徐靜涵，薛 蕓，王 彥，閆 超

(上海交通大學(xué)，上海 200240)

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核殼型色譜柱-高效液相色譜法快速分離檢測水飛薊素中7種非對映異構(gòu)體

徐靜涵，薛 蕓，王 彥*，閆 超*

(上海交通大學(xué)，上海 200240)

采用核殼型色譜柱-高效液相色譜法快速分離檢測水飛薊素中7種非對映異構(gòu)體，優(yōu)化了液相色譜條件，實現(xiàn)了7種非對映異構(gòu)體的快速完全分離，并應(yīng)用于市售水飛薊制劑的分離檢測。優(yōu)化色譜條件如下：核殼型Halo C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，2.7 μm)、甲醇-水-甲酸(30∶70∶0.1)-甲醇為流動相、梯度洗脫、流速0.35 mL·min-1、進樣量2 μL。該方法在0.01～0.1 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2>0.997)，色譜峰峰面積和保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.74%和0.67%(n=6)。該方法操作簡單、省時、分離度好，可用于水飛薊制劑的分析檢測，也為水飛薊素中非對映異構(gòu)體的分離檢測提供新的思路。

高效液相色譜法；核殼型色譜柱；水飛薊素；非對映異構(gòu)體

水飛薊[Silybum marianum(L.)Gaertn.]為菊科植物水飛薊的干燥成熟果實，具有清熱解毒、疏肝利膽的功效，常用于肝膽濕熱、脅痛、黃疸等疾病的治療[1]。水飛薊的主要有效成分是以水飛薊素(silymarin)為主的黃酮類化合物[2]，主要包括水飛薊賓A/B(silybinA/B)、異水飛薊賓A/B(isosilybinA/B)、水飛薊亭A/B(silychristinA/B)、水飛薊寧(silydianin)等7種非對映異構(gòu)體化合物[3]，其結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 水飛薊素中7種非對映異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)式

水飛薊賓A和水飛薊賓B、異水飛薊賓A和異水飛薊賓B、水飛薊亭A和水飛薊亭B以及水飛薊賓和異水飛薊賓之間均互為差向異構(gòu)體。水飛薊賓是水飛薊素的主要活性成分，具有抗氧化、抗纖維化、穩(wěn)定細胞膜和調(diào)節(jié)肝再生能力等功能[4-5]；水飛薊亭與水飛薊寧的體外保肝作用均強于水飛薊賓[6-7]，其抗氧化活性更高[8]，抗細胞光老化作用也更明顯[9-10]。由于水飛薊素中7種非對映異構(gòu)體化合物的結(jié)構(gòu)多樣性以及生物活性的不同，對其的分離研究意義重大，但分離難度較大，難以實現(xiàn)完全分離。目前，主要的分析方法有：反相高效液相色譜法(RP-HPLC)[11-12]、超高效液相色譜法(UPLC)[13-14]、氣相色譜法(GC)[15]、紫外分光光度法(UV)[16]、毛細管電泳法(CE)[17]等，其中RP-HPLC是應(yīng)用最廣的分析方法，但存在分析時間較長、分離度較低、難以完全分離等問題；UPLC雖然分離效率高，但成本高。核殼型色譜柱是一種新型色譜柱，由1.7 μm的實心核和0.5 μm的多孔殼組成，球形均勻，縱向擴散項小[18]，具有滲透性好、分離快速、系統(tǒng)反壓較低、耐用性和穩(wěn)定性出眾等優(yōu)點[19-20]。作者采用核殼型色譜柱-HPLC在較短時間內(nèi)同時快速分離檢測水飛薊素，實現(xiàn)了7種非對映異構(gòu)體的完全分離，為水飛薊素及水飛薊制劑的分離研究提供了一種高效、準(zhǔn)確、便捷的方法。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，批號G25D5L1)、水飛薊素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥80%，批號R26N6L6634)，上海源葉生物科技有限公司；水飛薊素膠囊(批號B1401476)，德國馬博士大藥廠；水飛薊賓膠囊(批號550609056)，天津天士力圣特制藥有限公司；水飛薊賓葡甲胺片(批號151003446)，江蘇中興藥業(yè)有限公司；保肝膠囊(批號3051012017)，美國Farlong公司；乙腈、甲醇，色譜純，德國Merck公司；甲酸，分析純，美國Aladdin公司；超純水。

