宋愛(ài)英+王麗紅+張延霞+石恩林+曾俊菱

摘 要 建立了氣泡微萃取結(jié)合氣相色譜/質(zhì)譜技術(shù)（GCMS）測(cè)定尿中咖啡因的方法。對(duì)影響萃取效率的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳萃取條件：三氯甲烷作為萃取溶劑，萃取溶劑暴露體積1 μL，氣泡體積1.6 μL，攪拌速度300 r/min，萃取時(shí)間5 min，鹽度15%（m/V），氣泡與磁子間距離1 cm。在優(yōu)化條件下，所建立方法在咖啡因濃度0.005～10 mg/L范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)可達(dá)0.986，檢出限為0.003 mg/L。在人尿液中添加不同濃度的咖啡因（0.050、0.500和5.000 mg/L），回收率為89.2%～107.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于8%（n=6）。

關(guān)鍵詞 氣泡微萃取； 咖啡因； 氣相色譜/質(zhì)譜； 尿

1 引 言

咖啡因（Caffeine）是一種嘌呤類生物堿，即1，3，7三甲基黃嘌呤，屬中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑，適量攝入能夠緩解疲勞、振奮精神、提高注意力[1，2，]，被廣泛用作食品添加劑[3]。同時(shí)，咖啡因也是一種毒品，不當(dāng)使用會(huì)造成上癮、神經(jīng)過(guò)敏和睡眠紊亂等不良反應(yīng)，嚴(yán)重者甚至?xí)?dǎo)致中毒或死亡[4～7]。因此，對(duì)人體檢材中咖啡因的測(cè)定具有非常重要的意義。由于人體檢材基體復(fù)雜，在進(jìn)行儀器分析前需對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)前處理，但以液液萃取、固相萃取為代表的傳統(tǒng)樣品前處理技術(shù)存在操作步驟繁瑣、耗時(shí)耗力、要消耗大量對(duì)人體和環(huán)境有毒有害的有機(jī)溶劑等缺點(diǎn)[8，9]，因此，亟待開(kāi)發(fā)綠色高效的新型樣品前處理技術(shù)。

近年發(fā)展起來(lái)的氣泡微萃取技術(shù)（BIDSDME）采用向萃取溶劑微滴中引入適量空氣的手段，在置于樣品溶液中的微量注射器針尖形成氣泡，萃取一定時(shí)間后，將氣泡抽回到微量注射器中， 完成萃取過(guò)程。該技術(shù)不僅保留了單滴液相微萃取的簡(jiǎn)便快速、成本低廉、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[10，11]，而且還具有萃取溶劑微滴表面積更大、使比重大的萃取溶劑（如二氯甲烷、三氯甲烷等）微滴在萃取過(guò)程中更加穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，目前，已被成功用于對(duì)水樣、土壤、牛尿等樣品中的農(nóng)藥、除草劑和雌激素等目標(biāo)分析物的萃取[12～15]。

此前，Shrivas等將0.5 μL三氯甲烷暴露于7 μL微量樣品中，完成了對(duì)咖啡因的萃取分離[16]。該方法雖有所需樣品量少、無(wú)基質(zhì)效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，但受萃取溶劑量少和萃取過(guò)程只能在無(wú)攪拌條件下進(jìn)行等因素限制，其萃取效率還比較低。受此啟發(fā)，本研究將暴露于樣品溶液的萃取溶劑體積增至1 μL，并向其中引入了0.6 μL空氣，通過(guò)優(yōu)化攪拌速度、萃取時(shí)間和鹽度等實(shí)驗(yàn)參數(shù)，結(jié)合GC/MS，建立了測(cè)定尿中咖啡因的BIDSDMEGC/MS分析方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

6890/5975氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司），HP5毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.32 mm × 0.50 μm， 美國(guó)Agilent公司）； WH220 plus磁力攪拌器（德國(guó)Wiggens公司）； MettlerAE 163十萬(wàn)分之一分析天平； 微量注射器（5 μL，美國(guó)Agilent公司）； MilliQ Element純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）。

咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品（純度為97%，北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司）； 二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、正己烷和環(huán)己烷（分析純，天津利安隆博華醫(yī)藥化學(xué)有限公司）； 咖啡粉（1+2原味）購(gòu)于當(dāng)?shù)爻小?/p>

2.2 樣品預(yù)處理

自愿者在實(shí)驗(yàn)前36 h內(nèi)未攝入任何含咖啡因的飲料或食品。將15 g咖啡粉用150 mL開(kāi)水沖泡，涼溫后由自愿者飲用，采集自愿者飲用咖啡前所排尿液作為空白，采集飲用咖啡后1～24 h內(nèi)所排尿液作為待測(cè)樣品。代謝咖啡因測(cè)定于尿樣采集后1 h內(nèi)完成。測(cè)定過(guò)程中向待測(cè)尿液加入適量NaCl，使其鹽度保持在15%（m/V），尿樣的初始鹽度參照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測(cè)定[17]。

具體萃取過(guò)程： 取1 mL尿樣于盛有磁子的具塞小瓶中，用微量注射器吸入1.1 μL有機(jī)溶劑，再吸入0.6 μL空氣，用微量注射器刺穿瓶塞，伸入尿樣液面以下，緩慢推出空氣和1 μL有機(jī)溶劑（保留在微量注射器金屬針管中的0.1 μL有機(jī)溶劑用于提高對(duì)氣泡的固定作用）， 在注射器針尖形成氣泡，以300 r/min轉(zhuǎn)速萃取5 min后，停止攪拌，仔細(xì)將整個(gè)氣泡抽回微量注射器后，直接向GC/MS進(jìn)樣。BIDSDME萃取裝置為自行搭建，其結(jié)構(gòu)如圖1 所示。

2.3 儀器工作參數(shù)

2.3.1 氣相色譜條件 HP5毛細(xì)管色譜柱，柱溫保持在200℃，每次信號(hào)采集時(shí)間為5 min； 進(jìn)樣口溫度為250℃； 采用分流進(jìn)樣模式，分流比為10∶1； 載氣為高純（純度≥99. 999%）氦氣，流量為1.3 mL/min。

2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源為電子轟擊離子（EI）源，電子轟擊能量為70 eV，離子源溫度為230℃，傳輸線溫度為150℃，采用全掃描（SCAN）模式； 相對(duì)保留時(shí)間4.67 min，根據(jù)碎片離子峰的相對(duì)強(qiáng)度大小，選取離子m/z 194，109和 82對(duì)目標(biāo)分析物進(jìn)行定性[22]； 溶劑延遲時(shí)間為3 min。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

咖啡因標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取咖啡因10.00 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成1 mg/mL的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃避光保存。

咖啡因工作溶液：吸取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用去離子水定容， 使其質(zhì)量濃度分別為0.005、0.010、0.050、0.100、0.500、1.00、5.00和10.00 mg/L。

3 結(jié)果與討論

3.1 萃取條件的優(yōu)化

3.1.1 萃取溶劑的選擇 萃取溶劑的選取對(duì)萃取效率具有重要影響。萃取溶劑須滿足：（1）不溶或難溶于樣品溶液； （2）對(duì)目標(biāo)分析物具有很好的選擇性，并盡可能少的萃取樣品基體成分； （3）密度適宜，使得萃取微滴在樣品中所受重力和浮力的合力盡可能小，從而保證在萃取過(guò)程中微滴不易從針尖易位或脫落等條件[14，18]。根據(jù)以上原則，考察了二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、正己烷和環(huán)己烷7種有機(jī)溶劑對(duì)水樣中咖啡因的萃取能力，結(jié)果表明，三氯甲烷的萃取效率最好。因此選取三氯甲烷作為萃取溶劑。

