曹滕飛，叢明，李兆艷，趙建民，呂家森，李成華

1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 3152112. 中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所，煙臺 2640033. 煙臺大學(xué)生命學(xué)院，煙臺 264005

氨態(tài)氮對菲律賓蛤仔毒理機(jī)制研究的內(nèi)參基因篩選

曹滕飛1，叢明2,，李兆艷3，趙建民2，呂家森3，李成華1

1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 3152112. 中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所，煙臺 2640033. 煙臺大學(xué)生命學(xué)院，煙臺 264005

為了準(zhǔn)確和系統(tǒng)地分析NH3-N對菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)毒性的分子機(jī)制，并對相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，利用geNorm和Normfinder這2種軟件，以暴露30 d中不同時間點(diǎn)的鰓組織cDNA為模板，從18S rRNA (18S)、beta-actin (Actin)、beta-tubulin (Tubu)、elongation factor 1-alpha (EF1α)、cyclophilin A (CyPA)、Ubiquitin (Ub)等6個備選管家基因中，篩選可以穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，作為轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的內(nèi)參基因。以稀釋50倍的鰓組織cDNA模板作為檢測模板，geNorm軟件分析獲得6對備選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性依次為：EF1α>CyPA>Actin>Tubu>Ub>18S，較優(yōu)內(nèi)參為EF1α和CyPA；NormFinder軟件分析獲得6對備選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性為：EF1α>Actin>Tubu>CyPA>Ub>18S，最優(yōu)內(nèi)參基因?yàn)镋F1α。為了驗(yàn)證上述篩選結(jié)果，分別以EF1α和CyPA作為內(nèi)參基因研究unigene1的表達(dá)趨勢，發(fā)現(xiàn)以EF1α為內(nèi)參基因時，unigene1的qRT-PCR的表達(dá)趨勢與其轉(zhuǎn)錄組表達(dá)倍數(shù)的變化趨勢一致。因此確定NH3-N暴露菲律賓蛤仔后，鰓組織中表達(dá)最為穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)镋F1α。

氨氮；菲律賓蛤仔；內(nèi)參基因

海岸帶是人類聚居的主要地帶之一，工業(yè)相對發(fā)達(dá)，人口也比較密集，工業(yè)和生活廢物給近岸海洋環(huán)境帶來很大的生態(tài)污染壓力。2010—2015年“中國近岸海域環(huán)境質(zhì)量公報”公布的數(shù)據(jù)顯示，我國近岸局部海域海水環(huán)境污染情況比較嚴(yán)峻，無機(jī)氮一直都是首要的超標(biāo)因子，而近岸海水中超過Ⅲ類標(biāo)準(zhǔn)限值的無機(jī)氮主要是氨氮[1-3]。2010年入海河流水質(zhì)和污染物入海狀況顯示，氨氮超標(biāo)率達(dá)到35.0%，氨氮平均濃度為1.82 mg·L-1[1]。“十二五”計(jì)劃已將氨氮列入減排的約束性指標(biāo)，其污染狀況有所緩解，2011年入海河流的氨氮平均濃度下降到0.274 mg·L-1[2]。但是從2014和2015年的海洋環(huán)境質(zhì)量狀況看，氨氮依然是自北向南很多海域包括海水重點(diǎn)養(yǎng)殖區(qū)的重要污染因子[3-4]。近岸海域是海洋養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的黃金區(qū)域，氨氮污染也因而成為制約我國近岸海水養(yǎng)殖業(yè)(包括灘涂貝類養(yǎng)殖業(yè))健康發(fā)展的主要污染因子。

