趙春松 鄒海強(qiáng) 李曉波 閆曉明 關(guān)云謙* 張 愚

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院細(xì)胞生物室，北京 100053；2.教育部神經(jīng)變性病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100053； 3.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣州 510010； 4.蘇北人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇揚(yáng)州 225001； 5.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院功能神經(jīng)外科，北京 100053)

· 基礎(chǔ)研究 ·

CM-DiI標(biāo)記人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并檢測其移植后產(chǎn)生腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的實(shí)驗(yàn)研究

趙春松1,2鄒海強(qiáng)3李曉波4閆曉明5關(guān)云謙1,2*張 愚1,2

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院細(xì)胞生物室，北京 100053；2.教育部神經(jīng)變性病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100053； 3.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣州 510010； 4.蘇北人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇揚(yáng)州 225001； 5.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院功能神經(jīng)外科，北京 100053)

目的 觀察熒光染料 (CM-DiI)標(biāo)記人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSC)后，是否會脫落造成周圍細(xì)胞被污染，標(biāo)記細(xì)胞經(jīng)靜脈移植入腦梗死大鼠后是否會造成宿主腦內(nèi)神經(jīng)元被誤染色；以及是否可以鑒定人BM-MSC產(chǎn)生腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)。方法 應(yīng)用不同濃度CM-DiI分別標(biāo)記培養(yǎng)的人BM-MSC，觀察標(biāo)記效率。將轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(green fluorescence protein, GFP)的人胚腎293T細(xì)胞和CM-DiI標(biāo)記的人BM-MSC細(xì)胞共培養(yǎng)，7 d之后觀察CM-DiI的紅色熒光和293T細(xì)胞是否雙標(biāo)記。將CM-DiI標(biāo)記的人BM-MSC經(jīng)靜脈移植入腦梗死大鼠體內(nèi)，觀察植入細(xì)胞的紅色熒光是否會沾染宿主細(xì)胞以及和BDNF免疫熒光的雙標(biāo)記。結(jié)果 不同濃度CM-DiI(1 000、200、100、20 nmol/L)均可成功標(biāo)記人BM-MSC，其中1 000、200 nmol/L 濃度標(biāo)記24 h后觀察標(biāo)記效率均達(dá)到98%以上, 比100、20 nmol/L 標(biāo)記的效率明顯升高(P<0.01)。CM-DiI標(biāo)記后的人BM-MSC與GFP 標(biāo)記的293T細(xì)胞共培養(yǎng)，7 d之內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)紅色熒光沾染綠色的293T細(xì)胞。移植后第3天，靜脈植入腦梗死大鼠的標(biāo)記細(xì)胞的紅色熒光沒有沾染宿主腦內(nèi)神經(jīng)元, 而且可以和BDNF的綠色熒光形成雙標(biāo)記。結(jié)論 CM-DiI可以高效地標(biāo)記人BM-MSC。采用200 nmol/L 濃度標(biāo)記的人BM-MSC細(xì)胞在體外培養(yǎng)和移植入腦梗死大鼠后都未發(fā)現(xiàn)對周圍細(xì)胞造成污染，植入細(xì)胞的CM-DiI熒光可以鑒定產(chǎn)生BDNF的人BM-MSC。

間充質(zhì)干細(xì)胞；CM-DiI ；移植；腦梗死；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

