郭建巍，齊文峰，郝秀紅，李文軍，陳昌國(guó)，張 云，馬志家，陳秋圓，趙強(qiáng)元

MecA、Nuc基因在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測(cè)中的應(yīng)用

郭建巍，齊文峰，郝秀紅，李文軍，陳昌國(guó)，張 云，馬志家，陳秋圓，趙強(qiáng)元

目的 通過對(duì)180株金黃色葡萄球菌臨床分離株MecA、Nuc基因的檢測(cè)，以期選擇出一種適合臨床的并能簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA)的方法。方法 細(xì)菌鑒定及藥敏采用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥敏分析儀。MecA、Nuc基因檢測(cè)采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(fluorescence quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR)法。結(jié)果 FQ-PCR對(duì)180株金黃色葡萄球菌MecA、Nuc基因檢出率為75.0%，全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥敏分析儀對(duì)180株金黃色葡萄球菌的MRSA檢出率為72.8%，2種檢測(cè)方法比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥敏分析儀對(duì)MRSA的檢測(cè)正確率為94.8%。結(jié)論 FQ-PCR檢測(cè)MRSA正確率高，只需要1～2 h即可完成。該方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，值得推廣應(yīng)用。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；MecA基因；Nuc基因；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)；全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥敏分析儀

金黃色葡萄球菌是醫(yī)院感染和社區(qū)感染的重要病原菌，在金黃色葡萄球菌引起的臨床感染中，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin resistant staphylococcus aureus，MRSA)占到了60%～80%[1-4]，并逐年增加。確定金黃色葡萄球菌是否為MRSA對(duì)指導(dǎo)臨床合理使用抗生素以及制定防控措施具有重要意義。MecA基因是耐甲氧西林的決定性因素。本研究擬通過對(duì)金黃色葡萄球菌臨床分離株MecA、Nuc基因檢測(cè)與全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥敏分析儀結(jié)果進(jìn)行比較，以期選擇出一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)MRSA的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 180株金黃色葡萄球菌分離自2011年1月—2013年12月為臨床送檢的樣本，樣本類型有血液、尿液、胸腹水、痰液。質(zhì)控菌金黃色葡萄球菌ATCC25923購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.1.2 儀器 法國(guó)生物梅里埃公司全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥敏分析儀(VITEK COMPACT)；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(fluorescence quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR)分析儀(SLAN，上海宏石醫(yī)療科技有限公司)；金黃色葡萄球菌MecA、Nuc基因檢測(cè)試劑(上海之江生物科技有限公司，批號(hào)2014002)。

1.2 方法 細(xì)菌分離鑒定按第4版《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行[5]；FQ-PCR檢測(cè)MRSA根據(jù)試劑盒操作說明書進(jìn)行，擴(kuò)增條件為94℃2 min、93℃2 min、62℃30 s，循環(huán)40次，在62℃上機(jī)熒光檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0軟件，計(jì)數(shù)資料用百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FQ-PCR熒光擴(kuò)增曲線 耐甲氧西林MecA基因陽性，金黃色葡萄球菌特異性Nuc基因陽性，熒光曲線均為典型的S形(圖1)。

圖1 MRSA的MecA、Nuc基因雙陽檢測(cè)

耐甲氧西林MecA基因陰性，金黃色葡萄球菌特異性Nuc基因陽性，熒光曲線為典型的S形(圖2)。

耐甲氧西林MecA基因陰性，金黃色葡萄球菌特異性Nuc基因陰性，均無特異性擴(kuò)增曲線(圖3)。

圖2 MSSA的MecA基因陰性、Nuc基因陽性檢測(cè)

圖3 MecA、Nuc基因雙陰檢測(cè)

2.2 細(xì)菌鑒定和藥敏分析 180株樣本中，全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥敏分析儀鑒定，有131株MRSA，檢出率為72.8%；49株為甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(methicillin-susceptible Staphylococcus aureus，MSSA)，檢出率為27.2%。FQ-PCR對(duì)180株金黃色葡萄球菌MecA、Nuc基因進(jìn)行檢測(cè)，MecA、Nuc基因檢出率為75.0%(均為陽性即MRSA)。兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。如以FQ-PCR法作為MRSA測(cè)定的“金標(biāo)準(zhǔn)”，有7株本是MRSA，全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥敏分析儀報(bào)成MSSA；3株本是MSSA，全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥敏分析儀報(bào)成MRSA。對(duì)錯(cuò)誤菌株進(jìn)行校正后全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥敏分析儀對(duì)180株金黃色葡萄球菌的MRSA檢出率為71.1%，檢測(cè)正確率為94.8%。

