李 娜，賀國洋，李永真，王志慧

沉默缺氧誘導(dǎo)因子-2α對乳腺癌細(xì)胞化療敏感性的影響

李 娜，賀國洋，李永真，王志慧

目的 探討缺氧誘導(dǎo)因子-2α(hypoxia inducible factor-2α, HIF-2α)siRNA對人乳腺癌細(xì)胞增殖及化療藥物敏感性的影響。方法 RNA干擾技術(shù)沉默MCF-7細(xì)胞中HIF-2α的表達(dá)；采用免疫細(xì)胞化學(xué)和RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染后HIF-2α基因的表達(dá)，CoCl2模擬缺氧條件下，采用MTT比色法和流式細(xì)胞術(shù)檢測不同劑量的化療藥物(5-氟尿嘧啶、阿霉素和紫杉醇)在HIF-2α沉默后對細(xì)胞生長抑制率和細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果 經(jīng)HIF-2α siRNA處理的MCF-7細(xì)胞中HIF-2α基因表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，HIF-2α siRNA處理的MCF-7細(xì)胞在不同劑量化療藥物作用后，細(xì)胞生長抑制率和細(xì)胞凋亡率與對照組相比其明顯增加，化療藥物敏感性明顯增強(qiáng)(P<0.05)。結(jié)論 HIF-2α siRNA具有促進(jìn)化療藥物誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡、抑制增殖及增強(qiáng)化療藥物敏感性的作用，沉默HIF-2α有望成為乳腺癌基因治療的新途徑。

乳腺腫瘤；缺氧誘導(dǎo)因子-2α；RNA干擾；化療敏感性

局部缺氧是實(shí)體腫瘤微環(huán)境普遍存在的一種現(xiàn)象[1]，缺氧亦是影響惡性腫瘤預(yù)后的重要因素。缺氧誘導(dǎo)因子-2α(hypoxia inducible factor-2α, HIF-2α)是其中最主要的調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞應(yīng)對局部缺氧等微環(huán)境而發(fā)生適應(yīng)性反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子。課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HIF-2α促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移，與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[2-3]，同時課題組還證實(shí)HIF-2α可以調(diào)控多藥耐藥基因1(multiple drug resistance 1, MDR1)的表達(dá)，參與乳腺癌多藥耐藥的形成。目前，是否可以通過干擾HIF-2α的表達(dá)來逆轉(zhuǎn)乳腺癌的耐藥性尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本文擬通過沉默HIF-2α基因的表達(dá)，分析其對乳腺癌細(xì)胞化療敏感性的影響，為逆轉(zhuǎn)乳腺癌多藥耐藥提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 RT-PCR試劑盒和PCR試劑盒等均購自Invitrogen公司；TRIzol試劑、SuperScript First-Strand Synthesis System引物均由上海生工公司合成；β-actin抗體購自Santa Cruz公司；HIF-2α兔抗人多克隆抗體購自武漢博士德生物公司；5-氟尿嘧啶、阿霉素和紫杉醇購于Pharmasia公司。DMSO購于Sigma公司；MCF-7細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存。熒光顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與基因轉(zhuǎn)染 將建立好的缺氧乳腺癌細(xì)胞在含有100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素、10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基中37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞長至85%融合時，參照Invitrogen公司Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，設(shè)置空白對照組(MCF-7組)、MCF-7/HIF-2α siRNA 組、MCF-7/無義siRNA組，細(xì)胞轉(zhuǎn)染9 h后，更換新鮮完全培養(yǎng)基。

1.2.2 RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中HIF-2α mRNA的表達(dá) RNA提取按照Trizol RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行，cDNA第一條鏈體外逆轉(zhuǎn)錄合成，以cDNA為模板，擴(kuò)增HIF-2α mRNA。引物序列HIF-2α上游：5′-TGAAAACGAGTCCGAAGCC-3′，下游：5′-GTGGCTGACTTGAGGTTGA-3′；GAPDH上游：5′-ATTCATCTCTCCTCTCCCA-3′，下游：5′-GTTGGTGGTTGGTACTGT-3′，PCR反應(yīng)條件：94 ℃×2 min，94 ℃×1 min、50 ℃×1 min和72 ℃延伸30 s，28個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。預(yù)期擴(kuò)增片段大小分別為342 bp和580 bp。取5 μL用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上成像并測定分析。