人類骨髓可以提取和擴(kuò)增出大量間充質(zhì)干細(xì)胞，已有研究[1-2]證實(shí)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSC)具有免疫調(diào)節(jié)和產(chǎn)生營養(yǎng)因子兩種主要作用，前者包括抑制T淋巴細(xì)胞增生、抑制促炎因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)等生成/抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體、抑制自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞的功能等；營養(yǎng)作用包括MSC本身產(chǎn)生多種營養(yǎng)性的細(xì)胞因子，還包括MSC經(jīng)血管移植后還可以促進(jìn)宿主腦內(nèi)產(chǎn)生各種營養(yǎng)因子[3]。MSC或者宿主產(chǎn)生的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)、膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell derived neurotrophic factor, GDNF)、胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor, IGF-1)等因子都對神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的恢復(fù)具有明顯益處[4-9]。其中BDNF在腦梗死恢復(fù)中的重要性已有了廣泛的研究[6-7]。判斷來自于移植細(xì)胞和宿主自身的營養(yǎng)性細(xì)胞因子在療效中的權(quán)重，對于今后提高M(jìn)SC移植治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的療效具有重要的意義。這就涉及到對移植細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，并用標(biāo)記信號檢測產(chǎn)生營養(yǎng)因子的細(xì)胞。

對細(xì)胞常用的標(biāo)記方法有使培養(yǎng)細(xì)胞攝入5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2’-deoxyuridine,BrdU)標(biāo)記法，轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(green fluorescence protein, GFP)基因標(biāo)記法以及生物染料標(biāo)記法。前兩種標(biāo)記方法操作比較復(fù)雜，而且標(biāo)記率較低；利用病毒載體轉(zhuǎn)入GFP基因后的干細(xì)胞常常在分化后丟失綠色熒光，造成使用上的限制。生物染料標(biāo)記方便且效率高，但是隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加，熒光染料會被稀釋、導(dǎo)致熒光減弱；而且還有熒光染料脫落沾染宿主細(xì)胞的可能。

氯甲基-1,1十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基-吲哚-羧花青-高氯酸鹽(chlormethylbenzamido-1,1-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylin-docarbocyamine， CM-DiI)作為一種生物染料，有強(qiáng)而穩(wěn)定的紅色熒光(激發(fā)峰553nm/發(fā)射峰570nm)。CM-DiI對細(xì)胞無毒，通過與膜結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)分子結(jié)合而標(biāo)記細(xì)胞，標(biāo)記效果穩(wěn)定長效，能很好地長期示蹤細(xì)胞。它水溶性比DiI更好，所以對于培養(yǎng)細(xì)胞染色更為方便。研究[10]證實(shí)，CM-DiI標(biāo)記后熒光在胞內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定，對多種細(xì)胞的陽性標(biāo)記率達(dá)98%以上，標(biāo)記細(xì)胞形態(tài)良好，能有效地觀察細(xì)胞在體外的誘導(dǎo)分化情況；如果將標(biāo)記的細(xì)胞注入體內(nèi)，可以有效的顯示移植細(xì)胞在活體組織中的遷移及分化。另外，其氯甲基替代基團(tuán)(CM基團(tuán))能與多肽及蛋白上的巰基反應(yīng)從而使該分子在醛類物質(zhì)中保持穩(wěn)定，所以CM-DiI標(biāo)記細(xì)胞后再進(jìn)行固定、破膜及石蠟包埋操作都不會影響其熒光。

CM-DiI標(biāo)記MSC雖然已有應(yīng)用[11]，但適宜方法還沒有明確的報(bào)道，標(biāo)記后是否會因?yàn)闊晒馊玖厦撀湓斐杉訇栃砸残枰獙?shí)驗(yàn)檢驗(yàn)。本文首先探討了不同濃度CM-DiI標(biāo)記BM-MSC的標(biāo)記效率；隨后探討體外實(shí)驗(yàn)中，CM-DiI標(biāo)記MSC的紅色熒光是否會造成與之共培養(yǎng)的細(xì)胞的沾染以及靜脈輸注的MSC進(jìn)入腦內(nèi)，其紅色熒光是否會沾染宿主腦內(nèi)細(xì)胞。最后，觀察了CM-DiI是否可用于鑒定移植細(xì)胞BDNF的產(chǎn)生。

1 材料與方法

1.1 材料

人骨髓來自首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院產(chǎn)科外傷流產(chǎn)的胎兒，胎齡16～18周，并獲得知情同意。