國內(nèi)對于氨氮的貝類生態(tài)毒理研究主要集中于傳統(tǒng)生態(tài)毒理學(xué)方面，包括氨氮污染物對貝類的致死率和生理生化反應(yīng)等。王文琪等[5]對菲律賓蛤仔進(jìn)行氨氮的急性毒性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)氨氮暴露24 h的半致死濃度為239.88 mg·L-1，氨氮污染對血淋巴細(xì)胞的數(shù)目和溶菌活力有顯著性影響。方軍等[6]發(fā)現(xiàn)毛蚶(Scapharca subcrenata)稚貝對氨氮具有較高的耐受性，在24 h、48 h、72 h、96 h的半致死濃度分別為96.33、74.16、43.63、20.36 mg·L-1，安全濃度為2.04 mg·L-1，氨氮濃度越高存活率越低；陳金鳳等[7]對文蛤的存活率和能量收支情況進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)總氨氮對文蛤的安全濃度范圍為2 mg·L-1，氨氮污染對文蛤的攝食能、呼吸能和排泄能都有影響。羅杰等[8]發(fā)現(xiàn)鹽度和pH值可以顯著影響氨氮對管角螺(Hemifusus tuba)的毒性，鹽度越低、pH值越高其毒性越強(qiáng)。Wang等[9]以20.0 mg·L-1的氨氮染毒櫛孔扇貝(Chlamys farreri)24 h，導(dǎo)致櫛孔扇貝死亡率顯著上升，過氧根離子和丙二醛含量也顯著上升，谷氨酰胺合成酶活性在暴露后12 d顯著上升。國外也有一些關(guān)于氨氮污染對養(yǎng)殖貝類危害的研究報道。Reddy-Lopata等[10]發(fā)現(xiàn)南非鮑魚(Haliotis midae)對氨氮的耐受性隨體重的增加而增強(qiáng)，長期暴露于亞致死量氨氮濃度下的鮑魚幼苗的生長率比未接觸氨氮的鮑魚幼苗減少超過50%；Keppler[11]以美洲牡蠣(Crassostrea virginica)為研究對象，發(fā)現(xiàn)氨氮濃度升高可以導(dǎo)致牡蠣消化腺和鰓組織細(xì)胞的溶酶體不穩(wěn)定性顯著升高，同時谷胱甘肽濃度顯著下降?？傊壳按蠖鄶?shù)氨氮污染的研究集中于傳統(tǒng)毒理學(xué)的研究，氨氮毒性的分子機(jī)理研究較少。

本研究利用菲律賓蛤仔作為研究對象，采用環(huán)境污染相關(guān)濃度的氨態(tài)氮對菲律賓蛤仔進(jìn)行短期(1 d)和長期(30 d)暴露，以期利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)深入研究NH3-N污染對貝類短期和長期毒性的分子機(jī)制。轉(zhuǎn)錄組學(xué)(Transcriptome)是一門在整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科，也是最早發(fā)展起來并得到廣泛應(yīng)用的組學(xué)技術(shù)[11]。細(xì)胞的功能從基因的轉(zhuǎn)錄開始，通過分析轉(zhuǎn)錄組，可高通量地獲得基因表達(dá)的RNA信息，揭示基因表達(dá)與一些生命現(xiàn)象之間的內(nèi)在聯(lián)系。目前，轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在海洋貝類毒理學(xué)領(lǐng)域已得到初步的應(yīng)用。Milan等[12]采集有機(jī)污染嚴(yán)重海域的菲律賓蛤仔，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對其肝胰腺和鰓中RNA進(jìn)行測序和歸類分析，從中獲得了很多與有機(jī)污染相關(guān)的基因信息。迄今，還未發(fā)現(xiàn)利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)系統(tǒng)地研究氨氮污染對貝類的毒理學(xué)效應(yīng)的報道。