3 討論

傳統(tǒng)的MRSA檢測(cè)方法有苯唑西林和頭孢西丁紙片擴(kuò)散法、瓊脂稀釋法、青霉素結(jié)合蛋白2a膠乳凝集篩選試驗(yàn)、微量肉湯稀釋法等[6-7]。這些方法操作費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、判讀不客觀，準(zhǔn)確度有待驗(yàn)證。表型檢測(cè)方法受遺傳背景、誘導(dǎo)劑和培養(yǎng)條件等因素影響，使得同一菌株隨培養(yǎng)條件和使用抗生素的不同抗藥性有變化(即異質(zhì)性)。隨著全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀的普遍使用，許多醫(yī)院已經(jīng)開始用其取代傳統(tǒng)手工鑒定和藥敏方法。全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥敏分析儀通常需要48～72 h才能向臨床提供報(bào)告，但其對(duì)MRSA的確診率是多少、方法的敏感性、特異性如何鮮見報(bào)道。

MRSA具有較強(qiáng)的外界適應(yīng)能力、定植能力和對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐受能力，其所致感染的流行病學(xué)逐漸從過去的院內(nèi)獲得型逐漸向社區(qū)獲得型轉(zhuǎn)化。目前認(rèn)為MecA基因?yàn)镸RSA耐藥的決定基因，金黃色葡萄球菌一旦獲得MecA基因，即表現(xiàn)為高度耐藥和多重耐藥。Nuc基因是編碼金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶的基因，在不同菌株之間具有較高的保守性，是金黃色葡萄球菌特異性基因。用FQ-PCR法聯(lián)合檢測(cè)MecA、Nuc基因，既保證了金黃色葡萄球菌檢測(cè)的特異性，又保證了MRSA檢測(cè)的特異性。由于分子生物學(xué)方法具有特異、靈敏、快速的特點(diǎn)，與全自動(dòng)微生物鑒定和藥敏分析儀相比，從理論上更適用于臨床或社區(qū)MRSA感染的快速檢測(cè)[8-14]。

本研究使用的180株金黃色葡萄球菌，通過全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥敏分析儀確認(rèn)，有131株MRSA、49株MSSA。進(jìn)一步用FQ-PCR法進(jìn)行確認(rèn)后，有7株本是MRSA，全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥敏分析儀報(bào)成MSSA，MRSA的漏報(bào)很有可能造成其傳播，從而引起嚴(yán)重院內(nèi)感染的爆發(fā)；3株本是MSSA，全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥敏分析儀報(bào)成MRSA，MRSA的錯(cuò)報(bào)可能會(huì)導(dǎo)致臨床抗生素的濫用。

FQ-PCR對(duì)180株金黃色葡萄球菌的MecA基因檢出率為75.0%，全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥敏分析儀對(duì)180株金黃色葡萄球菌的MRSA檢出率為72.8%；對(duì)全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥敏分析儀錯(cuò)誤菌株進(jìn)行校正后，全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥敏分析儀對(duì)180株金黃色葡萄球菌的MRSA檢出率為71.1%，全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥敏分析儀對(duì)MRSA的檢測(cè)正確率為94.8%。

本研究表明，用FQ-PCR檢測(cè)金黃色葡萄球菌的MRSA快速、敏感、準(zhǔn)確，與國(guó)外的研究結(jié)果基本一致[15]，可為臨床提供及時(shí)的病原菌防控信息，為抗菌藥物的合理使用、院內(nèi)感染的預(yù)防指導(dǎo)提供科學(xué)依據(jù)。

[1]Hiramatsu K，Cui L，Kuroda M，et al.The emergence and evolution of methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J]. Trends Microbiol，2001，9(10):486-493.

[2]Dumitrescu O，Dauwalder O，Boisset S，et al.Staphylococcus aureus resistance to antibiotics:key points in 2010[J]. Med Sci(Paris)，2010，26(11):943-949.

[3]Cosgrove SE，Sakoulas G，Perencevich EN，et al.Comparison of mortality associated with methicillin-resistant and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus bacteremia:a meta-analysis[J].Clin Infect Dis，2003，36(1):53-59.

[4]Cosgrove SE，Qi Y，Kaye KS，et al.The impact of methicillin resistance in Staphylococcus aureus bacteremia on patient outcomes:mortality，length of stay，and hospital charges[J]. Infect Control Hosp Epidemiol，2005，26(2):166-174.

