林艷，楊鵬飛，郭蔚華，羅菲爾，李星廣

重慶大學城市建設與環(huán)境工程學院，重慶 400045

利用藻紅外測試技術(shù)研究多種重金屬溶液對滇池銅綠微囊藻的毒性作用

林艷，楊鵬飛，郭蔚華*，羅菲爾，李星廣

重慶大學城市建設與環(huán)境工程學院，重慶 400045

為考察多種重金屬同時存在的混合溶液對藻類的生物毒性，選擇Cr(Ⅲ)、Pb(Ⅱ)、Hg(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)5種重金屬，以按照國家飲用水衛(wèi)生標準限值濃度配制的單一重金屬溶液和多種重金屬混合溶液為受試樣品，并利用本實驗室開發(fā)的藻紅外測試技術(shù)，評價了低濃度下單一重金屬溶液和多種重金屬共存溶液對藻的生物毒性。實驗結(jié)果顯示：按照飲用水標準限值配制的5種單一重金屬溶液均未觀察到對藻有生物毒性，但在多種重金屬共存的27個不同組合的混合溶液中，有73.1%的樣品表現(xiàn)出明顯的生物毒性；藻響應出現(xiàn)率與混合溶液中重金屬的總濃度呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.8942)。當多種重金屬以二元至五元混合時，藻響應出現(xiàn)率分別為50%、80%、100%、100%，表明隨著重金屬組分的增加，混合溶液的毒性作用越來越顯著。當不同混合溶液的重金屬總濃度大于0.11 mg·L-1時，平均累積藻響應占比顯著上升到93%，表明重金屬混合溶液中藻的毒性與總濃度之間存在劑量響應關(guān)系。采用平均藻響應出現(xiàn)率分析，結(jié)果顯示混合溶液中不同重金屬的相對影響順序為：Cr(Ⅲ)87.5%>Pb(Ⅱ)和Hg(Ⅱ)58.3%>Cd(Ⅱ)和Mn(Ⅱ)54.3%，表明Cr(Ⅲ)表現(xiàn)出的藻毒性遠高出其他重金屬?，F(xiàn)行的水質(zhì)標準通常采用單一指標和限值，本研究結(jié)果表明采用單一指標不能有效規(guī)避多種污染物共存體系的環(huán)境風險。

重金屬；藻類；生物毒性；混合物毒性；藻紅外測試

化學污染物的環(huán)境質(zhì)量標準通常用單一污染物的閾值濃度表述，但是過去大量的研究工作表明多種污染物共存體系的毒性存在加和、協(xié)同或拮抗作用[1-3]。由于藻細胞與動物細胞都具有氧化磷酸化的能量代謝系統(tǒng)，因而可采用急性毒性藻紅外測試法[4]分析多種重金屬共存體系的生物毒性。國內(nèi)外已經(jīng)有許多針對重金屬混合體系生物毒性的研究，包括汞、鎘和鉻對明亮發(fā)光桿菌的生物毒性[5]，Hg2+、Fe2+等10種重金屬的混合毒性研究[6]，Cd2+、Pb2+等6種重金屬對發(fā)光菌毒性效應[7]，Pb、As等7種重金屬對發(fā)光細菌的急性毒性研究[8]，重金屬對海參的污染及毒性毒理研究[9]，重金屬對膨脹腎形蟲的毒性效應研究[10]，水環(huán)境中草甘膦和三價砷對大型溞的毒性研究[11]等。這些研究中所設計的暴露濃度通常較高，以期獲得可觀察的毒性效應。利用藻紅外輻射技術(shù)可以比較測試污染物對藻的生物毒性，該方法比較靈敏[12]，已經(jīng)被用來測試環(huán)境重金屬急性毒性[13]、環(huán)境農(nóng)藥殘留急性毒性[14]，也有用于有機毒物的敏感藻研究[15]、以及多元有機毒物急性毒性研究[16]等。環(huán)境質(zhì)量標準是用于判斷環(huán)境質(zhì)量的基礎，通常采用單一指標及其限值的判別原則，沒有考慮聯(lián)合毒性作用。在有關(guān)環(huán)境質(zhì)量標準中，飲用水衛(wèi)生標準中重金屬指標的限值相對較低，因此本文采用該標準中的5項重金屬指標及其限值配制單一和不同組合的混合溶液，考察重金屬共存的方式、種類、數(shù)量、總濃度與毒性的關(guān)系，分析比較單一重金屬和多種重金屬共存時對水質(zhì)評價結(jié)果的影響。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