實(shí)驗(yàn)動物SPF級SD雄性大鼠6只(體質(zhì)量260～280 g)，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號為SCXK(京)2016-0004。大鼠自由進(jìn)水進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)動物分2組、每組3只，分別是缺血對照組[缺血后尾靜脈給予0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液]、人BM-MSC組[缺血后尾靜脈給予CM-DiI標(biāo)記BM-MSC的0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液]。

培養(yǎng)基低糖DMEM、RPMI 1640、αMEM，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)，抗生素,左旋谷氨酰胺(L-glutmax)，0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶(trypsin)，DPBS均來自美國Life technology公司。培養(yǎng)箱、超凈工作臺購自美國Thermo公司；全波長酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司；4000B顯微鏡和照相系統(tǒng)購自德國Leica 公司。CM-DiI購自美國Molecular probe 公司。

1.2 方法

1.2.1 胚胎骨髓人BM-MSC提取

人BM-MSC的基礎(chǔ)培養(yǎng)液為低糖DMEM +10%(體積分?jǐn)?shù))FBS +100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素 +2 mmol/L L-谷氨酰胺。在無菌條件下，分離胚胎下肢長骨，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液通過注射器沖洗出骨髓液，將細(xì)胞懸液以1.0×106個/mL接種到100 mm培養(yǎng)皿，置37 ℃，5% (體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱。培養(yǎng)4 d后棄去未貼壁細(xì)胞，以后每2～3 d半量換液待細(xì)胞貼壁生長至80%匯合時，以0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶-EDTA消化，1∶3傳代。

1.2.2 CM-DiI 標(biāo)記細(xì)胞

配制濃度為1 mmol/L的CM-DiI 儲存液，然后用人BM-MSC培養(yǎng)基稀釋為多個工作濃度，分別為 1 000、200、100、20 nmol/L。取100 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的第3～5代的細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁生長至80%匯合時(細(xì)胞量為3×106～4×106)。用含有不同濃度CM-DiI的培養(yǎng)液(8 mL/100 mm培養(yǎng)皿)培養(yǎng)細(xì)胞24 h。用15 mL PBS洗3遍，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每個標(biāo)記濃度設(shè)置3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.3 CM-DiI 標(biāo)記的人BM-MSC細(xì)胞和293T細(xì)胞共培養(yǎng)

分別用1 000、200、100、20 nmol/L濃度的CM-DiI標(biāo)記人BM-MSC，標(biāo)記方法同上，標(biāo)記后傳代時，按照1∶1的數(shù)量比例，分別將CM-DiI 標(biāo)記的人BM-MSC細(xì)胞和GFP 標(biāo)記的293T細(xì)胞共培養(yǎng)7 d，進(jìn)行熒光顯微鏡觀察是否有GFP標(biāo)記的綠色細(xì)胞被CM-DiI紅色熒光沾染的情況。

1.2.4 CM-DiI標(biāo)記的人BM-MSC靜脈植入腦梗死大鼠

采用遠(yuǎn)端大腦中動脈梗阻(distal middle cerebral artery occlusion，dMCAO)模型[12]。dMCAO局灶性腦缺血模型的制作：雄性SD大鼠260～280 g，周齡為9～11周，正常進(jìn)食飲水。5%(體積分?jǐn)?shù))恩氟烷誘導(dǎo)麻醉，1%～2%恩氟烷維持麻醉。頸部正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈，穿線待用。動物置左側(cè)臥位，于左耳與左眼間垂直切口，分離顳部肌肉暴露顱骨，高速鉆頭磨去大部分顳骨，咬骨鑷打開骨窗約3 mm×3 mm，暴露腦膜，顯微鏡下挑開腦膜，開顱暴露大腦中動脈(moddle cerebral artery, MCA)；動物再置仰臥位，微血管夾夾閉雙側(cè)頸總動脈(common carotid artery，CCA)；動物換至左側(cè)臥位，電凝后剪斷MCA?？p合顳部肌肉，皮膚。半小時后放開CCA血管夾，即制作成功dMCAO局灶性腦缺血模型。梗死后1 h, 取不同濃度CM-DiI 標(biāo)記人BM-MSC重懸在1 mL 0.9%(體積分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液中，緩慢推入大鼠尾靜脈。缺血對照組推入等量不含人BM-MSC的0.9%(體積分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液。