根據(jù)氨氮的致毒途徑可知，氨氮主要通過水生動物的鰓組織進(jìn)入體內(nèi)，引起生理調(diào)節(jié)機(jī)制紊亂，即鰓是氨氮攻擊的第一靶組織[12-15]。因此，本文以菲律賓蛤仔的鰓組織作為研究對象，選取菲律賓蛤仔體內(nèi)6個表達(dá)較為穩(wěn)定的基因，包括核糖體(18S rRNA)、肌動蛋白基因(beta-actin)、微管蛋白基因(beta-tubulin)、轉(zhuǎn)錄延伸因子基因(elongation factor 1-alpha)、親環(huán)素基因(cyclophilin A)、泛素蛋白基因(Ubiquitin)等[16-18]，作為研究氨氮暴露菲律賓蛤仔的轉(zhuǎn)錄組學(xué)的候選內(nèi)參基因。利用內(nèi)參篩選軟件geNorm[19]和NormFinder[20]，對這些內(nèi)參基因在氨氮暴露條件下的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行研究，以期為菲律賓蛤仔鰓組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究篩選穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用菲律賓蛤仔于2014年11月購于煙臺市萊山區(qū)佳世客超市，選取大小適宜、健康無病、生命力強(qiáng)、體態(tài)均勻(11±1.5) g的個體。實(shí)驗(yàn)開始前，將蛤仔放入室內(nèi)進(jìn)行10 d暫養(yǎng)，暫養(yǎng)期間海水溫度(20±2.0) ℃，pH 8.0±0.1，鹽度30.0‰，全天曝氣供氧，每日定時換水(30個體/30 L過濾海水)、喂食(螺旋藻液)一次。

實(shí)驗(yàn)所用氨態(tài)氮源為分析純NH4Cl(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，上海)，配制1 mol·L-1母液100 mL。根據(jù)《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(GB 11607—89)[21]規(guī)定，漁業(yè)養(yǎng)殖水體中非離子氨氮含量不應(yīng)超過0.02 mg·L-1，但是我國近海的氨氮污染程度遠(yuǎn)超過這一臨界值。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，0.1 mg·L-1氨態(tài)氮可以對菲律賓蛤仔的溶酶體穩(wěn)定性造成顯著性影響，但是在實(shí)驗(yàn)條件下長期暴露不會造成蛤仔出現(xiàn)嚴(yán)重的死亡狀況，所以本研究設(shè)2個濃度組：對照組(Control，0 mg·L-1)，低濃度暴露組(Low，0.1 mg·L-1)，每組設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)包含菲律賓蛤仔35只，水溫、投食、充氣等養(yǎng)殖條件與暫養(yǎng)條件一致。每日定時換水一次，并維持各組NH4Cl的質(zhì)量濃度。在暴露后的第1和30天取樣，每組隨機(jī)取6只菲律賓蛤仔，取其鰓組織浸沒于Trizol中，-20 ℃保存，用于RNA提取及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 RNA提取及cDNA合成

按照Trizol(TaKaRa，大連)試劑盒說明書提取樣品的總RNA，NanoDrop 2000(Thermo Scientific, America)檢測RNA的濃度和純度，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA實(shí)驗(yàn)采用EraserPrime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，大連)試劑盒，反應(yīng)分為去除gDNA、反轉(zhuǎn)錄兩步，體系(20 μL)如下：PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μL；RT Primer Mix 1.0 μL；5×PrimeScript Buffer 2 (for Real Time) 4.0 μL；RNase Free ddH2O 4.0 μL；總RNA 1 μg；去除gDNA的反應(yīng)液10 μL。反轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，產(chǎn)物-20 ℃保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)及可用性驗(yàn)證

根據(jù)本課題組對菲律賓蛤仔鰓組織的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，選擇18S rRNA (18S)、beta-actin (Actin)、beta-tubulin (Tubu)、elongation factor 1-alpha (EF1α)、Ubiquitin (Ub)、cyclophilin A (CyPA)等6個表達(dá)量較為穩(wěn)定的基因作為備選管家基因。按照定量引物設(shè)計(jì)要求，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)10對引物(表1)并由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

利用普通PCR反應(yīng)驗(yàn)證引物的可用性，反應(yīng)體系(25.0 μL)為：10× PCR Buffer (Mg2+free) 2.5 μL；dNTP Mixture 2.0 μL；MgCl21.5 μL；Taq 0.25 μL；ddH2O 15.75 μL；正向引物1 μL；反向引物1 μL；不同時間點(diǎn)鰓組織的混合cDNA 1.0 μL。反應(yīng)條件如下：94 ℃、5 min，(94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s)× 36 cycles，72 ℃、10 min，4 ℃存放。反應(yīng)結(jié)束后用1%的瓊脂糖凝膠檢測各擴(kuò)增片段的單一性(圖1)。