Shimadzu LC-20A型高效液相色譜儀，配有二元泵、進樣器、柱溫箱、紫外檢測器、LC solution化學(xué)工作站，日本Shimadzu公司；LTQ XL型線性離子阱質(zhì)譜儀，配有Xcalibur分析軟件，美國Thermo Scientific公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；Milli-Q Integral型超純水儀，重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司；JD200-3型電子天平，鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；XW-800型渦旋混合器，上海青浦滬西儀器廠。

1.2 溶液的制備

水飛薊賓、水飛薊素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品1.0 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成0.1 mg·mL-1的儲備液，置于4 ℃冰箱儲存，使用時用甲醇稀釋。

水飛薊賓膠囊、水飛薊素膠囊、保肝膠囊供試品溶液的制備：精密稱取膠囊內(nèi)容物5.0 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，超聲處理30 min，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，備用。

水飛薊賓葡甲胺片供試品溶液的制備：取片劑，去糖衣，研細；精密稱取細粉5.0 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，超聲處理30 min，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，備用。

1.3 實驗條件

色譜條件：核殼型Halo C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，2.7 μm)；流動相A為甲醇-水-甲酸(30∶70∶0.1)，流動相B為甲醇；梯度洗脫：0～30 min，20%～35% B；30～35 min，35% B；35～40 min，35%～20% B；流速0.35 mL·min-1；紫外檢測波長288 nm；柱溫25 ℃；進樣量2 μL。

質(zhì)譜條件：負離子掃描模式，毛細管電壓-4 kV，毛細管溫度350 ℃，掃描范圍50～1 500 Da，鞘氣流速35 arb，輔助氣流速15 arb，碰撞誘導(dǎo)解離(CID)碰撞能量35%。

2 結(jié)果與討論

2.1 水飛薊素中7種非對映異構(gòu)體的成分鑒定

通過對不同掃描模式的考察，發(fā)現(xiàn)水飛薊素(m/z482)在負離子模式下能夠獲得更多的離子碎片信息，如圖2所示。

圖2 水飛薊素的質(zhì)譜圖

水飛薊素中7種非對映異構(gòu)體均易失去一個質(zhì)子形成 [M-H]-準(zhǔn)分子離子峰，因此以m/z481作為母離子，分別對母離子進行碰撞誘導(dǎo)解離，獲得二次碎裂產(chǎn)生的子離子(圖3)。該方法可以獲得化合物的一系列碎片信息，能夠快速區(qū)分和鑒定同分異構(gòu)體。

圖3 水飛薊素中7種非對映異構(gòu)體的二級碎片質(zhì)譜圖

從圖3可以看出，由于7種非對映異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)不同，其二級質(zhì)譜的子離子碎片也有非常顯著的區(qū)別。水飛薊亭A/B的二級質(zhì)譜碎片中豐度最高的為m/z463、355，而水飛薊寧的子離子碎片中則沒有m/z355；對于差向異構(gòu)體水飛薊賓和異水飛薊賓，水飛薊賓A/B的二級質(zhì)譜碎片中豐度最高的為m/z463、453、355、301，但異水飛薊賓A/B的子離子碎片中沒有m/z355，且m/z301的豐度也不高。結(jié)果與7種非對映異構(gòu)體的子離子碎片裂解規(guī)律[13]相符。

根據(jù)主要的子離子碎片分別對水飛薊素中7種非對映異構(gòu)體進行成分鑒定，結(jié)果見表1。

表1 水飛薊素中7種非對映異構(gòu)體的二級質(zhì)譜主要離子碎片的成分鑒定

2.2 HPLC條件考察

2.2.1 流動相中有機改性劑的選擇

考察了不同流動相體系甲醇-水和乙腈-水對分離效果的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，乙腈為有機改性劑時，洗脫能力較強，整體保留時間縮短，但分離度下降，分離效果較差；甲醇為有機改性劑時，水飛薊素中7種非對映異構(gòu)體能夠得到良好的分離。因此，選擇甲醇作為流動相中的有機改性劑。