[5]尚紅，王毓三，申子瑜.全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程[M].4版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2015.

[6]Louie L，Matsumura SO，Choi E，et al.Evaluation of three rapid methods for detection of methicillin resistance in Staphylococcus aureus[J].J Clin Microbiol，2000，38(6): 2170-2173.

[7]Pourmand MR，Hassanzadeh S，Mashhadi R，et al.Comparison of four diagnostic methods for detection of methicillin resistant Staphylococcus aureus[J].Iran J Microbiol，2014，6(5):341-344.

[8]Liu Y，Zhang J，Ji Y.PCR-based approaches for the detection of clinical methicillin-resistant Staphylococcus aureus [J].Open Microbiol J，2016，14(10):45-56.

[9]Huletsky A，Giroux R，Rossbach V，et al.New real-time PCR assay for rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus directly from specimens containing a mixture of staphylococci[J].J Clin Microbiol，2004，42 (5):1875-1884.

[10]Cuny C，Witte W.PCR for the identification of methicillinresistant Staphylococcus aureus(MRSA)strains using a single primer pair specific for SCCmec elements and the neighbouring chromosomeborne orfX[J].Clin Microbiol Infect，2005，11(10):834-837.

[11]Holfelder M，Eigner U，Turnwald AM，et al.Direct detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in clinical specimens by a nucleic acid-based hybridization assay [J].Clin Microbiol Infect，2006，12(12):1163-1167.

[12]Boyce JM，Havill NL.Comparison of BD GeneOhm methicillinresistant Staphylococcus aureus(MRSA)PCR versus the CHROMagar MRSA assay for screening patients for the presence of MRSA strains[J].J Clin Microbiol，2008，46:350-351.

[13]Francois P，Bento M，Renzi G，et al.Evaluation of three molecular assays for rapid identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J].J Clin Microbiol，2007，45(6):2011-2013.

[14]Deplano A，Tassios PT，Glupczynski Y，et al.In vivo deletion of the methicillin resistance mec region from the chromosome of Staphylococcus aureus strains[J].J Antimicrob Chemother，2000，46(4):617-620.

[15]Sudhaharan S，Vanjari L，Mamidi N，et al.Evaluation of LAMP assay using phenotypic tests and conventional PCR for detection of nuc and mecA genes among clinical isolates of Staphylococcus spp[J].J Clin Diagn Res，2015，9(8): DC06-DC09.

Application of MecA and Nuc genes detection in clinical isolated methicillin resistant Staphylococcus aureus

GUO Jianwei，QI Wenfeng，HAO Xiuhong，LI Wenjun，CHEN Changguo，ZHANG Yun，MA Zhijia，CHEN Qiuyuan，ZHAO Qiangyuan
(Department of Clinical Laboratory，Navy General Hospital，Beijing 100048，China)

Objective In order to choose an easier performed rapid and accurate methicillin resistant Staphylococcus aureus(MRSA)detection method.MecA and Nuc genes were detected from 180 strains clinical isolated Staphylococcus aureus.Methods Staphylococcus aureus were identified by automatic bacteria identification and drug sensitivity analyzer.MecA and Nuc genes were detected by fluorescence quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR)analyzer.Results The expression rate of MecA and Nuc genes in 180 Staphylococcus aureus was 75.0%.MRSA positive rate of 180 Staphylococcus aureus identified by automatic bacteria identification and drug sensitivity analyzer was 72.8%.No difference between automatic bacteria identification and FQ-PCR.The accuracy rate of automatic bacteria identification and drug sensitivity analyzer was 94.8%.Conclusion Detection MRSA according to quantitation of MecA and Nuc genes expression by FQ-PCR has a high accurate rate.The whole experiments would be finished in 1—2 hours.This method is rapidly，easily performed and has a wide application.

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)；MecA gene；Nuc gene；Fluorescence quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR)；Automatic bacteria identification and drug sensitivity analyzer

R446.5

B

2095-3097(2017)03-0157-03

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.03.007

2016-04-11 本文編輯:張?jiān)谖?

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(30872394)；北京市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(面上項(xiàng)目)(7162188)

100048北京，海軍總醫(yī)院檢驗(yàn)科(郭建巍，齊文峰，郝秀紅，李文軍，陳昌國(guó)，張 云，馬志家，陳秋圓，趙強(qiáng)元)

[注 明]郭建巍，齊文峰:并列第一作者