藻種采用滇池銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa in Dianchi Lake in China)，由中國科學院武漢水生生物研究所提供。所采用的培養(yǎng)基是BG11。

單一或混合溶液由國產(chǎn)分析純Pb(NO3)2、MnSO4·H2O、CrCl3·6H2O、HgSO4和Cd(NO3)2·4H2O配制，購自成都科龍化工試劑公司。上述試劑均配制成0.1 mg·L-1的母液備用。

采用母液配制實驗溶液，使藻液中[Pb2+]=0.01 mg·L-1，[Mn2+]=0.1 mg·L-1，[Cr3+]=0.05 mg·L-1，[Hg2+]=0.001 mg·L-1，[Cd2+]=0.005 mg·L-1，使之符合《生活飲用水衛(wèi)生標準》GB5749—2006規(guī)定的這5種重金屬的限值濃度。實驗溶液按5種重金屬的二元、三元、四元、五元混合物方式配制，溶液中重金屬濃度采用疊加方式表述。采用蒸餾水作為實驗空白對照。

1.2 實驗方法

實驗方法參考文獻[4]，具體如下：采用ST60便攜式紅外測溫儀測量實驗過程中的溫度變化。該儀器測量溫度的靈敏度為0.1 ℃。藻生長實驗在LRH-250A生化培養(yǎng)箱中進行，光照為散射日光或燈光。實驗的起始藻密度≥3.16×109個·L-1，測試杯采用上口直徑4 cm、底部直徑1.5 cm、高3 cm、厚0.1～0.2 cm的透明塑料平底容器，每個測試杯中加入5 mL藻液，測量并記錄溫度，測試杯布局見圖1。然后加入實驗溶液，再次測量加藥后的溫度。測溫時，紅外測溫儀頭部距離藻液正上方10～15 cm，指示紅色光點對準藻液面中心，按照從上到下，從左到右的順序方式連續(xù)測量3次，并連續(xù)測量10個時間段，計算實驗組和空白組每個時間段的溫度均值。同時，用MOTICBA200數(shù)碼顯微鏡觀察藻生長情況。

圖1 重金屬急性毒性藻紅外測試法中測試杯布局圖Fig. 1 Arrangement of cups in algae infrared radiation for toxicity test

加入實驗溶液后的藻響應采用溫差方式計算。藻響應溫差是指加藥組藻溫差的絕對值與對照組藻溫差的絕對值的差值，該差值大于零。藻溫差計算方法與藻響應藥品評價(已實現(xiàn)軟件處理)。其計算方法為：

ΔT=∣ΔTj∣-∣ΔTd∣，ΔT>0

(1)

加藥組藻溫差計算：ΔTj=(Tj-ti-Tj-t0)-(Tk-ti-Tk-t0)

(2)

對照組藻溫差計算：ΔTd=(Td-ti-Td-t0)-(Tk-ti-Tk-t0)

(3)

式中：Tj-ti—加藥后加藥組的藻溫；Tj-t0—加藥前加藥組的藻溫；Tk-ti—加藥后空白組的藻溫；Tk-t0—加藥前空白組的藻溫；Td-ti—加水后對照組的藻溫；Td-t0—加水前對照組的藻溫；j—加藥組，滴加藥液；d—對照組，滴加蒸餾水；k—空白組，不滴加藥液或蒸餾水；ti—測溫遍數(shù)，i=0為加藥前的測溫；i=1,2,…,10為加藥后第1,2,…,10遍測溫。