2.2.2 進樣量的選擇

考察了進樣量(20 μL、10 μL、5 μL、2 μL)對分離效果的影響，結(jié)果見圖5。

1～7：水飛薊亭A/B、水飛薊寧、水飛薊賓A/B、異水飛薊賓A/B

1～7：水飛薊亭A/B、水飛薊寧、水飛薊賓A/B、異水飛薊賓A/B

由圖5可知，隨著進樣量的減少，色譜峰的峰型及分離度都有了顯著改善，與樣品濃度無明顯關(guān)系。因此，為保證分離效果及準(zhǔn)確性，選擇進樣量為2 μL。

2.2.3 色譜柱的選擇

考察了普通C18色譜柱與核殼型Halo C18色譜柱對分離效果的影響，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，使用普通C18色譜柱時，盡管增長柱長及調(diào)節(jié)流動相流速，但水飛薊素中7種非對映異構(gòu)體仍然存在色譜峰分離度較低、分離效果不佳、分離時間長等問題；使用核殼型Halo C18色譜柱時，分離時間較普通C18色譜柱縮短了35.5%，分離效果良好。因此，選擇2.7 μm Halo C18色譜柱。

2.2.4 色譜柱柱長的選擇

考察了Halo C18色譜柱柱長(100 mm、150 mm)對分離效果的影響，結(jié)果見圖7。

1～7：水飛薊亭A/B、水飛薊寧、水飛薊賓A/B、異水飛薊賓A/B

a.100 mm b.150 mm

由圖7可知，隨著色譜柱柱長的改變，水飛薊素中7種非對映異構(gòu)體的保留時間基本不變；但當(dāng)使用150 mm柱長色譜柱時，水飛薊亭B與水飛薊寧的分離度顯著提高，是使用100 mm柱長色譜柱時分離度的3倍。因此，選擇150 mm柱長的Halo C18色譜柱。

2.2.5 最優(yōu)分離條件下的色譜圖

綜上，確定最優(yōu)分離條件為：Halo C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，2.7 μm)；流動相A為甲醇-水-甲酸(30∶70∶0.1)，流動相B為甲醇；梯度洗脫；流速0.35 mL·min-1；進樣量2 μL。在此最優(yōu)條件下，水飛薊素中7種非對映異構(gòu)體的色譜圖見圖8。

由圖8可知，在最優(yōu)分離條件下，水飛薊素中7種非對映異構(gòu)體被快速完全分離。

1～7：水飛薊亭A/B、水飛薊寧、水飛薊賓A/B、異水飛薊賓A/B

2.3 分析方法的評價

2.3.1 線性實驗

取水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用甲醇分別稀釋至0.01 mg·mL-1、0.03 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.07 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1，分別進樣，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得到水飛薊賓的線性回歸方程為：y=28089x+116.72，R2=0.997。表明，水飛薊賓在0.01～0.1 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限為20.0 ng·mL-1。

2.3.2 精密度實驗

在確定的最優(yōu)色譜條件下，將水飛薊素標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)進樣6次，計算水飛薊賓的色譜峰峰面積及保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.74%和0.67%。表明，本方法具有良好的精密度及重現(xiàn)性。

2.4 水飛薊制劑樣品分析

采用核殼型色譜柱-高效液相色譜法在最優(yōu)色譜條件下，對市售水飛薊制劑中常見的水飛薊賓膠囊、水飛薊賓葡甲胺片、水飛薊素膠囊、保肝膠囊分別進行分離檢測，結(jié)果見圖9。

