王 瀟 蘇 躍 李天佐 趙斌江

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院麻醉科, 北京 100038)

· 麻醉學(xué)與神經(jīng)科學(xué) ·

膽堿能抗炎通路對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的影響

王 瀟 蘇 躍 李天佐 趙斌江*

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院麻醉科, 北京 100038)

目的 本研究應(yīng)用不同的膽堿能受體干擾劑M1受體激動(dòng)劑McN-A-343(MA343)、M2受體拮抗劑美索曲明(methoctramine，MET)以及α7亞單位的N型受體激動(dòng)劑膽堿(choline, CHO)分別作用于膽堿能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway, CAP)，通過(guò)檢測(cè)不同部位腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α， TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)濃度，進(jìn)一步探討CAP對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的影響。方法 健康成年雄性SD大鼠25只，采用數(shù)字表法隨機(jī)分為5組(n=5)：假手術(shù)組(sham operation group, Sham)、腦缺血再灌注組(ischemia reperfusion group, I/R)、MET組、MA343組和CHO組。四血管結(jié)扎法(four-vessel occlusion，4-VO)建立全腦缺血再灌注損傷模型，電凝大鼠雙側(cè)椎動(dòng)脈(Sham組除外)，于缺血前15 min分別經(jīng)側(cè)腦室向MET組、MA343組及CHO組注射MET、MA343及CHO，Sham組及I/R組注射0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液10μL。除Sham組外，各組夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈20 min后再灌注。再灌注6 h后，斷頭處死動(dòng)物，采集標(biāo)本。放射免疫法(radio-immunoassay, RIA)檢測(cè)左側(cè)海馬、心、肝、肺、腎和血漿中TNF-α、IL-1β濃度。TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記技術(shù)染色(terminal deoxynucleotidyl-trallsferase meiated dUTP nick end labeling, TUNEL)檢測(cè)右側(cè)海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡數(shù)。結(jié)果 再灌注后，MET組和MA343組海馬、心、肝、腎組織勻漿及血漿TNF-α、IL-1β濃度顯著低于I/R組(P<0.05)。CHO組海馬TNF-α濃度較I/R組有所降低(P<0.05)，而心、肝、腎及血漿TNF-α、IL-1β濃度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。MET、MA343和CHO均未能降低肺組織TNF-α、IL-1β濃度。與I/R組相比，MET、MA343及CHO組海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)目減少(P<0.05)。結(jié)論 TNF-α、IL-1β的釋放是腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一，CAP對(duì)腦缺血再灌注引發(fā)的局部及全身炎性反應(yīng)均具有保護(hù)作用。其機(jī)制與MET、MA343和CHO抑制缺血再灌注后TNF-α、IL-1β的合成與釋放有關(guān)。

膽堿能抗炎通路；迷走神經(jīng)；腦缺血再灌注；腫瘤壞死因子-α；白介素-1β；美索曲明；McN-A-343；膽堿

與缺血再灌注有關(guān)的急性炎性反應(yīng)促進(jìn)了繼發(fā)性腦損害的發(fā)展[1]。在腦缺血過(guò)程中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)分泌的腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β (interleukin-1β，IL-1β)等構(gòu)成了缺血性損傷向炎性反應(yīng)性損傷轉(zhuǎn)變的基礎(chǔ)，隨后白細(xì)胞向缺血區(qū)聚集導(dǎo)致微血管再閉塞，引發(fā)“無(wú)復(fù)流”現(xiàn)象[2]。目前針對(duì)腦缺血再灌注損傷的治療主要為藥物性腦保護(hù)，其中許多藥物尚處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，臨床效果尚有待證實(shí)。