1.2.5 抗人類細(xì)胞核抗體和BDNF 抗體與腦內(nèi)CM-DiI標(biāo)記的人BM-MSC雙標(biāo)染色

大鼠腦梗死模型植入不同濃度CM-DiI 標(biāo)記的人BM-MSC后3 d，深麻醉后4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛灌注固定取腦。40 μm厚度連續(xù)冰凍切片。切片用0.01 mol/L PBS清洗2次，使用含有0.3% (體積分?jǐn)?shù))Triton X-100的PBS作用30 min，使用封閉液[含有1.5%(體積分?jǐn)?shù))的山羊血清和1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) BSA的0. 01 mol/L PBS]室溫孵育1 h，使用含有抗人細(xì)胞核抗體或抗BDNF抗體的緩沖液4 ℃孵育過夜。次日，用0.01 mol/L PBS清洗3次，使用含有FITC-熒光標(biāo)記的二抗(1∶200)的封閉液室溫孵育1 h，用0.01 mol/L PBS緩沖液清洗3次。使用濃度為100 ng/mL的 DAPI-PBS溶液做細(xì)胞核染色15 min，用0.01 mol/L PBS緩沖液清洗3次，用含有10%(體積分?jǐn)?shù)) 甘油的0.01 mol/L PBS溶液封片[3,13]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MSC生長和標(biāo)記

分離的原代人BM-MSC培養(yǎng)3～5 d，可見有梭形、多角形細(xì)胞貼壁。去除非貼壁細(xì)胞之后，進(jìn)一步增長成為形態(tài)相對均一的梭形細(xì)胞, 在培養(yǎng)瓶底部呈現(xiàn)旋渦狀。原代培養(yǎng)第10～12 d培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到80%融合，此時即可進(jìn)行胰蛋白酶消化并按1∶3傳代，之后每3～5 d需要傳代1次。不同濃度CM-DiI(1 000、200、100、20 nmol/L)CM-DiI均可成功標(biāo)記人BM-MSC，24 h后觀察標(biāo)記效率均分別達(dá)到99.95%±0.076%，97.67%±2.70%， 88.23%±3.08%, 77.63%±3.11% (圖1)。其中100、20 nmol/L濃度的標(biāo)記效率和1 000 nmol/L濃度相比已經(jīng)顯著降低(t=2.447,P=3.60×10-6；t=2.446,P=2.17×10-6)。200 nmol/L 濃度的標(biāo)記效率也顯著高于100、20 nmol/L(t=2.10,P=1.03×10-5；t=2.18,P=5.22×10-8)。

圖1 各濃度CM-DiI 標(biāo)記人BM-MSC的標(biāo)記效率Fig.1 The efficiency of CM-DiI labeling human BM-MSC at different concentrations

A、D、G、J: CM-DiI labeled cells；B、E、H、K: phase contrast images of BM-MSC; C、F、I、L：merged images of red fluorescence and phase contrast images； M: labelling efficiency of different CM-DiI concentrations；**P<0.01vs1 000 nmol/L group；##P<0.01vs200 nmol/L group；n=6, scale bar=100 μm;BM-MSC:bone marrow mesenchymal stem cells.