1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中HIF-2α蛋白的表達(dá) 取少量消化后收集的上述轉(zhuǎn)染后細(xì)胞制作細(xì)胞涂片，經(jīng)10%中性福爾馬林固定20 min，HIF-2α蛋白表達(dá)按常規(guī)免疫細(xì)胞化學(xué)染色法進(jìn)行檢測。DAB染色陽性顯色為棕黃色顆粒，主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。所有切片均采用HPIAS-1000高清晰圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，每張切片隨機(jī)選取5個視野，取其平均光密度(optical density,OD)的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.4 MTT法檢測乳腺癌細(xì)胞增殖活性 以每毫升1.5×105個將MCF-7細(xì)胞接種于96孔板，每孔加200 μL含10%胎牛血清和CoCl2(終濃度為100 μmol /L)的PRMI 1640培養(yǎng)液，5%CO2、37 ℃孵箱中培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染24 h后各組加入5-氟尿嘧啶(終濃度10 μg/L)、阿霉素(終濃度1.0 μg/mL)和紫杉醇(終濃度10 μg /mL)，培養(yǎng)24 h后加入MTT(終濃度5 mg/mL)每孔20 μL，37 ℃孵育4 h，每孔吸去上清后加入二甲基亞砜(DMSO)200 μL，酶標(biāo)儀上讀取570 nm處吸光度值A(chǔ)570。計(jì)算各組細(xì)胞生長抑制率[抑制率=(空白對照組平均吸光度值-用藥組平均吸光度值)/空白對照組平均吸光度值×100%]，每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 將上述3種細(xì)胞接種于6 孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞長至約70 %融合時，加入5-氟尿嘧啶(終濃度10 μg/mL)、阿霉素(終濃度1.0 μg/mL)和紫杉醇(終濃度10 μg /mL)，同時用含100 μmol/L CoCl2的PRMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h。收集細(xì)胞、洗滌固定后過夜。PBS沖洗1次，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升106個細(xì)胞，加入含RNase(終濃度為0.25 mg/mL)的碘化丙啶(PI)染色液，室溫避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測，Cell Quest分析細(xì)胞凋亡情況，低于G0/G1期DNA含量的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，其所占細(xì)胞總數(shù)的比例即為凋亡率，每組重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后HIF-2α mRNA的表達(dá) RT-PCR檢測結(jié)果顯示：HIF-2α mRNA的相對表達(dá)量在MCF-7/HIF-2α siRNA組為0.321±0.036，與MCF-7組(0.724±0.034)和MCF-7/無義siRNA組(0.686±0.039)相比顯著降低(P<0.05)。對照組和MCF-7/無義siRNA組相比差異無顯著性(P>0.05，圖1、2)。

圖1 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后HIF-2α mRNA的表達(dá)

1.MCF-7/HIF-2α siRNA組；2.MCF-7組；3.MCF-7/無義siRNA組；*P<0.05

圖2 轉(zhuǎn)染24 h后各組細(xì)胞中HIF-2α mRNA的相對表達(dá)量

與其它各組相比，*P<0.05

2.2 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后HIF-2α蛋白的表達(dá) 免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，在3組乳腺癌細(xì)胞中HIF-2α蛋白的表達(dá)主要定位于胞質(zhì)(圖3)。采用HPIAS-1000高清晰圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行分析，HIF-2α蛋白的OD值在MCF-7/HIF-2α siRNA組明顯低于轉(zhuǎn)空質(zhì)粒組MCF-7組和MCF-7/無義siRNA組細(xì)胞(P<0.05)，MCF-7/無義siRNA組和MCF-7組細(xì)胞之間未見明顯差異(P>0.05，表1)。

表1 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中HIF-2α蛋白的表達(dá)

MCF-7/HIF-2α siRNA與MCF-7組、MCF-7/無義siRNA組比較，*P<0.05

2.3 細(xì)胞化療敏感性檢測 5-氟尿嘧啶、阿霉素和紫杉醇作用24 h后MCF-7/HIF-2α siRNA組、MCF-7組和MCF-7/無義siRNA組細(xì)胞抑制率詳見表2。3種化療藥物處理后MCF-7/HIF-2α siRNA組細(xì)胞增殖抑制率均明顯高于MCF-7組和MCF-7/無義siRNA組相應(yīng)濃度時的細(xì)胞增殖抑制率(P<0.05)；MCF-7組和MCF-7/無義siRNA組的細(xì)胞增殖抑制率，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