新近研究[2-6]顯示膽堿能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway，CAP)也許能為治療腦缺血再灌注的炎性反應(yīng)損傷提供新的思路。CAP是一條神經(jīng)-免疫調(diào)節(jié)通路，它通過(guò)迷走神經(jīng)及其遞質(zhì)乙酰膽堿與免疫系統(tǒng)相互作用，參與抗炎性反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)建立大鼠短暫性全腦缺血再灌注模型，探討CAP對(duì)大腦局部和繼發(fā)全身炎性反應(yīng)的影響，為腦缺血再灌注損傷提供新的治療方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠25只，清潔級(jí)，體質(zhì)量280～320 g。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，每籠5只，自由飲食，飲自來(lái)水，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，室溫18～22 ℃。動(dòng)物及飼料由北京結(jié)核病胸部腫瘤研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2006-0008。

1.2 動(dòng)物分組及給藥方法

SD大鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為5組：①假手術(shù)組(Sham組)；②腦缺血再灌注(ischemia reperfusion group, I/R組)；③美索曲明組(methoctramine，MET組)：注射劑量為500 ng/kg；④McN-A-343組(MA343組)：注射劑量為500 ng/kg；⑤膽堿組(choline, CHO組)：注射劑量為500 ng/kg。術(shù)前將藥物用0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液配制成10 μL溶液，Sham組及I/R組注射等劑量0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液。

1.3 四血管結(jié)扎法(four-vessel occlusion，4-VO)法全腦缺血再灌注損傷模型的制備及側(cè)腦室注藥

水合氯醛腹腔注射麻醉，將大鼠固定在立體定位儀上，直視下閉塞雙側(cè)椎動(dòng)脈。仰臥位固定，暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，置4-0號(hào)絲線備用。置籠喂養(yǎng)，自由飲食。假手術(shù)組僅暴露雙側(cè)頸椎翼小孔。

4 h后經(jīng)異氟烷麻醉，微量進(jìn)樣器自腦表面垂直進(jìn)針3.5 mm，回抽有清亮腦脊液后，將藥物3 min注射完畢。留針5 min。Sham組及I/R組注入10μL 0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液。手術(shù)過(guò)程及術(shù)后保持肛溫37 ℃。15 min后，清醒狀態(tài)下固定大鼠，提起分離的頸總動(dòng)脈，用無(wú)創(chuàng)性小動(dòng)脈夾夾閉，造成全腦缺血。缺血20 min，松開(kāi)動(dòng)脈夾實(shí)現(xiàn)再灌注，回籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水，再灌注6 h。Sham組僅暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不做夾閉手術(shù)。

模型成功的標(biāo)準(zhǔn)：大鼠在30～60 s內(nèi)昏迷，翻正反射消失，雙側(cè)瞳孔放大，雙眼底變白，痛反射消失，但角膜反射存在，能自主呼吸。

1.4 標(biāo)本提取

6 h后麻醉下斷頭取腦，冰盤取雙側(cè)海馬，迅速入液氮保存。取左肺下葉、心尖部、肝左葉下緣、左腎下緣組織標(biāo)本，冰冷0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液沖洗，-70 ℃保存。

左側(cè)海馬50 mg置于冰浴的50 mmol/L醋酸緩沖液(pH=4.75)勻漿器中，用2 mL無(wú)水乙醇洗勻漿器，靜置5 min，離心，收集上清液，再用75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇1 mL洗勻漿器連續(xù)2次，洗沉淀，混勻，離心后取上清-70 ℃保存，待測(cè)。心、肺、肝、腎組織的處理方法與上述相同。

右側(cè)海馬常規(guī)上行脫水、二甲苯固定后用石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚4 μm，每隔10張取1張，每個(gè)取4張。在60 ℃的溫水中充分展開(kāi)，玻片貼片，備用。

取1.0 mL血清，加入10 μL抑肽酶，搖勻，-20 ℃保存。

1.5 觀察指標(biāo)

放射免疫法測(cè)定組織 TNF-α、IL-1β的濃度；測(cè)定血清TNF-α、IL-1β的濃度；原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)(TUNEL法)。