2.2 CM-DiI標(biāo)記的BM-MSC與GFP-293T細(xì)胞共培養(yǎng)

不同濃度CM-DiI(1 000、200、100、20 nmol/L)標(biāo)記人BM-BMSC和綠色熒光蛋白標(biāo)記的293T細(xì)胞共培養(yǎng)7 d。最高濃度1 000 nmol/L標(biāo)記的BM-MSC和293T細(xì)胞明顯發(fā)生熒光污染的現(xiàn)象。通過仔細(xì)觀察發(fā)現(xiàn)，在綠色視野中出現(xiàn)的和紅色標(biāo)記的人BM-MSC完全重合的影像(圖2 A～D)，屬于過強(qiáng)的紅色熒光綠二色通道間串色(crosstalk)造成。

次高濃度200 nmol/L標(biāo)記后的BM-MSC，熒光顯微鏡的視野下BM-MSC細(xì)胞沒有明顯串色效應(yīng)(圖2 E～H)，相比1 000 nmol/L CM-DiI標(biāo)記時接近100% 的串色效應(yīng)已經(jīng)明顯減輕，可以被較容易地識別開來。另外2個濃度(100，20 nmol/L)的CM-DiI標(biāo)記的細(xì)胞和綠色的293T細(xì)胞也沒有發(fā)現(xiàn)染色交叉污染的現(xiàn)象(圖2I～L,2M～P)。

圖2 CM-DiI標(biāo)記的人BM-MSC細(xì)胞和綠色熒光蛋白標(biāo)記的293T細(xì)胞共培養(yǎng)Fig.2 Co-culture of CM-DiI labeled human BM-MSC and GFP labeled 293T

A,E,I,M: red florescence of BM-MSC labeled by CM-DiI at different concentrations; B,F,J,N: GFP images in the green channel; C,G,K,O：merged images of GFP and phase contrast; D,H,L,P：merged images of channel red and green; scale bar=100 μm;BM-MSC:bone marrow mesenchymal stem cells; GFP:green fluorescence protein.

2.3 CM-DiI標(biāo)記的BM-MSC靜脈植入后遷移到腦梗死大鼠腦內(nèi)未造成宿主神經(jīng)元誤染色

從上面實(shí)驗(yàn)中可以看出，按照 1 000 nmol/L濃度CM-DiI標(biāo)記的BM-MSC 紅色熒光過強(qiáng)，而100、20 nmol/L 2個濃度不足以完全標(biāo)記BM-MSC。所以筆者在移植實(shí)驗(yàn)中采用了次高濃度，即200 nmol/L CM-DiI 對植入細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。經(jīng)靜脈移植后7 d，腦梗死區(qū)40 μm厚切片在顯微鏡下觀察，在梗死區(qū)域可以看到植入細(xì)胞的紅色熒光(圖3A)。這些紅色熒光與神經(jīng)元特異性抗原NeuN 的免疫熒光染色(圖3B)無明顯重合(圖3C)。CM-DiI 標(biāo)記的移植細(xì)胞和NeuN 標(biāo)記的宿主神經(jīng)元都可以和細(xì)胞核染色DAPI 很好地重合(圖3D)。這一結(jié)果說明，植入細(xì)胞的紅色熒光仍然固定在植入細(xì)胞上，至少不會污染宿主的神經(jīng)元使其攜帶紅色。沒有植入細(xì)胞的動物只可見到宿主神經(jīng)元的NeuN染色，未發(fā)現(xiàn)明確的紅色熒光(圖3 E～H)。

2.4 CM-DiI標(biāo)記的BM-MSC靜脈植入后遷移到腦梗死大鼠腦內(nèi)被抗人核抗體鑒定

為了鑒定靜脈植入的人BM-MSC遷移到達(dá)腦內(nèi)后，梗死區(qū)的這些CM-DiI紅色熒光的確是由植入細(xì)胞所攜帶，筆者對其進(jìn)行抗人類細(xì)胞核特異性抗體的染色，結(jié)果可見綠色的抗人核抗體染色與CM-DiI重合良好(圖4 A～D);無細(xì)胞植入的對照組腦組織經(jīng)染色則沒有紅色熒光，也沒有抗人核抗體陽性的綠色熒光(圖4 E～H)。

