張 帆，張 偉，焦南林，劉 霞，曹 明，徐國祥，張偉璇

三陰型乳腺癌中CD47的表達及其臨床意義

張 帆1，張 偉1，焦南林1，劉 霞1，曹 明2，徐國祥1，張偉璇1

目的 探討CD47在三陰型乳腺癌(triple negative breast carcinoma, TNBC)中的表達及其與臨床病理特征的相關(guān)性。方法 運用組織芯片結(jié)合免疫組化Bond Polymer Refine Detection法對185例TNBC及35例非三陰型乳腺癌(non-triple negative breast carcinoma, NTNBC)進行染色，觀察CD47在TNBC中的表達，分析其與各臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 TNBC腫瘤細胞CD47的表達均高于NTNBC，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。TNBC腫瘤細胞CD47陽性率為52.3%，與臨床分期(P<0.05)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移/遠處轉(zhuǎn)移(P<0.05)和脈管侵犯(P<0.05)密切相關(guān)。結(jié)論 CD47表達與TNBC的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移/遠處轉(zhuǎn)移和脈管侵犯有相關(guān)性，可以作為預(yù)后評判指標(biāo)，也是潛在的免疫治療靶點。

乳腺腫瘤；三陰型乳腺癌；CD47；免疫組織化學(xué)；靶向治療

三陰型乳腺癌(triple negative breast carcinoma, TNBC)包括少數(shù)非特殊類型浸潤性乳腺癌(invasive breast carcinoma of no special type)和基底細胞樣乳腺癌(basal-like breast carcinoma, BLBC)，其不表達ER、PR、人類上皮生長因子受體(HER-2/C-erbB-2)[1]。TNBC在治療上，對激素治療(三苯氧胺等)不敏感，且無法進行靶向(赫賽汀)治療，傳統(tǒng)的細胞毒性化療方法對其療效不佳。CD47主要表達于癌細胞表面，通常被認(rèn)為是癌細胞免于宿主免疫系統(tǒng)攻擊的保護性受體，定位于細胞膜或細胞質(zhì)。CD47是一類“don't eat me”信號，它通過與巨噬細胞表面的SIRPα相互結(jié)合抑制巨噬細胞的吞噬功能。本文旨在觀察CD47在TNBC中的表達及其與臨床病理特征的關(guān)系，并探討是否可以作為潛在的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2007年1月～2016年1月皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院臨床病理科診斷為乳腺癌標(biāo)本3 689例，其中193例(193/3 689，5.23%)TNBC，去除臨床病理資料不完整者8例，合計185例TNBC，不包含特殊類型的乳腺癌，如腺樣囊性癌、化生性癌等。臨床資料包括患者年齡、腫瘤直徑、有無脈管侵犯、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移/遠處轉(zhuǎn)移情況(鑒于遠處轉(zhuǎn)移病例較少，故與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移合并作為單一因素)等。隨機選擇同期非三陰型乳腺癌(non-triple negative breast carcinoma, NTNBC)標(biāo)本35例作為對照。TNBC患者年齡25～86歲，中位年齡50歲。其中左側(cè)乳腺102例，右側(cè)乳腺86例，雙側(cè)乳腺5例。

1.2 方法 按照WHO(2012)乳腺腫瘤分類診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]以及Perou等[2]分子分型依據(jù)、2010年美國臨床腫瘤學(xué)會(ASCO)和美國病理學(xué)家協(xié)會(CAP)雌孕激素受體判讀標(biāo)準(zhǔn)[3]以及2013年ASCO/CAP乳腺癌人類上皮生長因子受體判讀推薦指南[4]，由兩位乳腺病理?？漆t(yī)師對185例TNBC進行復(fù)審。

1.2.1 組織芯片制作 選取目標(biāo)組織石蠟標(biāo)本，采用取Quick-Ray組織微陣列系統(tǒng)，顯微鏡下劃定所需要區(qū)域，37～40 ℃孵育供體蠟塊15～20 min，從供體蠟塊中用針(孔徑1.6 mm)抽取目標(biāo)組織，緩慢轉(zhuǎn)移至受體蠟塊(事先在蠟塊一角做標(biāo)記)的相應(yīng)孔內(nèi)，保持深度為4.0 mm，并做好資料記錄，蠟塊切面朝下置于包埋盒中，70 ℃烤箱30～60 min，組織芯片完全透明后包埋，置于-20 ℃環(huán)境下硬化后備用。組織芯片的每孔直徑為1.6 mm，每個病例采用2孔用于評價。