圖1 10對備選內(nèi)參基因引物的特異性檢測電泳圖注：1為18S1；2為18S2；3為Actin；4為Tubu1；M為DL 2000 Marker；5為Tubu2；6為EF1α1；7為EF1α2；8為Ub1；9為Ub2；10為CyPA。Fig. 1 Ten couples of specific primers for 6 target reference genes examined by agarose gel electrophoresisNote: 1 stands for 18S1; 2 stands for 18S2; 3 stands for Actin; 4 stands for Tubu1; M stands for DL 2000 Marker; 5 stands for Tubu2; 6 stands for EF1α1; 7 stands for EF1α2; 8 stands for Ub1; 9 stands for Ub2; 10 stands for CyPA.

1.4 實(shí)時熒光定量PCR

實(shí)時熒光定量PCR(Real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)采用7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, America)進(jìn)行，所用試劑盒SYBR Select Master Mix (Applied Biosystems, America)的反應(yīng)體系(20.0 μL)如下：鰓組織稀釋(10、50、100、500、1 000倍)模板cDNA 5 μL；正向引物0.6 μL；反向引物0.6 μL；SYBR Select Master Mix 10 μL；ddH2O 3.8 μL。反應(yīng)程序：50 ℃、20 s，94 ℃、7 min，(94 ℃、10 s，60 ℃、30 s)× 40 cycles。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用7500 System Software(Applied Biosystems, America)觀察擴(kuò)增曲線，將所得Ct值轉(zhuǎn)化為相對定量數(shù)據(jù)2-ΔΔCt[22]，并用geNorm和NormFinder軟件分別來分析基因的表達(dá)穩(wěn)定性；采用Su等[23]的加權(quán)賦值方法，按照分?jǐn)?shù)越小越穩(wěn)定的原則，綜合確定最適合的內(nèi)參基因。

1.6 內(nèi)參基因驗(yàn)證

以篩選出的內(nèi)參基因，利用氨氮暴露1 d和30 d的菲律賓蛤仔鰓組織稀釋50倍的cDNA為模板，采用1.4 qRT-PCR的體系與分析方法，對轉(zhuǎn)錄組中unigene 1 (c112601_g1)的表達(dá)情況進(jìn)行定量分析，獲得unigene 1在氨氮短期和長期暴露后的表達(dá)趨勢，通過與unigene 1的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)變化趨勢(log2FoldChange)相比較，驗(yàn)證最優(yōu)內(nèi)參基因的可用性。

2 結(jié)果(Results)

2.1 RNA、引物和cDNA質(zhì)量檢測

Nanodrop 2000檢測樣品RNA的OD260/280均在1.8～2.0之間，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測有5S、18S、28S三條條帶，說明RNA質(zhì)量符合qRT-PCR的要求。

用不同處理組鰓組織的混合cDNA對備選內(nèi)參基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果均為單一條帶，并且與預(yù)期長度一致(圖1)，其中6個基因的qRT-PCR結(jié)果顯示，溶解曲線都只有明顯的單一峰且重復(fù)性好(圖2)。因此，所用引物都能夠特異性地?cái)U(kuò)增其內(nèi)參基因，且不存在引物二聚體，適用于qRT-PCR。舍棄同一基因的重復(fù)引物對，最后分別以18S1、Actin、Tubu1、EF1α1、Ub1和CyPA的正反向引物作為內(nèi)參基因18S、Actin、Tubu、EF1α、Ub和CyPA的檢測引物。

表1 內(nèi)參基因的引物序列信息Table 1 Primer sequences for housekeeping genes

圖2 6個備選內(nèi)參基因擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線Fig. 2 Melting curves of products from 6 reference genes