圖3 遷移至皮質(zhì)梗死區(qū)的植入細(xì)胞攜帶的CM-DiI熒光與宿主神經(jīng)元NeuN 免疫染色不重合Fig.3 CM-DiI fluorescence of BM-MSC migrateal into the cerebral infarct area was not overlapped with the NeuN immunostaining of host neuron

A：CM-DiI labeled BM-MSC in the infarct area of cerebral ischemia rat; B: NeuN staining of the same view field. C: merged image of A and B， No double staining of CM-DiI and NeuN were found； D:merged image of DAPI and C； E: without cell transplantation, the red fluorescence of CM-DiI could not be observed； F: NeuN staining in the field of E； G: merged image of E and F；H: merged image of DAPI and G; scale bar=250 μm；BM-MSC:bone marrow mesenchymal stem cells.

A-D:cell transplantation group; E-H：control group without cell transplantation;A,E: red fluorescence was used in identifying CM-DiI labeled BM-MSC in the infarct area of cerebral ischemia rat; B,F: immuno-staining of anti-human nucleus antibody in the same view field of A and E; C,G: merged image of red and green fluorescence; D,H: merged image of red, green and DAPI; scale bar=100μm;BM-MSC:bone marrow mesenchymal stem cells.

2.5 CM-DiI標(biāo)記的BM-MSC靜脈植入后遷移到腦梗死大鼠腦內(nèi)與BDNF雙標(biāo)記鑒定

為了鑒定靜脈植入的人BM-MSC遷移到達(dá)腦內(nèi)后是否可以產(chǎn)生BDNF，筆者對腦切片進(jìn)行了BDNF抗體免疫熒光染色，鏡下觀察梗死區(qū)和BDNF抗體染色的綠色熒光的雙標(biāo)記情況。結(jié)果顯示，植入細(xì)胞所攜帶的CM-DiI紅色熒光在梗死區(qū)域內(nèi)可見(圖5A)，BDNF的免疫熒光染色主要存在于梗死周邊皮質(zhì)區(qū)，在梗死區(qū)也有較多染色陽性細(xì)胞存在(圖5B)。表達(dá)BDNF的細(xì)胞中部分帶有CM-DiI紅色熒光(圖5C)，說明表達(dá)BDNF的細(xì)胞既來自于宿主自身，也來自于植入的BM-MSC細(xì)胞。這些雙標(biāo)記的細(xì)胞可以和DAPI細(xì)胞核染色較好地重合(圖5D)，是具有細(xì)胞核結(jié)構(gòu)的細(xì)胞。未植入細(xì)胞的動物腦內(nèi)沒有紅色熒光(圖5E)，但有BDNF的綠色熒光染色(圖5F～G)，說明腦梗死后動物腦內(nèi)有表達(dá)BDNF的細(xì)胞，這些細(xì)胞也具有細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為DAPI陽性(圖5H)。

圖5 腦梗死大鼠的腦內(nèi)CM-DiI標(biāo)記的人BM-MSC和anti-BDNF雙標(biāo)記鑒定Fig.5 CM-DiI labeled human BM-MSC in the infarct area of ischemia rat brain were identified by anti-BDNF double labeling

A-D:cell transplantation group; E-H：control group without cell transplantation; A,E: Red fluorescence was used in identifying CM-DiI labeled BM-MSC in the infarct area of cerebral ischemia rat; B,F: immuno-staining of anti-BDNF antibody in the same view field of A and E; C,G: merged image of red and green fluorescence; D,H: merged image of red,green and DAPI; scale bar=75μm;BM-MSC:bone marrow mesenchymal stem cells； BDNF:brain derived neurotrophic factor.