1.2.2 免疫組化 用正常皮膚組織內(nèi)的皮脂腺作為陽性對照，而皮脂腺周圍上皮組織和間質(zhì)成分作為陰性對照[5]。兔抗人單克隆抗體CD47(IgG兔抗人多克隆抗體，稀釋濃度1 ∶500)購自北京中杉金橋公司，使用Leica BOND-MAX全自動免疫組化儀采用免疫組化Bond Polymer Refine Detection法進行檢測。

1.3 結(jié)果判斷 所有免疫組化片均由兩位乳腺病理?？漆t(yī)師采用雙盲法單獨判讀，分別評估TNBC和NTNBC中CD47的表達。僅評判浸潤性癌成分，因考慮腫瘤的異質(zhì)性現(xiàn)象，以整張切片表達較強(>10%)的部位來評價，對表達較強的區(qū)域進行半定量判讀[6]。(1)根據(jù)染色比例評分：<5%為0分，5%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，≥75%為4分。(2)根據(jù)染色強度評分：無陽性著色為0分,弱陽性為1分,中等陽性為2分,強陽性為3分。兩項結(jié)果相乘總分≥5分為高表達，即為陽性；≤4分為低表達，即為陰性。計算高表達病例所占的百分比。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，CD47在TNBC和NTNBC中的表達比較，以及各臨床病理特征組間表達的差異性比較均應(yīng)用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，所有P值采用雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)特征 TNBC多由實性巢狀、片狀的癌細胞組成(圖1)，無或較少出現(xiàn)管狀分化，腫瘤呈推進性生長方式；腫瘤周邊或癌細胞之間有不同程度的淋巴細胞浸潤；部分腫瘤呈非典型髓樣癌的特征；可出現(xiàn)地圖樣壞死(圖2)；部分癌細胞中央出現(xiàn)無細胞性纖維化區(qū)；癌細胞胞質(zhì)欠豐富，核/質(zhì)比高，胞核呈卵圓形，呈泡狀核樣，核分裂象多見，可見核仁。

2.2 CD47在TNBC和NTNBC中的表達 CD47在TNBC中胞膜呈棕色顆粒分布(圖3)或胞膜和胞質(zhì)有棕色顆粒分布(圖4)，而CD47在NTNBC中表達的細胞數(shù)明顯較少(圖5)。CD47在TNBC和NTNBC中染色比例和染色強度詳見表1，CD47在TNBC中的陽性率明顯高于NTNBC中的表達(P<0.01)。

2.3 CD47表達與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性 CD47在臨床分期為Ⅲ+Ⅳ期病例中的陽性率明顯高于Ⅰ+Ⅱ期(P<0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移/遠處轉(zhuǎn)移者的陽性率也明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移/近處轉(zhuǎn)移者(P<0.01)；有脈管侵犯者的陽性率亦高于無脈管侵犯者(P<0.01)；與患者年齡、腫瘤大小無相關(guān)性(P>0.05，表2)。

3 討論

CD47是一種細胞膜表面分子，屬于免疫球蛋白超家族成員之一；其功能是通過阻滯巨噬細胞表面信號調(diào)節(jié)蛋白α(signal regulatory protein-α, SIRPα)的表達來抑制吞噬作用[7]。CD47充當(dāng)“don’t eat me”的自身信號和標(biāo)記，一旦CD47缺失，易引起自體吞噬系統(tǒng)對老化和損傷的細胞進行吞噬[7]。雖然在正常人體細胞中始終存在低表達，研究發(fā)現(xiàn)CD47在許多人類腫瘤中過表達，包括白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤和多種實體瘤，使其成功逃避自身免疫系統(tǒng)的監(jiān)視[7]。最近有數(shù)據(jù)顯示，腫瘤通過抗吞噬信號的表達，包括CD47逃避巨噬細胞的吞噬[8]。Akel等[9]分別對日光性皮炎(actinic keratoses, AK)、原位鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma in situ, SCCIS)、鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma, SCC)以及角化棘皮瘤(keratoacanthoma, KA)進行CD47免疫組化標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，在CD47表達的染色比例和染色強度方面，SCC與AK比較、SCC與SCCIS比較、SCCIS與AK比較均明顯升高。在頭頸部SCC中CD47的高表達最初發(fā)現(xiàn)與自然殺傷細胞數(shù)量減少有關(guān)[10]。文獻報道[11-12]CD47在口咽部和食管SCC中表達升高。