ABC圖3 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后HIF?2α蛋白的表達(dá)，SP法：A．MCF?7組；B．MCF?7/無義siR?NA組；C．MCF?7/HIF?2αsiR?NA組

表2 化療藥物處理24 h后各組細(xì)胞的細(xì)胞抑制率(%)

MCF-7/HIF-2α siRNA組與MCF-7組、MCF-7/無義siRNA組比較，*P<0.05

2.4 細(xì)胞凋亡率檢測 5-氟尿嘧啶、阿霉素和紫杉醇作用24 h后MCF-7/HIF-2α siRNA組、MCF-7組和MCF-7/無義siRNA組細(xì)胞凋亡率詳見表3。3種化療藥物處理后MCF-7/HIF-2α siRNA組細(xì)胞的凋亡率均明顯高于MCF-7組和MCF-7/無義siRNA組相應(yīng)濃度時的細(xì)胞凋亡率(P<0.05)。MCF-7組和MCF-7/無義siRNA組間細(xì)胞凋亡率，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖4)。

表3 化療藥物處理24 h后各組細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率(%)

MCF-7/HIF-2α siRNA組與MCF-7組、MCF-7/無義siRNA組比較，*P<0.05

圖4 化療藥物處理24 h后各組細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率

與其它各組相比，*P<0.05

3 討論

局部組織微環(huán)境的缺氧是實(shí)體腫瘤在生長過程中的常見現(xiàn)象，多由于組織增長過快和血供不足造成。介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對缺氧耐受最重要的轉(zhuǎn)錄因子是缺氧誘導(dǎo)因子[4]，研究表明缺氧誘導(dǎo)因子調(diào)節(jié)的下游靶基因含有缺氧反應(yīng)元件(hypoxic responsiveelement, HRE)，缺氧誘導(dǎo)因子可與其結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[5]，對腫瘤新生血管的形成、維持腫瘤細(xì)胞的能量代謝、促進(jìn)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移、化療耐藥等方面起重要作用[6]。臨床上亦有許多證據(jù)表明，腫瘤細(xì)胞對缺氧的耐受可使腫瘤對放、化療的抵抗性增加，缺氧存在可能是腫瘤細(xì)胞的一些耐藥基因和蛋白的表達(dá)或活性增加的主要原因；該過程中缺氧誘導(dǎo)因子起關(guān)鍵性作用[7]。HIF是由HIF-α和HIF-β亞基組成的異源二聚體，目前發(fā)現(xiàn)的哺乳動物中有3種HIF-α亞基：HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α，它們均可與HIF-β亞單位結(jié)合[8]，既往對HIF-1α與實(shí)體腫瘤關(guān)系的相關(guān)報(bào)道較多，而對HIF-2α與腫瘤的關(guān)系卻較少提及。課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，缺氧可通過核轉(zhuǎn)錄因子HIF-2α上調(diào)乳腺癌細(xì)胞內(nèi)MDR1的表達(dá)，從而使乳腺癌細(xì)胞獲得多藥耐藥性。本實(shí)驗(yàn)主要通過干擾HIF-2α基因的表達(dá)，對乳腺癌細(xì)胞化療敏感性的改變進(jìn)行觀察，為逆轉(zhuǎn)乳腺癌多藥耐藥提供新思路。