藻對加入實驗溶液的響應采用三指標評價法[4]，即溫差數(shù)據(jù)應該同時滿足下面3個指標時，才表示藻對加入的實驗溶液有響應：

指標①—最大藻溫差比較值，即10遍測溫中，︱ΔTj-max︱>︱ΔTd-max︱。

指標③—藻響應率(ψ)，即10遍測溫中，∣ΔTj∣>∣ΔTd∣的出現(xiàn)次數(shù)≥6。

在相同3次測試中，出現(xiàn)2次以上的相同結(jié)果[17]，這種具有重復性的結(jié)果作為最終測試結(jié)果。本文中，首測結(jié)果的再現(xiàn)性是指同一試驗材料和相同方法，在不同的條件下，后續(xù)測試結(jié)果與首測結(jié)果的相同性，它用來分析首測結(jié)果的可信性。不同的條件指不同操作者、不同設備、不同實驗室、不同或相同的時間。首測結(jié)果的再現(xiàn)性(%)表述為與首次測試結(jié)果相同的結(jié)果數(shù)與后續(xù)實驗次數(shù)的商值；最終測試結(jié)果的重現(xiàn)性是指同一試驗材料和相同方法，在不同的條件下，連續(xù)測試結(jié)果的相同性，它用來確定最終測試結(jié)果。不同的條件指不同操作者、不同設備、不同實驗室、不同或相同的時間[18]。藻響應出現(xiàn)率是指重金屬共存組合中藻有響應的組數(shù)與共存組合數(shù)的百分比。平均藻響應出現(xiàn)率(%)是藻響應出現(xiàn)率之和與求和的項數(shù)的商值。累積藻響應占比是指按重金屬總濃度由低到高排序重金屬共存組，某濃度以上藻有響應的共存組數(shù)與該濃度以上總共存組數(shù)的百分比。

2 結(jié)果 (Results)

2.1 藻對5種重金屬限值濃度的響應

由表1可知，當重金屬濃度為生活飲用水衛(wèi)生標準的限值濃度時，即[Pb2+]=0.05 mg·L-1，[Mn2+]=0.05 mg·L-1，[Cr3+]=0.05 mg·L-1，[Hg2+]=0.05 mg·L-1，[Cd2+]=0.05 mg·L-1，首測時，實驗藻對5種單一重金屬均無響應；重復性分析時，實驗藻對5種重金屬無響應的重復性均為100%，表明在生活飲用水衛(wèi)生標準的限值濃度下，單一存在的5種重金屬對實驗藻均未產(chǎn)生明顯的毒性。

2.2 首測結(jié)果的再現(xiàn)性

藻產(chǎn)生響應的首測結(jié)果有16種，藻未產(chǎn)生響應的首測結(jié)果有15種(表1)。由表2可知，16種藻響應的首測結(jié)果中，有15種的再現(xiàn)性≥50%，再現(xiàn)性出現(xiàn)率為94%，表明首測結(jié)果的可信性極高。15種藻未響應的首測結(jié)果中，有11種的再現(xiàn)性≥50%，再現(xiàn)性出現(xiàn)率為73%，表明首測結(jié)果的可信性較高。31種首測結(jié)果的再現(xiàn)性出現(xiàn)率平均為83.5%，表明首測結(jié)果的總體可信性比較好。

2.3 最終測試結(jié)果的重現(xiàn)性

由表2可知，藻產(chǎn)生響應的最終測試結(jié)果有19種，藻未產(chǎn)生響應的最終測試結(jié)果有12種；在31種最終測試結(jié)果中，每一種結(jié)果的重現(xiàn)性均≥67%，重現(xiàn)性出現(xiàn)率為100%，表明每一種最終確認的測試結(jié)果都具有可信性。

2.4 不同共存重金屬總濃度的藻響應結(jié)果

由表2知，當重金屬總濃度大于0.15 mg·L-1時，重金屬共存組合共有7種，且藻對其均產(chǎn)生響應：五元1種Cd(Ⅱ)+Cr(Ⅲ)+Pb(Ⅱ)+Hg(Ⅱ)+Mn(Ⅱ)，四元3種Cd(Ⅱ)+Cr(Ⅲ)+Hg(Ⅱ)+Mn(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)+Cr(Ⅲ)+Pb(Ⅱ)+Mn(Ⅱ)、Cr(Ⅲ)+Pb(Ⅱ)+Hg(Ⅱ)+Mn(Ⅱ)，三元3種Pb(Ⅱ)+Hg(Ⅱ)+Mn(Ⅱ)、Cr(Ⅲ)+Hg(Ⅱ)+Mn(Ⅱ)、Cr(Ⅲ)+Pb(Ⅱ)+Mn(Ⅱ)；當重金屬總濃度小于0.015 mg·L-1時，重金屬共存組合共有5種，且藻對其均未產(chǎn)生響應：3種單一重金屬Cd(Ⅲ)、Pb(Ⅱ)、Hg(Ⅱ)，2種二元共存組合Pb(Ⅱ)+Hg(Ⅱ)、Cd(Ⅲ)+Hg(Ⅱ)。在重金屬總濃度0.015～0.15 mg·L-1時，對重金屬共存組合的藻響應結(jié)果不統(tǒng)一，即藻響應不穩(wěn)定。