1.6 圖像分析

采用Motic MC Camera 1.1軟件對(duì)切片進(jìn)行圖像分析。光學(xué)顯微鏡200高倍鏡視野下，對(duì)海馬區(qū)域中隨機(jī)取8個(gè)非重疊的視野，進(jìn)行觀察并對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，陽(yáng)性細(xì)胞鏡下呈棕黃色，圓形或橢圓形致密塊。計(jì)算凋亡細(xì)胞百分率[凋亡細(xì)胞百分率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/(陽(yáng)性細(xì)胞陰性細(xì)胞數(shù))×100%][4]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 組織和血漿中TNF-α濃度變化

I/R組海馬、心、肺、肝、腎組織勻漿和血漿中TNF-α濃度均顯著高于Sham組(腎勻漿P<0.05，海馬、心、肺、肝和血漿P<0.01)。MET組及MA343組海馬、心、肝、腎組織勻漿和血漿中TNF-α濃度均顯著低于I/R組(腎勻漿P<0.05，海馬、心、肝和血漿P<0.01)。CHO組與I/R組相比，除海馬勻漿中TNF-α的減少差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)外，其余各組織及血漿TNF-α變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與I/R組相比，MET組、MA343組及CHO組中肺組織勻漿中TNF-α的濃度減少差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1，圖1)。

在I/R組中，與海馬相比，心、肺、肝、腎組織勻漿及血漿TNF-α濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，各組織間及血漿之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其TNF-α濃度高低依次為海馬>血漿>肺>肝>心>腎(表1)。

表1 左海馬、心、肺、肝、腎組織勻漿和血漿中TNF-α濃度變化Tab.1 Left hippocampus, heart, lungs, liver, kidney tissue homogenate and serum TNF-α content changes (n=5)

*P<0.05，**P<0.01vsI/R group，##P<0.01vshippocampus; TNF-α: tumor necrosis factor-α; Sham: sham operation group; I/R:ischemia reperfusion group; MET: methoctramine; MA343: McN-A-343; CHO: choline.

2.2 組織和血漿中IL-1β濃度變化

I/R組海馬、心、肺、肝、腎組織勻漿和血漿中IL-1β濃度均顯著高于Sham組(海馬、心、肺、肝、腎勻漿和血漿P均<0.01)。MET組及MA343組海馬、心、肝、腎組織勻漿和血漿中IL-1β濃度均顯著低于I/R組(海馬、心、肺、肝、腎勻漿和血漿P均<0.01)。CHO組與/IR組相比，除海馬勻漿中IL-1β的減少具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)外，其余各組織及血漿IL-1β變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與I/R組相比，MET組、MA343組及CHO組中肺組織勻漿中IL-1β濃度減少，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

在I/R組中，與海馬相比，心、肺、肝、腎組織勻漿及血漿IL-1β濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，各組織間及血漿之間的差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其IL-1β濃度高低依次為海馬>血漿>肺>肝>心>腎(表2)。

表2 左海馬、心、肺、肝、腎組織勻漿和血漿中IL-1β濃度變化

GroupHippocampusHeartLiverLungsKidneyBloodSham0.478±0.018**0.097±0.004**0.104±0.001**0.249±0.009**0.042±0.002*0.422±0.006**I/R1.262±0.0060.312±0.103##0.354±0.012##0.495±0.002##0.074±0.001##1.217±0.002##MET0.878±0.128**0.232±0.003**0.135±0.003**0.382±0.0130.064±0.001**0.784±0.008**MA3430.986±0.005**0.285±0.007**0.137±0.002**0.425±0.0030.063±0.003**0.874±0.002**CHO0.778±0.007**0.308±0.0040.363±0.0130.488±0.0030.073±0.0031.213±0.002

*P<0.05，**P<0.01vsI/R group；##P<0.01vshippocampus; IL-1β: interleukin-1β; Sham: sham operation group; I/R:ischemia reperfusion group; MET: methoctramine;MA343: McN-A-343; CHO: choline.