3.1.2 氣泡體積的選擇 氣泡體積為吸入的有機(jī)溶劑和空氣的體積之和。由萃取溶劑和所引入空氣體積共同決定，對(duì)萃取效率有顯著影響。首先考察了三氯甲烷暴露體積（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 μL）對(duì)萃取效率的影響。由圖2可見(jiàn)，萃取效率隨著三氯甲烷暴露體積的增加而提高，但當(dāng)體積超過(guò)1 μL時(shí)， 引入空氣會(huì)導(dǎo)致氣泡易位甚至掉落，因此選取三氯甲烷暴露體積為1 μL。其次，考察了引入空氣體積（0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 μL）對(duì)萃取效率的影響。由圖3可見(jiàn)，隨著引入空氣體積的增加，萃取效率和精密度在逐漸提高，當(dāng)引入空氣體積增至0.6 μL時(shí)，萃取效率和精密度達(dá)到了最佳，而后隨氣泡體積的增大而下降。因此，選取引入空氣體積為0.6 μL，最終確定氣泡體積為1.6 μL。

3.1.3 攪拌速度的選擇 提高攪拌速度可以有效增大傳質(zhì)速率，從而進(jìn)一步提高萃取效率，但攪拌速度過(guò)高會(huì)損害氣泡的穩(wěn)定性?？疾炝瞬煌瑪嚢杷俣龋?、100、150、200、250、300、350、400、450和500 r/min）對(duì)萃取效率的影響，結(jié)果表明，隨著轉(zhuǎn)速增加，萃取效率不斷提高，但當(dāng)轉(zhuǎn)速超過(guò)300 r/min時(shí)，易造成氣泡偏離針尖， 甚至掉落，因此，選取轉(zhuǎn)速為300 r/min。

3.1.4 萃取時(shí)間的選擇 萃取時(shí)間也是影響萃取效率的重要參數(shù)?？疾炝溯腿r(shí)間（1， 5， 10， 15， 20， 25和30 min）對(duì)萃取效率的影響。由圖4可見(jiàn)，在15 min內(nèi)，隨著萃取時(shí)間延長(zhǎng)，萃取效率也在逐漸提高，但當(dāng)萃取時(shí)間超過(guò)15min時(shí)，萃取效率會(huì)明顯下降，原因可能是三氯甲烷具有揮發(fā)性和部分水溶性，萃取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致三氯甲烷的揮發(fā)和/或溶解損失。另外，在分析尿樣過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)萃取時(shí)間超過(guò)6 min時(shí)，氣泡在被抽回的過(guò)程中有少量掉落，因此選取萃取時(shí)間為5 min。

3.1.5 pH值和鹽度的選擇 pH值會(huì)影響某些目標(biāo)物分子在樣品溶液中的存在形式，因而會(huì)通過(guò)改變目標(biāo)分子在水相和有機(jī)相間的分配比，因而會(huì)通過(guò)改變目標(biāo)分子在水相和有機(jī)相之間的分配比來(lái)影響萃取效率。本研究采用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH對(duì)咖啡因標(biāo)準(zhǔn)液pH值進(jìn)行調(diào)控，考察了pH值對(duì)萃取效率的影響。結(jié)果表明，在pH 2～7范圍內(nèi)，萃取效率隨pH值增加而明顯提高。原因是咖啡因?qū)儆谌鯄A性化合物，在酸性條件下，其主要以離子形式存在，在水相中的溶解度較大； 隨著pH值增加，咖啡因主要以分子形式存在，在有機(jī)相/水相間的分配比會(huì)增大所致[19]。為了盡量保證樣品的原始狀態(tài)和減少操作步驟，本研究未對(duì)pH值進(jìn)行調(diào)控。

利用鹽析效應(yīng)可以降低目標(biāo)物在樣品溶液中的溶解度，進(jìn)而提高萃取效率。在靜態(tài)（無(wú)攪拌條件下）和動(dòng)態(tài)（攪拌條件下）兩種模式下，考察了NaCl含量（m/V）對(duì)萃取效率的影響。由圖5可見(jiàn)，采用動(dòng)態(tài)模式有利于提高萃取效率，并且在靜態(tài)模式下，增加鹽度對(duì)萃取效率有抑制作用，該現(xiàn)象與文獻(xiàn)[16]報(bào)道結(jié)果完全一致。在動(dòng)態(tài)模式下，起初萃取效率隨著鹽度增加而提高，當(dāng)鹽度增至15%時(shí)，萃取效率達(dá)到了最佳，隨后萃取效率下降。出現(xiàn)以上現(xiàn)象的原因可能是，鹽的存在不僅可提高咖啡因在有機(jī)相和水相間的分配比，同時(shí)大量鹽的陰陽(yáng)離子還會(huì)抑制咖啡因在水相中的自由擴(kuò)散，在靜態(tài)模式下，第二種效果起了主導(dǎo)作用； 在動(dòng)態(tài)模式下，當(dāng)鹽度較低時(shí)，第一種效果起主導(dǎo)作用，而當(dāng)鹽度較高時(shí)，則第二種效果起了主導(dǎo)作用。為了獲取最佳萃取效率，本研究選取鹽度為15%。

