 79（11）： 4215-4221

28 Senapati D， Dasary S S R， Signh A K， Senapati T， Yu H， Ray P C. Chem. Eur J.， 2001， 17（30）： 8445-8451

29 Vesey C J， Wilson J. J. Pharm. Pharmac.， 1978， 30（1）： 20-26