由圖9可知，該方法能夠很好地將水飛薊制劑中的水飛薊賓及水飛薊素中7種非對映異構(gòu)體分離，可用于實際制劑中水飛薊賓及水飛薊素的定性定量檢測。

采用核殼型色譜柱-高效液相色譜法檢測4種水飛薊制劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在水飛薊賓膠囊、水飛薊賓葡甲胺片中均檢測到水飛薊賓，含量分別為95.7%和96.9%；在水飛薊素膠囊、保肝膠囊中均檢測到水飛薊素中的7種非對映異構(gòu)體，含量以水飛薊賓計分別為50.2%和11.1%，濃度均在線性范圍內(nèi)。表明，4種水飛薊制劑均符合成分要求，其中水飛薊賓膠囊與水飛薊賓葡甲胺片中水飛薊賓含量較高可能是因為藥物為化學(xué)合成[21-22]，具有較高的純度；水飛薊素膠囊與保肝膠囊中水飛薊賓含量較低可能是因為藥物是從天然植物中提取，可能含有其它成分。

a.水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)品 b.水飛薊賓膠囊 c.水飛薊賓葡甲胺片 d.水飛薊素標(biāo)準(zhǔn)品 e.水飛薊素膠囊 f.保肝膠囊

3 結(jié)論

建立了核殼型色譜柱-高效液相色譜法快速分離檢測水飛薊素中水飛薊亭A/B、水飛薊賓A/B、異水飛薊賓A/B、水飛薊寧等7種非對映異構(gòu)體的分離分析方法，解決了非對映異構(gòu)體及差向異構(gòu)體之間難以分離、分析時間長的問題，實現(xiàn)了7種非對映異構(gòu)體的完全分離。通過對分析條件的優(yōu)化，充分發(fā)揮了核殼型色譜柱的優(yōu)勢，明顯縮短了分離時間，取得了良好的峰型和分離度，并應(yīng)用于4種市售水飛薊制劑樣品的定性定量檢測。該方法具有快速高效的優(yōu)勢，且操作簡單、結(jié)果可靠。未來針對水飛薊素中的單個或多個異構(gòu)單體的研究可以利用該方法開展實驗，配合適宜的前處理方法，也可對血樣、尿樣等代謝產(chǎn)物進行檢測，為中藥有效成分的分析檢測提供了一種快速且行之有效的方法，也為非對映異構(gòu)體的分離檢測提供了新的思路。

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Rapid Separation and Determination of Seven Diastereoisomers in Silymarin by Core-Shell Column-High Performance Liquid Chromatography

XU Jing-han,XUE Yun,WANG Yan*,YAN Chao*

(ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200240,China)

Inthisstudy,sevendiastereoisomersinsilymarinwereseparatedanddeterminedrapidlybycore-shellcolumn-highperformanceliquidchromatography(HPLC).Thechromatographicconditionswereoptimized,rapidseparationofsevendiastereoisomerswereachieved,andtheseparationanddeterminationofthecommoncommercialSilybum marianumpreparationswerealsocarriedoutwiththismethod.Theoptimumchromatographicconditionswereasfollows:HaloC18column(150mm×4.6mm,2.7μm),gradientelutionwithmethanol-water-formicacid(30∶70∶0.1)-methanolasamobilephase,flowrateof0.35mL·min-1,injectionvolumeof2μL.Thelinearrelationshipwasgoodintherangeof0.01～0.1mg·mL-1(R2>0.997).Therelativestandarddeviation(RSD)ofthechromatographicpeakareaandtheretentiontimewere1.74%and0.67%(n=6),respectively.Theadvantagesofthismethodaresimpleoperation,shorttimeandhighseparationdegree.ItcanbeusedtoanalyzeSilybum marianumpreparations,andalsoprovidesanewideafortheseparationanddeterminationofdiastereoisomersinsilymarin.

highperformanceliquidchromatography(HPLC);core-shellcolumn;silymarin;diastereoisomer

上海市科委科研計劃項目(15142200200，16142200300)，上海市博士后基金項目(14R21422700)，上海市引進技術(shù)的吸收與創(chuàng)新專項(XC-ZXSJ-02-2016-11)

2017-02-14

徐靜涵(1991-)，女，福建福州人，碩士研究生，研究方向：藥物分析，E-mail：xujinghan118@163.com；通訊作者：王彥，副教授，E-mail：wangyan11@sjtu.edu.cn；閆超，教授，E-mail：chaoyan@sjtu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.06.014

O658 O657.72

A

1672-5425(2017)06-0065-06

徐靜涵，薛蕓，王彥，等.核殼型色譜柱-高效液相色譜法快速分離檢測水飛薊素中7種非對映異構(gòu)體[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(6)：65-70.