2.3 TUNEL法檢測(cè)大鼠海馬凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率

再灌注6 h后，肉眼觀察Sham組大腦外觀左右兩側(cè)對(duì)稱，背側(cè)表面血管呈淡紅色，左右分布大體均一。I/R組可見(jiàn)雙側(cè)腦組織腫脹明顯，腦組織發(fā)白。MET組、MCA343組及CHO組腦組織腫脹程度較I/R組有所減輕。

用TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)凋亡細(xì)胞為棕黃色的圓形或卵圓形致密塊狀(圖1)。Sham組大鼠海馬CA1區(qū)組織切片中可見(jiàn)極凋亡細(xì)胞(圖1A)，I/R組大鼠海馬組織切片中凋亡細(xì)胞散布于整個(gè)海馬CA1區(qū)內(nèi)(圖1B)，而MET組、MCA343組及CHO組大鼠海馬CA1區(qū)組織切片中凋亡細(xì)胞數(shù)明顯少于I/R組(均P<0.01)(表3，圖1C、D、E)。

圖1 大鼠海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞Fig.1 Apoptotic cells of rat hippocampal CA1 area (TUNEL,200×)

A：sham group； B：I/R group； C：MET group； D：MA343 group； E：CHO group；Sham: sham operation group; I/R:ischemia reperfusion group; MET: methoctramine;MA343: McN-A-343; CHO: choline; TNF-α:tumor necrosis factor-α; IL-1β:interleukin-1β.

表3 各組大鼠海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率比較Tab.3 Positive rate of each rat hippocampal CA1 area apoptotic cells (n=5)

**P<0.01vsI/R group; Sham: sham operation group; I/R:ischemia reperfusion group; MET: methoctramine; MA343: McN-A-343; CHO: choline.

2.4 大鼠海馬凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率與海馬組織勻漿TNF-α、IL-1β濃度的關(guān)系

大鼠海馬CA1區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞率的變化趨勢(shì)與海馬組織勻漿TNF-α、IL-1β濃度的變化相一致(表1、2，圖2)。

圖2 大鼠海馬凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率與海馬組織 勻漿TNF-α、IL-1β濃度的關(guān)系Fig.2 Relationship of rat hippocampal apoptotic cells rate positive with hippocampal tissue homogenate of TNF-α and IL-1β content

Sham: sham operation group; I/R:ischemia reperfusion group; MET: methoctramine;MA343: McN-A-343; CHO: choline;TNF-α:tumor necrosis factor-α; IL-1β:interleukin-1β.

3 討論

3.1 膽堿能抗炎通路對(duì)腦缺血再灌注損傷的影響

Borovikova等[7]研究發(fā)現(xiàn)，致病菌入侵時(shí)，體內(nèi)的迷走神經(jīng)及其遞質(zhì)乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)與免疫系統(tǒng)相互作用，參與抗炎過(guò)程，并將之命名為“膽堿能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway，CAP)”。它可以被看作是一種神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，當(dāng)中樞收到機(jī)體受某種免疫刺激的信息后，就將這種信號(hào)投射到各迷走神經(jīng)核團(tuán)，激活傳出迷走神經(jīng)纖維，引起外周神經(jīng)末梢釋放ACh，與免疫細(xì)胞上具有α7亞單位的N型ACh受體結(jié)合，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑抑制促炎因子的釋放，調(diào)控炎性反應(yīng)[3,8]。

傳出迷走神經(jīng)能夠抑制外周炎性反應(yīng)因子的產(chǎn)生，提示迷走神經(jīng)與炎性反應(yīng)細(xì)胞間存在信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。在外周，ACh主要由交感神經(jīng)的節(jié)前纖維、副交感神經(jīng)節(jié)前和節(jié)后纖維釋放，通過(guò)毒蕈堿型受體(M受體)和煙堿型受體(N受體) 發(fā)揮作用。外周血單核細(xì)胞表面存在M受體和N受體，兩者均能與ACh結(jié)合，抑制TNF-α及IL-1β在體內(nèi)的合成，但以N受體為主。