3 討論

目前認(rèn)為細(xì)胞移植治療腦梗死產(chǎn)生療效的機(jī)制主要有3點(diǎn)：①植入細(xì)胞分化成為神經(jīng)細(xì)胞。以MSC為例，植入的MSC大多數(shù)會在肺部、脾臟滯留，而且植入細(xì)胞的信號迅速減弱，通常在移植后1周消失，根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)證據(jù)可以推斷，植入的細(xì)胞大量分化成為神經(jīng)元的可能性很小[14]；②MSC減弱炎性反應(yīng)的作用[15-16]; ③植入細(xì)胞產(chǎn)生多種營養(yǎng)性的細(xì)胞因子，可以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)血管新生等[2-3]。

植入的細(xì)胞可以產(chǎn)生大鼠來源的細(xì)胞因子，也可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生大鼠源性的細(xì)胞因子。目前的研究[3]結(jié)果更多地傾向于認(rèn)為是植入細(xì)胞刺激大鼠產(chǎn)生的營養(yǎng)性細(xì)胞因子在發(fā)揮減輕梗死后腦組織損傷的作用。Karlupia等[3]將5×106個人類臍帶來源的MSC細(xì)胞或者單個核細(xì)胞經(jīng)動脈植入大鼠，沒有檢測到明顯的人類來源的細(xì)胞因子；但也有研究[17]明確表明，經(jīng)血管植入的MSC細(xì)胞可以遷移到腦內(nèi)，主要集中在梗死周邊區(qū)(infarct boundary zone, IBZ)，也有一部分可以進(jìn)入梗死區(qū)，而且進(jìn)入腦內(nèi)的MSC數(shù)量和療效有明確的正相關(guān)[2,18]?？梢姡M(jìn)入腦內(nèi)的MSC如何發(fā)揮在腦梗死中的治療作用還沒有明確的結(jié)論，為了研究這個問題，對移植細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記就非常重要。對移植細(xì)胞的標(biāo)記多采用病毒將GFP基因轉(zhuǎn)入MSC的方法，這種方法比較費(fèi)時費(fèi)力，另外轉(zhuǎn)染效率通常不能達(dá)到90%以上；最大的問題是GFP熒光在細(xì)胞分化后常常丟失。

生物染料一直是常用的細(xì)胞標(biāo)記試劑。對于標(biāo)記后的細(xì)胞是否會泄露出這些生物染料并造成周圍細(xì)胞，特別是在體的宿主細(xì)胞的污染，一直是一個必須慎重考慮的問題。本實(shí)驗(yàn)顯示，按照200 nmol/L濃度CM-DiI標(biāo)記的人BM-MSC，可以達(dá)到接近100%的標(biāo)記效率；無論和其他細(xì)胞共培養(yǎng)還是移植入動物體內(nèi)，標(biāo)記細(xì)胞都沒有造成對未標(biāo)記細(xì)胞的明確污染。這就說明，這種標(biāo)記方式基本可以滿足觀察植入細(xì)胞的遷移的要求。

出乎預(yù)料的是當(dāng)CM-DiI濃度較高的時候(1 000 nmol/L)，會造成被標(biāo)記的人BM-MSC 紅色熒光較強(qiáng)，這就會造成在熒光顯微鏡下和綠色通道串色的現(xiàn)象。通過降低標(biāo)記濃度可以較好地解決這一問題。最終和BDNF的雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)顯示，移植細(xì)胞攜帶的CM-DiI可以和BDNF免疫染色雙標(biāo)，由此證實(shí), CM-DiI不僅可以高效標(biāo)記人BM-MSC, 還適用于鑒定產(chǎn)生細(xì)胞因子的干細(xì)胞。

筆者發(fā)現(xiàn)在腦內(nèi)梗死區(qū)域中表達(dá)的BDNF的細(xì)胞，部分被 CM-DiI 標(biāo)記，換言之就是來自于移植細(xì)胞。這就說明在腦梗死后3 d，和宿主細(xì)胞產(chǎn)生營養(yǎng)因子相比，移植細(xì)胞產(chǎn)生營養(yǎng)因子BDNF在腦梗死恢復(fù)中的作用也是比較重要的。