表1 CD47在TNBC和NTNBC中染色比例、強度及高陽性率

表2 CD47表達與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性

①②③④⑤圖1 TNBC多由實性巢狀、片狀的癌細胞組成 圖2 癌灶中央見地圖樣壞死區(qū)圖3 TNBC中CD47在細胞膜著色呈棕色顆粒，BondPolymerRefineDetection法 圖4 TNBC中CD47在細胞膜/胞質(zhì)著色呈棕色顆粒，BondPolymerRefineDetection法圖5 NTNBC中CD47在少數(shù)細胞胞膜/胞質(zhì)著色呈棕色顆粒，BondPolymerRefineDe?tection法

本組發(fā)現(xiàn)TNBC中CD47的陽性率與患者年齡、腫塊大小無相關(guān)性(P>0.05)；與臨床分期(P<0.05)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移/遠處轉(zhuǎn)移(P<0.01)和脈管侵犯(P<0.01)有明顯相關(guān)性，提示CD47的高表達與臨床預(yù)后有關(guān)聯(lián)，可以作為預(yù)測TNBC的預(yù)后指標(biāo)。CD47在腫瘤進展(tumor progress)過程中的主要作用是維持和促進腫瘤細胞的生長和侵襲，在多種類型的腫瘤中，如粒細胞性白血病[13]、非霍奇金淋巴瘤[14]、頭頸部SCC[10]、膀胱癌[15]和乳腺癌[16]，CD47的高表達與這些腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)。可能的原因是在腫瘤細胞表面高表達CD47，保護這些細胞免受吞噬。Kingsley等[17]發(fā)現(xiàn)CD47與SIRPα的相互作用，與巨噬細胞融合有關(guān)，這是形成破骨細胞的重要步驟。破骨細胞的激活，可以促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移至骨，這方面還需進一步分析。

CD47參與癌癥的復(fù)發(fā)[18]。癌干細胞是癌細胞中具有干細胞功能的一群細胞，現(xiàn)已在多種惡性腫瘤中鑒定出干細胞，包括急性粒細胞性白血病、前列腺癌、Ewing肉瘤、腦腫瘤、結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌、肝癌和間葉腫瘤。傳統(tǒng)的腫瘤治療方法(放、化療)能夠抑制腫瘤生長，而無法消滅干細胞，進而干細胞重新生長形成腫塊，以至于腫瘤復(fù)發(fā)。Majeti等[19]發(fā)現(xiàn)CD47在急性粒細胞性白血病干細胞中高表達，而CD47的水平也是鑒定白血病細胞的標(biāo)志物。在細胞培養(yǎng)的試管中，抗CD47單克隆抗體能夠提升對白血病干細胞的吞噬作用，這些結(jié)果均預(yù)示CD47能夠使干細胞成功逃避免疫系統(tǒng)的殲滅，而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。在TNBC中，有部分病例為基底細胞樣表型，表達乳腺干細胞抗體，如CK5/6、EGFR、SMA、p63等，這可能是TNBC易于復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移的原因之一，但還需進一步分析。