實(shí)驗(yàn)[9]證明，CAP可以抗炎。直接刺激迷走神經(jīng)可降低內(nèi)毒素休克大鼠血TNF-α濃度，減緩內(nèi)毒素引起的低血壓性休克的發(fā)生時(shí)相。內(nèi)毒素血癥時(shí)頸迷走神經(jīng)放電頻率明顯升高。反之，切斷迷走神經(jīng)則使動(dòng)物對(duì)內(nèi)毒素的致死性效應(yīng)更加敏感。Bernik等[10]也觀察到電刺激迷走神經(jīng)能減少缺血再灌注損傷所導(dǎo)致的全血TNF-α濃度升高，抑制心臟和肝臟TNF-α生成，緩解缺血再灌注引起的休克。CAP還可以抑制腹腔動(dòng)脈缺血再灌注引發(fā)的NF-B活化和TNF-α表達(dá)增加。

以往的研究[8-10]CAP主要通過(guò)切斷迷走神經(jīng)來(lái)破壞CAP，觀察炎性反應(yīng)是否有擴(kuò)大，或通過(guò)電刺激迷走神經(jīng)及藥物來(lái)達(dá)到刺激CAP的目的，驗(yàn)證炎性反應(yīng)是否減輕。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用M1受體激動(dòng)劑McN-A-343、M2受體拮抗劑美索曲明(methoctramine)以及N型乙酰膽堿受體α7亞單位激動(dòng)劑膽堿，這3種藥物均能直接或間接提高Ach的濃度，相當(dāng)于刺激CAP，觀察藥物刺激CAP后，是否能降低腦組織及全身TNF-α及IL-1β濃度。

膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)和固有的免疫系統(tǒng)之間吻合的分子，是一種對(duì)α-銀環(huán)蛇毒敏感的巨噬細(xì)胞煙堿樣乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor α7 subunit，α7 nAChR)。Shytle等[11]發(fā)現(xiàn)腦單核巨噬細(xì)胞——小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞上含有α7 nAChR，推測(cè)中樞也同外周一樣，存在CAP。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用了α7 nAChR激動(dòng)劑膽堿。膽堿是ACh被膽堿酯酶水解后的產(chǎn)物，可穿過(guò)血腦脊液屏障。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與I/R組相比，膽堿顯著降低了左海馬組織勻漿的TNF-α及IL-1β濃度(P<0.01)，抑制海馬TNF-α及IL-1β濃度的機(jī)制可能是膽堿直接與海馬小膠質(zhì)細(xì)胞上的α7 nAChR結(jié)合，與Shytle等[11]的推測(cè)相符合。而對(duì)血液、心、肝、肺、腎組織中的TNF-α及IL-1β含量影響不大。其原因可能包括：(1)膽堿半衰期過(guò)短，給藥方式或給藥時(shí)機(jī)的保護(hù)作用有限；(2)N型α7受體對(duì)于膽堿的失敏時(shí)間過(guò)短；(3)缺血再灌注損傷過(guò)于嚴(yán)重，對(duì)保護(hù)措施不敏感。是否其他方式或時(shí)機(jī)及更高濃度的膽堿是否會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)的保護(hù)效應(yīng)仍有待于進(jìn)一步探討。