本文的主旨是確定CM-DiI適用于鑒定人BM-MSC移植后產(chǎn)生BDNF，以及找到適宜的CM-Dil工作濃度，傾向于定性而非具體定量。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)部分帶有CM-DiI紅色熒光的細(xì)胞同時產(chǎn)生BDNF，說明表達(dá)BDNF的細(xì)胞既來自于宿主自身，也來自于植入的人BM-MSC細(xì)胞。下一個問題是，腦內(nèi)BDNF有多少由植入細(xì)胞產(chǎn)生，有多少由宿主自身產(chǎn)生。這是個非常重要的問題，本課題組將在今后的工作中逐步回答。

被標(biāo)記的細(xì)胞分裂增生后以及分化后是否還可以有效地被觀察到依然沒有定論，這也是今后的工作將要回答的問題。

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編輯 孫超淵

CM-DiI labeling human bone marrow mesenchymal stem cells and was used in identifying BNDF expressing cell after transplantation

Zhao Chunsong1,2, Zou Haiqiang3, Li Xiaobo4, Yan Xiaoming5, Guan Yunqian1,2*, Zhang Yu1,2

(1.DepartmentofCellBiology,XuanwuHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100053,China; 2.KeyLaboratoryofNeurodegeneration,MinistryofEducation,Beijing100053,China; 3.DepartmentofNeurology,TheGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommandinGuangzhou,Guangzhou510010,China; 4.DepartmentofNeurosurgery,NorthernJiangsuPeople’sHospital,Yangzhou225001,JiangsuProvince,China; 5.DepartmentofFunctionNeurosurgery,XuanwuHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100053,China)

Objective To observe whether the CM-DiI carried by human bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC) after labeling will contaminate the surrounding cells in vitro and in vivo and be used in identifing brain derived neurotrophic factor (BDNF) production. Methods The human bone marrow derived mesenchymal stem cells were labeled by CM-DiI at different concentrations and the labeling percentages were observed. The CM-DiI labeled human BM-MSCs were co-cultured with green fluorescence protein (GFP) labeled 293T cell for 7 days. Then the contamination of 293T cells by CM-DiI was observed. The cerebral ischemia rat model

CM-DiI labeled human BM-MSCs intravenously transplantation, the overlapping of red fluorescence with host neurons and brain derived neurotrophic factor BDNF in the host brain were observed. Results The human BM-MSCs could be successfully labeled by CM-DiI at 1 000, 200,100, and 20 nmol/L. The concentrations of 1 000 and 200 nmol/L reached more than 98% labeling percentages which were significantly higher than that labeled by 100 and 20 nmol/L(P<0.01). After 7 days co-culture of GFP labeled 293T cells, the CM-DiI labeled human BM-MSCs didn’t contaminate the 293T cells. Three days after transplantation, the CM-DiI labeled human BM-MSCs migrated into the infarct area of brain ischemia rats, but didn’t bring any red fluorescence into the host cells. CM-DiI labeled human BM-MSCs could be double labeled by BDNF. Conclusion CM-DiI could label human BM-MSCs effectively. The 200 nmol/L CM-DiI labeled human BM-MSCs will not contaminate the surrounding cells both in vitro and in vivo. The CM-DiI (200 nmol/L) labeling can be used in identifying transplanted BM-MSCs which are expressing BDNF.

mesenchymal stem cells；CM-DiI; transplantation；cerebral infarct; brain derived neurotrophic factor

國家自然科學(xué)基金(81371377),北京市科委健康培育項(xiàng)目(Z111107067311033)，北京市科技新星項(xiàng)目(2009B22)。This study was supported by National Natural Science foundation of China (81371377), Beijing Municipal Science and Technology Commission (Z111107067311033)，Beijing Nova Program of Science and Technology (2009B22).

時間：2017-06-09 17∶26 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20170609.1726.018.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.03.019]

Q2

2016-10-17)

*Corresponding author， E-mail：guanyunqian@aliyun.com