越來越多的證據(jù)顯示單克隆抗體對于腫瘤治療是一種有效且致命的武器，抗CD47抗體已經(jīng)在惡性腫瘤治療中獲得良好的療效，如其可以提升吞噬細胞對急性粒細胞性白血病[18]和膀胱癌[15]中癌干細胞的吞噬能力。聯(lián)合抗CD47抗體和利妥昔單抗能夠促進吞噬作用并殺滅非霍奇金淋巴瘤細胞[14]。Chao等[7]提出4種可能途徑：(1)抗CD47抗體通過阻斷CD47與SIRPα的相互作用，進而促使對腫瘤細胞的吞噬；(2)抗CD47抗體通過Fc-依賴機制消滅癌細胞，如抗體依賴性細胞毒和補體依賴性細胞毒；(3)直接誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡；(4)抗CD47抗體通過激活適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)，促進對腫瘤細胞的吞噬。Zhao等[20]在非小細胞肺癌細胞系中運用功能獲得和功能敲除的方法，發(fā)現(xiàn)siRNA下調(diào)CD47功能可以抑制癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。同時被轉(zhuǎn)染過表達的CD47能促進癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移，CD47特異性siRNA能顯著降低腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。Casey等[21]發(fā)現(xiàn)MYC腫瘤基因調(diào)節(jié)腫瘤細胞表面兩種免疫節(jié)點蛋白，包括CD47和程序性死亡配體-1(programmed death ligand-1, PD-L1)。通過對老鼠腫瘤和人類腫瘤細胞MYC基因的抑制，可以降低CD47和PD-L1 mRNA和蛋白的水平，MYC基因是CD47和PD-LI基因的激活劑。老鼠腫瘤細胞中MYC基因失活可下調(diào)CD47和PD-L1的表達，從而增強抗腫瘤免疫反應(yīng)，抑制腫瘤的繼續(xù)生長，進一步提示CD47對腫瘤的復(fù)發(fā)起一定作用。本組發(fā)現(xiàn)在TNBC中CD47的染色比例和染色強度均明顯高于NTNBC中的表達(P<0.01)，可能說明TNBC較NTNBC更多地獲得CD47表面分子的保護，從而逃避機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，為其能夠躲避自身殺傷細胞的殲滅提供保護，進而在臨床上展示較差的預(yù)后，這一結(jié)論仍然有待進一步的基礎(chǔ)研究證實。那么，通過抑制CD47的表達，應(yīng)可以除去腫瘤細胞的“don’t eat me”的作用 ，讓細胞毒性細胞能夠識別，從而達到殺傷腫瘤細胞的目的，為進一步的靶向治療打下基礎(chǔ)。本組缺少對所有病例的隨訪資料，使CD47的表達在實際臨床應(yīng)用中缺乏強有力的說服力，有待進一步的隨訪。

綜上所述，CD47在TNBC的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演重要角色，可以作為臨床預(yù)后判斷的重要指標(biāo)，也可以作為治療TNBC的有效靶點。

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Expression and clinical significance of CD47 in triple negative breast carcinoma

ZHANG Fan1, ZHANG Wei1, JIAO Nan-lin1, LIU Xia1, CAO Ming2, XU Guo-xiang1, ZHANG Wei-xuan1

(1DepartmentofPathology,YijishanHospitalAffiliatedtoWannanMedicalCollege,Wuhu241001,China;2DepartmentofPathology,WuhuFirstHospital,Wuhu241000,China)

Purpose To explore the expression and clinical significance of CD47 in triple negative breast carcinoma (TNBC), and to analyze the relationship between CD47 expression and clinicopathologic features. Methods Immunohistochemical of Bond Polymer Refine Detection staining was performed on tissue array. It contains 185 cases of TNBC and 35 cases of non triple negative breast carcinoma (NTNBC). Then we observed the expression of CD47 in TNBC, and analyzed the relationship between the expression of CD47 and various clinical pathological characteristics. Results The expression of CD47 in tumor cells of TNBC was higher than that in NTNBC, and the difference was statistically significant (P<0.05). The CD47 expression rate in TNBC tumors was 52.3%. It was closely related to clinical stage (P<0.05), lymph node metastasis and distant metastasis (P<0.05) and vascular invasion (P<0.05). Conclusion The expression of CD47 is correlated with the clinical stage, lymph node metastasis, distant metastasis and vascular invasion of TNBC. CD47 can be used as a prognostic indicator and a potential target for immune therapy.

breast neoplasm; triple negative breast carcinoma; CD47; immunohistochemistry; targeted therapy

1皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院臨床病理科,蕪湖 2410012蕪湖市第一人民醫(yī)院病理科 241000

張 帆，男，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師。Tel:(0553)5739789，E-mail: zhangfan401401@aliyun.com

時間：2017-5-17 23:53 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170517.2352.015.html

R 737.9

A

1001-7399(2017)05-0539-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.015

接受日期：2017-02-28