中樞和外周的毒蕈堿受體共有5種亞型(M1～M5)，腦組織中廣泛分布著M1～M4亞型。M2受體主要分布于心臟、腦和平滑肌。自主神經(jīng)元突觸前膜上分布著M2受體，美索曲明是M2受體激動(dòng)劑。激動(dòng)M2受體抑制ACh的釋放，而其拮抗劑美索曲明可抵消其負(fù)性調(diào)節(jié)，間接提高了ACh的濃度。M1受體分布在自主神經(jīng)元突觸后膜，可正性調(diào)節(jié)ACh的釋放。McN-A-343可通過(guò)激動(dòng)M1受體而促進(jìn)ACh的釋放。應(yīng)用美索曲明和McN-A-343相當(dāng)于刺激迷走神經(jīng)，興奮CAP。

本研究結(jié)果證實(shí)，側(cè)腦室注射美索曲明及McN-A-343可降低腦缺血再灌注損傷中海馬組織勻漿TNF-α及IL-1β的濃度。海馬神經(jīng)元突觸前膜和突觸后膜上分布α7 nAChR，也存在M1、M2受體。在體外利用放射-配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)(radioligand-binding assay)中，α7 nAChR激動(dòng)劑CNI-1493與M1受體高度特異性結(jié)合[12]。說(shuō)明M1受體與N型乙酰膽堿受體α7亞單位復(fù)合物存在相互作用，中樞毒蕈堿受體(尤其M1受體)的活化，抑制TNF-α的釋放。在本實(shí)驗(yàn)中，MET組與MCA343組相比，其海馬TNF-α濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，美索曲明組海馬TNF-α濃度高于McN-A-343組，支持M1受體對(duì)TNF-α濃度降低起主要作用。膽堿降低TNF-α的作用與其聯(lián)合激動(dòng)M1受體有關(guān)，或McN-A-343抑制TNF-α濃度也離不開(kāi)N型乙酰膽堿受體α7亞單位的被激動(dòng)。但目前本實(shí)驗(yàn)尚無(wú)法驗(yàn)證M1受體與N受體的聯(lián)合作用。

本研究結(jié)果表明，膽堿、美索曲明和McN-A-343 3種藥物均降低了中樞反應(yīng)水平，說(shuō)明中樞CAP存在的可能性。而美索曲明和McN-A-343這兩種無(wú)法穿過(guò)血腦脊液屏障的大分子藥物，卻降低了外周組織和血漿炎性反應(yīng)水平。其原因不是藥物與迷走神經(jīng)傳出神經(jīng)核團(tuán)——迷走神經(jīng)運(yùn)動(dòng)背核(dorsal motor nucleus of the vagus nerve，DMN)的受體相結(jié)合，通過(guò)刺激傳出迷走神經(jīng)而達(dá)到刺激外周CAP的目的。因?yàn)镈MN上沒(méi)有毒蕈堿受體的結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)其降低外周性反應(yīng)的原因可能是：(1)中樞ACh直接釋放入血，與外周血中的單核細(xì)胞和組織器官中的巨噬細(xì)胞相結(jié)合，減輕性反應(yīng)？(2)可能與整合了交感神經(jīng)的有關(guān)？CAP與下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA)軸在中樞水平具有廣泛的聯(lián)系[3]。延髓的迷走神經(jīng)背側(cè)復(fù)合體集中了重要的中樞迷走神經(jīng)核團(tuán)。其中孤束核(nucleus tractus solitaries, NTS)是重要組成部分，它與自主神經(jīng)和內(nèi)分泌功能均有關(guān)。NTS能將機(jī)體受到炎性反應(yīng)侵害的信息傳遞到下丘腦核團(tuán)，特別是室旁核(paraventricular nucleus of the hypothalamus, PVN)。PVN是促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素合成和釋放的位置，可調(diào)節(jié)HPA軸的活性。這些機(jī)體結(jié)構(gòu)和功能聯(lián)系將神經(jīng)抗炎和內(nèi)分泌體液抗炎通路有效地結(jié)合起來(lái)。當(dāng)CAP興奮時(shí)，也同時(shí)激活了HPA軸，使其具有免疫抑制作用的終產(chǎn)物糖皮質(zhì)激素釋放增加，協(xié)同抗擊機(jī)體的過(guò)度炎性反應(yīng)。