3.1.6 氣泡與磁子間距離的選擇 在實(shí)際萃取過(guò)程中，氣泡與磁子間距離的變化也會(huì)影響萃取效率，距離越小，樣品液體攪動(dòng)越劇烈，萃取效率也越高，但同時(shí)氣泡受到的擾動(dòng)也越加嚴(yán)重。通過(guò)考察不同距離時(shí)的萃取效率發(fā)現(xiàn)，氣泡與磁子間距離d=1 cm時(shí)萃取效果最佳。 綜上所述，選擇三氯甲烷為萃取溶劑，萃取溶劑暴露體積1 μL，氣泡體積為1.6 μL，轉(zhuǎn)速300 r/min，萃取時(shí)間5 min，鹽度15% （m/V），氣泡與磁子間的距離1 cm作為最佳的萃取條件，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2 檢出限、線性范圍、加標(biāo)回收率及富集倍數(shù)

配制不同濃度的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述最佳條件下進(jìn)行萃取實(shí)驗(yàn)，檢出限按信噪比等于3進(jìn)行計(jì)算，分別以總離子流峰面積y對(duì)為質(zhì)量濃度x（mg/L）做工作曲線。本方法檢出限為0.003 mg/L，線性范圍為0.005～10 mg/L，其線性方程為y=1213x+875，r=0.982。向尿樣中添加不同濃度的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)，使其理論濃度分別為0.050、0.500和5.000 mg/L，利用本方法測(cè)得平均回收率為89.2%～107.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD， n=6）為5.7%～7.8%（結(jié)果見(jiàn)表1），說(shuō)明本方法精密度和準(zhǔn)確度均比較好，并且不存在基質(zhì)效應(yīng)。對(duì)含0.1 mg/L咖啡因的水樣進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算出富集倍數(shù)為37。

3.3 實(shí)際尿樣分析

利用本方法對(duì)尿中咖啡因24 h內(nèi)的代謝濃度進(jìn)行了分析（圖6），結(jié)果表明，自愿者第一次排尿（1.2 h）中的咖啡因濃度為0.821 mg/L，并且在7 h內(nèi)基本保持恒定，此后尿中咖啡因濃度逐漸降至0.506 mg/L，說(shuō)明本方法完全可用于對(duì)尿樣中咖啡因的測(cè)定。

3.4 液泡微萃取與其它方法的比較

將本研究方法與液液萃?。↙LE）、固相萃?。⊿PE）和中空纖維保護(hù)的液相微萃取（HFLPME）方法進(jìn)行了比較。由表2可知，本方法所需萃取溶劑體積僅為HFLPME的1/5，遠(yuǎn)少于LLE和SPE，萃取時(shí)間明顯短于其它方法。

本方法通過(guò)向萃取溶劑微滴引入空氣形成氣泡，增大了溶劑微滴的表面積，提高了目標(biāo)分析物的傳質(zhì)速率，從而獲得了較高的方法靈敏度； 同時(shí)，還增大了萃取溶劑微滴在尿樣中所受浮力，降低了自身重力的影響，從而提高了微滴在萃取過(guò)程中的穩(wěn)定性，使其在攪拌條件下能夠順利完成對(duì)咖啡因的萃取和富集。本方法可在10 min內(nèi)完成對(duì)尿樣中咖啡因的分析，與傳統(tǒng)液液萃取法相比，具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[20～22]，具有很好的應(yīng)用前景。

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