2.5 重金屬不同共存元數(shù)的藻響應出現(xiàn)率

由表3可知，在10種二元共存組合中，藻產(chǎn)生響應的有5種，藻響應出現(xiàn)率50%；在10種三元共存組合中，藻產(chǎn)生響應的有8種，藻響應出現(xiàn)率80%；5種四元共存組合中，藻產(chǎn)生響應的有5種，藻響應出現(xiàn)率100%；五元共存組合1種，藻產(chǎn)生響應的1種，藻響應出現(xiàn)率100%。分析表明，藻響應出現(xiàn)率與重金屬共存的元數(shù)正相關(guān)，重金屬三元以上共存時的生物毒性明顯增加。

表1 藻對共存重金屬首測響應的結(jié)果(2015-09～10)Table 1 Algae response to the coexistence of heavy metals in first test analysis (Sept. to Oct. 2015)

2.6 重金屬種類對共存組合藻響應的影響

采用平均藻響應出現(xiàn)率來分析各種重金屬對共存組合藻響應情況的影響。由表3可知，5種重金屬分別參與的各種共存組合的平均藻響應出現(xiàn)率為：Cr(Ⅲ)87.5%>Pb(Ⅱ)58.3% = Hg(Ⅱ)58.3%>Cd(Ⅱ)54.3% = Mn(Ⅱ)54.3%，表明有Cr(Ⅲ)參與的重金屬共存組合對藻的生物毒性最大；由2種重金屬共同參與的共存組合的平均藻響應出現(xiàn)率為：Cd(Ⅱ)+Cr(Ⅲ)100% = Cr(Ⅲ)+Hg(Ⅱ)100%>Cd(Ⅱ)+Mn(Ⅱ)58.33%，表明二價鎘和三價鉻、三價鉻和二價汞參與的共存組合對藻的生物毒性高于三價鎘和二價錳參與的共存組合。

2.7 藻響應出現(xiàn)率與重金屬總濃度的關(guān)系

藻響應出現(xiàn)率與重金屬總濃度關(guān)系采用累積藻響應占比進行分析。在累積藻響應占比和重金屬總濃度關(guān)系圖(圖2)中，用Matlab軟件對累積藻響應占比與重金屬總濃度0.001～0.166 mg·L-1、0.001～0.11 mg·L-1、0.11～0.166 mg·L-1進行相關(guān)性分析，得到的相關(guān)系數(shù)分別為r=0.8942(>0.8)、r=0.6642(<0.8)、r=0.9078(>0.8)，表明重金屬總濃度為0.001～0.166 mg·L-1時，累積藻響應占比與重金屬總濃度正相關(guān)，其中重金屬總濃度為0.001～0.11 mg·L-1時，累積藻響應占比與重金屬總濃度表現(xiàn)為弱相關(guān)性，重金屬總濃度為0.11～0.166 mg·L-1時，則表現(xiàn)為強相關(guān)性。重金屬濃度<0.11 mg·L-1時，累積藻響應占比≤76.9%，平均為70%；重金屬濃度≥0.11 mg·L-1時，累積藻響應占比≥80%(即80%以上的共存組合產(chǎn)生藻響應)，平均為93%。因此，可將重金屬總濃度0.11 mg·L-1作為引起藻響應的重金屬總濃度閾值。

圖2 累積藻響應占比與重金屬總濃度的關(guān)系Fig. 2 The relationship between cumulative response ratio and heavy metal concentration

表4 累積藻響應占比與重金屬濃度分析結(jié)果Table 4 Analysis between cumulative response ratio and heavy metal concentration

3 討論(Discussion)

3.1 單一重金屬在限值濃度時的生物毒性

由表1、表2可知，在生活飲用水衛(wèi)生標準的限值濃度下，單一存在的5種重金屬對實驗藻均未產(chǎn)生毒性作用。由于藻細胞與動物細胞都具有氧化磷酸化的能量代謝系統(tǒng)，重金屬對藻細胞和動物細胞的影響具有相同性，因此，不超過限值濃度的重金屬單獨存在時符合安全閾值設定的假設。

3.2 重金屬組合的生物毒性

當溶液的重金屬總濃度≥0.11 mg·L-1(藻響應的重金屬總濃度閾值)，重金屬濃度對藻毒性的影響顯著增加(表3)。26個不同重金屬組合的測試結(jié)果中，藻有響應和無響應的結(jié)果分別為19種和7種(表2)，19種藻有響應結(jié)果的占比為73.1%，表明重金屬以限值濃度混合時出現(xiàn)生物毒性的幾率較大。重金屬共存元數(shù)≥3時，對藻的毒性顯著增加(表3)。