圖3 geNorm分析NH3-N暴露后內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性Fig. 3 Stability value of reference gene expression after NH3-N exposure by geNorm

2.2 cDNA濃度確定

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對樣品鰓組織cDNA模板進(jìn)行梯度稀釋，稀釋倍數(shù)分別為10、50、100、500、1 000。根據(jù)各對引物的擴(kuò)增效果，發(fā)現(xiàn)cDNA模板稀釋50倍時，除18S的Ct值在11.0左右外，其余各對內(nèi)參基因的Ct值均在19.0～23.0范圍內(nèi)，比較適合作為檢測的模板濃度。

2.3 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析

2.3.1 geNorm軟件分析結(jié)果

通過對氨氮暴露不同時間的菲律賓蛤仔鰓組織cDNA進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，利用geNorm軟件分別分析18S、Actin、Tubu、EF1α、Ub和CyPA的2-ΔΔCt值，獲得其表達(dá)穩(wěn)定性的平均值M，依次為0.94、0.53、0.63、0.30、0.79和0.31。根據(jù)M值越小基因表達(dá)穩(wěn)定性越高，M值越大基因表達(dá)穩(wěn)定性越低的運(yùn)算原理，可得出6個候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性由高到低依次為：EF1α>CyPA>Actin>Tubu>Ub>18S，EF1α和CyPA為6個內(nèi)參基因中表達(dá)相對較穩(wěn)定的內(nèi)參基因(圖3)。

geNorm軟件通過計(jì)算內(nèi)參基因的配對差異值Vn/(n+1)來確定內(nèi)參基因的合適數(shù)目。程序以0.15為默認(rèn)取舍值，即如果Vn/(n+1)小于0.15，說明候選內(nèi)參基因中有n個適合作為qRT-PCR的內(nèi)參基因，沒必要引入第(n+1)個內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正[24]。本研究中Vn/(n+1)值均大于0.15 (圖3)，因此需要改變?nèi)∩釛l件后再確定內(nèi)參基因的合適數(shù)目。

2.3.2 NormFinder軟件分析

根據(jù)NormFinder軟件分析獲得的穩(wěn)定值(stability value)得知，6個備選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性順序依次為：EF1α>Actin>Tubu>CyPA>Ub>18S，其最優(yōu)的內(nèi)參基因?yàn)镋F1α(表2)。

2.3.3 綜合排名分析

根據(jù)geNorm和NormFinder這2種軟件分析結(jié)果的排名次序，采用Su等[23]的加權(quán)賦值方法，給每種分析方法中每個基因的表達(dá)穩(wěn)定性賦值，最穩(wěn)定為1分，其次依次為2、3、4、5、6分，然后把每個基因所得分?jǐn)?shù)相加進(jìn)行重新排序，分?jǐn)?shù)越小越穩(wěn)定。根據(jù)表3統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，18S的最后得分最高(12)，其他依次為Ub (10)，Tubu (7)，CyPA (6)，Actin (5)，最小為EF1α (2)。因此，綜合排名最穩(wěn)定的基因?yàn)镋F1α (表3)。

表2 NormFinder分析NH3-N暴露后的最優(yōu)內(nèi)參基因Table 2 The optimal reference gene after NH3-N exposure by NormFinder

2.4 內(nèi)參基因的驗(yàn)證結(jié)果

通過geNorm軟件分析發(fā)現(xiàn)，CyPA和EF1α都適合作為內(nèi)參基因，但是通過NormFinder軟件分析發(fā)現(xiàn)EF1α是最佳內(nèi)參基因，最后根據(jù)Su等[23]的綜合評價體系確定EF1α是最佳內(nèi)參基因。為了驗(yàn)證EF1α是最佳的內(nèi)參基因，分別以CyPA和EF1α基因作為內(nèi)參，以轉(zhuǎn)錄組中的unigene 1(c112601_g1)為研究對象，通過qRT-PCR技術(shù)，對其進(jìn)行表達(dá)情況分析。結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)，以CyPA作為內(nèi)參基因，unigene 1的表達(dá)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢；而以EF1α作為內(nèi)參基因分析發(fā)現(xiàn)，unigene 1的表達(dá)趨勢為先上升后下降。后者與轉(zhuǎn)錄組學(xué)unigene 1的實(shí)際log2FoldChange表達(dá)趨勢一致，而前者與之不符。