本實(shí)驗(yàn)利用siRNA干擾MCF-7細(xì)胞中HIF-2α的表達(dá)，siRNA通常為21個核苷酸的雙股RNA(dsRNA)，采用不同轉(zhuǎn)染技術(shù)可將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，并專一性敲弱特定基因的表達(dá)。siRNA已成為分析基因功能與藥物目標(biāo)的一項(xiàng)重要工具[9]。我們利用Lipofectamine 2000介導(dǎo)將針對HIF-2α的siRNA片段轉(zhuǎn)染到乳腺癌細(xì)胞中，特異性降解靶基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后HIF-2α mRNA的水平明顯降低，蛋白表達(dá)也明顯降低。因此，MCF-7/HIF-2α siRNA有效沉默HIF-2α的表達(dá)。HIF-2α中VHL泛素-蛋白酶復(fù)合體與之結(jié)合的位點(diǎn)被CoCl2占據(jù)，從而競爭抑制HIF-2α與泛素-蛋白酶復(fù)合體的結(jié)合，使HIF-2α降解減少，增加細(xì)胞內(nèi)HIF-2α蛋白的表達(dá)，CoCl2被廣泛用來模擬缺氧環(huán)境[10]。本組前期課題組已經(jīng)驗(yàn)證CoCl2(終濃度100 μmol/L)模擬缺氧環(huán)境培養(yǎng)各組細(xì)胞，并分別加入5-氟尿嘧啶(終濃度10 μg /mL)、阿霉素(終濃度10 μg /mL)和紫杉醇(終濃度10 μg /mL)作用細(xì)胞。MTT 檢測結(jié)果表明，3種化療藥物處理MCF-7/HIF-2α siRNA組細(xì)胞的增殖抑制率均明顯增高。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果也表明，3種化療藥物處理后MCF-7/HIF-2α siRNA組細(xì)胞的凋亡率均顯著增加。與前期HIF-1α的報(bào)道一致，Gao等[11]發(fā)現(xiàn)吉西他濱和5-氟尿嘧啶能夠抑制膽囊癌細(xì)胞的增殖和增強(qiáng)其化療敏感性。因此，我們認(rèn)為應(yīng)用HIF-2α siRNA體外轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，抑制乳腺癌細(xì)胞中HIF-2α蛋白的表達(dá)，提高化療藥物對癌細(xì)胞的殺傷力。

綜上所述，乳腺癌是目前女性常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年上升，已嚴(yán)重威脅婦女健康。乳腺癌患者的主要治療手段仍是手術(shù)、放療、化療和內(nèi)分泌治療，其中化療是緩解和治療乳腺癌的重要輔助性治療，眾所周知，乳腺癌化療耐藥是影響患者治療效果的重要因素，本組通過干擾乳腺癌中HIF-2α蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的化療敏感性，為臨床逆轉(zhuǎn)乳腺癌的多藥耐藥、改善患者預(yù)后提供新思路。

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Effect of silencing of HIF-2α gene on chemosensitivity of human breast carcinoma cells

LI Na, HE Guo-yang, LI Yong-zhen, WANG Zhi-hui

(DepartmentofPathology,XinxiangMedicalUniversityofHenanProvince,Xinxiang453003,China)

Purpose To investigate the effects of hypoxia inducible factor-2α (HIF-2α) siRNA on proliferation and chemotherapy sensitivity of breast carcinoma MCF-7. Methods RNA interference was used to silence the expression of HIF-2α in MCF-7 cells. The changes of HIF-2α gene expression were detected by immunocytochemistry and RT-PCR. Under hypoxia environment simulated by CoCl2, MTT assay and flow cytometry (FCM) were used to measure cell growth inhibition rate and cell apoptosis of MCF-7 cells under different dosages of chemotherapeutic agents (5-fluorouracil, adriamycin, and paclitaxel). Results Expression of HIF-2α in MCF-7 were down-regulated by HIF-2α siRNA (P<0.05). The proliferation inhibition and apoptosis rates were evidently increased after transfection with HIF-2α siRNA (P<0.05), chemotherapy drug sensitivity was enhanced. Conclusion HIF-2α siRNA can induce the apoptosis and inhibit the proliferation and enhance the sensitivity of breast carcinoma MCF-7 cell line to chemotherapeutic agents. Blocking HIF-2α maybe a very promising strategy for breast carcinoma gene therapy in combination with chemotherapy.

breast neoplasm； hypoxia inducible factor-2 alpha； RNA interference； chemosensitivity

河南省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(162300410220)、河南省衛(wèi)生廳科技攻關(guān)資助(201403133)、河南省教育廳高等學(xué)校重點(diǎn)科研(16A310002)

河南省新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，新鄉(xiāng) 453003

李 娜，女，博士，副教授。Tel:(0373)3029123，E-mail: lina@xxmu.edu.cn

時間：2017-5-17 23:53 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170517.2352.007.html

R 737.9

A

1001-7399(2017)05-0501-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.007

接受日期：2017-03-02