3.2 腦缺血再灌注損傷后炎性細(xì)胞因子與細(xì)胞凋亡的關(guān)系

項(xiàng)潔等[12]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注腦損傷，凋亡神經(jīng)元主要分布在腦梗死周圍(即缺血半暗區(qū))，與TNF-α的表達(dá)區(qū)域一致。在時(shí)間進(jìn)程上，李力仙等[13]發(fā)現(xiàn)缺血側(cè)半球皮質(zhì)內(nèi)TNF-α濃度于腦缺血再灌注后6 h明顯升高。而細(xì)胞凋亡的高峰在再灌注24～48 h，這說(shuō)明從TNF-α的表達(dá)到細(xì)胞凋亡需要時(shí)間過(guò)程。而胡建鵬等[14]則發(fā)現(xiàn)TNF-α與c-myc基因的表達(dá)高峰相同，推測(cè)TNF-α與細(xì)胞凋亡相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)表明，MET組、MA343組及CHO組中大鼠海馬凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率的降低與TNF-α的降低趨勢(shì)一致，與上述結(jié)論相符合。IL-1β可通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度，繼而激活其靶酶，引起神經(jīng)元的損傷和凋亡[15]。本實(shí)驗(yàn)MET組、MA343組及CHO組中大鼠海馬凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率的降低與IL-1β的降低趨勢(shì)一致。

本實(shí)驗(yàn)中，TNF-α及IL-1β濃度的降低，與激活CAP有關(guān)。而凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率隨TNF-α及IL-1β含量的降低而降低，可以說(shuō)CAP間接抑制了凋亡，減輕了腦缺血再灌注損傷。

綜上所述，CAP對(duì)腦缺血再灌注引發(fā)的局部和全身的炎性反應(yīng)均具有保護(hù)作用，并間接降低了凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率。其機(jī)制與活化CAP，提高ACh的濃度，減少TNF-α及IL-1β產(chǎn)生有關(guān)。

[1] Pulsinelli W A, Brierley J B. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat[J]. Stroke, 1979, 10(3):267-272.

[2] Iadecola C, Alexander M. Cerebral ischemia and inflammation[J]. Curr Opin Neurol, 2001, 14(1)：89-94.

[3] Pavlov V A, Wang H, Czura C J, et al. The cholinergic anti-inflammatory pathway: a missing link in neuroimmunomodulation[J]. Mol Med, 2003, 9(5-8): 125-134.

[4] Tracey K J. The inflammatory reflex[J]. Nature, 2002, 420(6917): 853-859.

[5] Tracey K J, Czura C J, Ivanova S. Mind over immunity[J]. FASEB J, 2001, 15(9): 1575-1576.

[6] Czura C J, Friedman S G, Tracey K J. Neural inhibition of inflammation: the cholinergic anti-inflammatory pathway[J]. J Endotoxin Res, 2003, 9(6): 409-413.

[7] Borovikova L V, Ivanova S, Zhang M, et al. Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin[J]. Nature, 2000, 405(6785): 458-462.

[8] Czura C J, Friedman S G, Tracey K J. Neural inhibition of inflammation: the cholinergic anti-inflammatory pathway[J]. J Endotoxin Res,2003, 9(6):409-13.

[9] 黃健,楊志煥.內(nèi)毒素血癥大鼠頸迷走神經(jīng)傳出放電變化[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,27(9):850-852.

[10]Bernik T R, Friedman S G, Ochani M, et al. Cholinergic anti-inflammatory pathway inhibition of tumor necrosis factor during ischemia reperfusion[J]. J Vasc Surg, 2002, 36(6): 1231-1236.

[11]Shytle R D, Mori T,Townsend K, et al. Cholinergic modulation of microglial activation by α7 nicotinic receptors[J]. J Neurochem, 2004,89(2):337-343.