3.3 重金屬組合與藻響應的關(guān)系和原因

由表3、表4可知，藻響應的出現(xiàn)率與重金屬的總濃度、組分元數(shù)正相關(guān)，即重金屬的總濃度增加、共存重金屬數(shù)越多，對藻的毒性越大，當混合體系重金屬總濃度≥0.11 mg·L-1(藻響應的重金屬總濃度閾值)、重金屬組分元數(shù)≥3時，混合物對藻的毒性顯著增加。重金屬混合物產(chǎn)生生物毒性的影響因素包括：總濃度增加引起的毒性增強和重金屬之間的協(xié)同、拮抗和加和作用。由分析結(jié)果2.6可知，在5種重金屬分別參與的不同組合中，Cr(Ⅲ)參與的組合平均藻響應出現(xiàn)率最高(87.5%,表3)，表明在5種重金屬中Cr(Ⅲ)具有增毒作用[19]，這與王蘭[20]和張亞旦等[6]用發(fā)光細菌的研究結(jié)果相同，Cr(Ⅲ)對重金屬共存產(chǎn)生毒性的影響大。

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Research on Biotoxicity of Mixed Solutions of Heavy Metals onMicrocystisaeruginosain Dianchi Lake through Algae Infrared Testing Technology

Lin Yan, Yang Pengfei, Guo Weihua*, Luo Feier, Li Xingguang

College of Urban Construction and Environment Engineering, Chongqing University, Chongqing 400045, China

22 May 2016 accepted 31 October 2016

To investigate the biotoxicity of mixed solution of a variety of heavy metals on algae, we selected five heavy metals including Cr(Ⅲ), Pb(Ⅱ), Hg(Ⅱ), Cd(Ⅱ), and Mn(Ⅱ) to prepare sample solutions with a single heavy metal and various mixed heavy metals, according to the limit concentrations of the National Hygiene Standard for Drinking Water, and evaluated the effect of these sample solutions on algae. The experimental results are as follows: No single heavy metal solution, which was prepared according to the limit standard value, was observed to show biotoxicity. On the contrary, 73.1% of the samples showed significant biotoxicity in 27 different mixtures of heavy metal coexistence. The total concentrations of heavy metals were positively correlated to the toxicity to the algae (r=0.8942). The ocurrence rates of positive algea response in mixtures of heavy metals from 2 kinds to 5 kinds were 50%, 80%, 100%, and 100%, respectively, indicating that the toxic effects of the mixed solutions were enhanced with the increasing heavy metal components. When the total concentrations of heavy metals in different mixed solutions were more than 0.11 mg·L-1, the average cumulative percentage of results with positive algea resonse increased significantly to 93%, indicating that a dose-response relationship existed between the toxicity and the total concentrations of mixed heavy metals. Besides, the results also showed that the order of relative influence of different heavy metals in the mixed solution was as follows: Cr(Ⅲ) was 87.5%; Pb(Ⅱ) and Hg(Ⅱ) were both 58.3%; Cd(Ⅱ) and Mn(Ⅱ) were both 54.3%. It is indicated that the toxicity of Cr(Ⅲ) was much higher than other heavy metals. The current water quality standards usually use a single indicator and limit value. However, according to the results of our study, it cannot effectively avoid the environmental risks of the coexistence of multiple heavy metals.

heavy metal; algae; biotoxicity; mixture toxicity; algae infrared radiation test

國家自然科學基金項目(51278506)；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項項目(106112015CDJXY210004)

林艷(1978-)，女，博士，碩士生導師，研究方向為水資源保護、飲用水安全等，E-mail: sister2000@163.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: gwhchl@163.com, 1363310382@qq.com

10.7524/AJE.1673-5897.20160522003

2016-05-22 錄用日期：2016-10-31

1673-5897(2017)2-120-09

X171.5

A

郭蔚華(1956—)，男，副教授，主要從事水處理微生物技術(shù)、水環(huán)境藻類等研究，發(fā)表學術(shù)論文30余篇。曾在西藏工作10多年，現(xiàn)工作于重慶大學。

林艷, 楊鵬飛, 郭蔚華, 等. 利用藻紅外測試技術(shù)研究多種重金屬溶液對滇池銅綠微囊藻的毒性作用[J]. 生態(tài)毒理學報，2017, 12(2): 120-128

Lin Y, Yang P F, Guo W H, et al. Research on biotoxicity of mixed solutions of heavy metals on Microcystis aeruginosa in Dianchi Lake through algae infrared testing technology [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(2): 120-128 (in Chinese)