[12]項(xiàng)潔，沈霞，耿德勤．腫瘤壞死因子-α在大鼠腦缺血再灌注中的表達(dá)及對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響[J]．中國(guó)臨床康復(fù)，2004, 8(28)：6094-6095.

[13]李力仙,樸明學(xué),江濤,等.大鼠腦缺血再灌注后缺血側(cè)半球皮質(zhì)與缺血核心區(qū)皮質(zhì)TNF-α含量的對(duì)比研究[J].中國(guó)急救醫(yī)學(xué)，2002，22(6)：318-319.

[14]胡建鵬,王鍵,呂磊,等. 局灶性腦缺血再灌注時(shí)神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化與TNF-α、c-Myc表達(dá)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)病理生理雜志,2004，20(7)：1251-1255.

[15]王文鑫，王勝寶，束旭俊，等.刺激迷走神經(jīng)對(duì)大鼠缺血性腦損傷保護(hù)作用的初步研究[J].中國(guó)腦血管病雜志，2014，11(6)：317-322.

編輯 慕 萌

Effect of cholinergic anti-inflammatory pathway on cerebral ischemia-reperfusion injury in the rat

Wang Xiao, Su Yue, Li Tianzuo, Zhao Binjiang*

(DepartmentofAnesthesiology,CapitalMedicalUniversity,BeijingShijitanHospital,Beijing100038,China)

Objective To investigate the protective effect of cholinergic anti-inflammatory pathway (CAP) via the M1 receptor agonist,the M2 receptor antagonist and the nAChR7 agonist. during cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Methods Twenty-five male healthy Sprague-Dawley rats were randomly divided into five equal groups: sham operation (Sham) group, ischemia reperfusion (I/R) group, methoctramine (MET) group, McN-A-343(MA343) group and choline(CHO) group. Rats were subjected to four-vessel occlusion (4-VO) global cerebral ischemia.by electrocauterization of the bilateral vertebral arteries, except Sham group. 15 min before ischemia-reperfusion, we administered intracerebroventricularly (i.c.v.) Methoctramine(500 ng/kg,10 μL), McN-A-343(500 ng/kg,10 μL) and Choline(500 ng/kg,10 μL) to MET group, MA343 group and CHO group, other groups receiving saline (0.9%). Then forebrain ischemia was induced by tightening of the clasps that around the common carotid arteries for 20 minutes, except Sham group. Blood and tissue samples were collected after reperfusion for 6 h in all groups. Tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β) levels of hippocampus, heart, liver, lung,kidney and plasma were measured by radio-immunoassay(RIA).Apoptosis was detected by terminal deoxynucleotidyl-trallsferase meiated dUTP nick end labeling(TUNEL). Results Methoctramine and McN-A-343 could markedly inhibit the increase of TNF-α and IL-1βcontent in hippocampus, heart, liver, kidney and plasma after ischemia.Choline could also attenuated TNF-α and IL-1βexpression in hippocampus but could not inhibit them in heart, liver, kidney and serum. TNF-α and IL-1β levels in lung could not be suppressed by methoctramine, McN-A-343 or choline. Compared with I/R, the apoptotic cells in MET group, MA343 group and CHO group were significantly decreased. Conclusion It is indicated that CAP plays a potential role in alleviating local and systemic inflammatory response during cerebral ischemia-reperfusion injury. The mechanisms of anti-inflammatory were likely to suppress the expression of TNF-α and IL-1β.

cholinergic anti-inflammatory pathway; vagus nerve; cerebal ischemia-reperfusion; tumor necrosis factor-α(TNF-α); interleukin-1β(IL-1β); methoctramine; McN-A-343; choline

國(guó)家自然科學(xué)基金(8157050441)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (8157050441).

時(shí)間：2017-06-09 17∶26 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20170609.1726.010.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.03.003]

R743.31

2016-01-15)

*Corresponding author， E-mail：zhaobinjiang@sina.com