圖4 以CyPA和EF1α作為內(nèi)參研究目標(biāo)基因的表達(dá)趨勢分析Fig. 4 Expression profiles of target gene 1 using EF1α and CyPA as reference gene respectively

表3 geNorm和NormFinder分析穩(wěn)定值排名Table 3 Stability value ranking by geNorm and NormFinder

3 討論(Discussion)

篩選出具有特異性穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因,是對轉(zhuǎn)錄組學(xué)的目標(biāo)基因進(jìn)行qRT-PCR分析的前提條件，通常情況下需要根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)條件或不同類型的細(xì)胞或組織來進(jìn)行比較選擇，近年來的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，常用的內(nèi)參基因均存在不穩(wěn)定性，在qRT-PCR分析之前有必要對其穩(wěn)定性進(jìn)行重新評估[25]。如史艷艷等[26]研究在17α、20β雙羥孕酮(DHP)誘導(dǎo)鯉(Cyprinus carpio)卵母細(xì)胞最終成熟過程中，18S rRNA、28S rRNA、CTSZ、EF1α、GAPDH和β-actin 6個備選內(nèi)參基因的表達(dá)情況，同時應(yīng)用不同的內(nèi)參分析軟件分析其表達(dá)穩(wěn)定性，結(jié)果表明6個備選基因中表達(dá)最為穩(wěn)定的是EF1α。劉穎等[27]選取了櫛孔扇貝性腺組織為研究對象，分析了β-actin、β-TUB、EFlα、18S rRNA和GAPDH 5個備選內(nèi)參基因在不同發(fā)育階段和雌激素暴露條件下的表達(dá)水平，并應(yīng)用RefFinder軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)櫛孔扇貝不同發(fā)育階段和雌激素暴露下的表達(dá)最為穩(wěn)定的內(nèi)參基因是EFlα。王琦等[28]研究了合浦珠母貝(Pinctada fucata)不同組織、性腺發(fā)育時期、胚胎發(fā)育時期GAPDH、β-actin和18S rRNA 3個備選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定情況，并應(yīng)用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件分析表達(dá)穩(wěn)定性的差異，最終發(fā)現(xiàn)β-actin在不同組織和胚胎發(fā)育不同階段表達(dá)最穩(wěn)定，18S rRNA在性腺發(fā)育不同時期表達(dá)最穩(wěn)定。李迪等[29]研究了鱖魚(Siniperca chuatsi) 8個不同胚胎發(fā)育階段、5個胚后發(fā)育時期和8個成魚組織中RPL13、RPL19、EF1α、RPL13α、B2M、hprt1和rps29 7個備選內(nèi)參基因mRNA水平的表達(dá)穩(wěn)定情況，geNorm軟件分析后發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)育階段的穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因不同：在不同胚胎發(fā)育階段中表達(dá)最穩(wěn)定的是EF1α和B2M，在胚后不同時期中表達(dá)最穩(wěn)定的是EF1α和RPL13α，在鱖魚成魚不同組織中表達(dá)最穩(wěn)定的是B2M和RPL13α。

本研究采用2種軟件geNorm和NormFinder對菲律賓蛤仔體內(nèi)6對常用的備選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行獨(dú)立研究，其中由geNorm軟件可以得到內(nèi)參基因的穩(wěn)定性順序，基因表達(dá)的穩(wěn)定值M越小其穩(wěn)定性越高；還可以通過標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對差異分析(Vn/Vn+1)判定內(nèi)參基因的最適數(shù)量，默認(rèn)值為0.15 (Vn/Vn+1<0.15時不必使用內(nèi)參數(shù)量> n+1的看家基因作為內(nèi)參)。由軟件分析結(jié)果(圖3)可以看出，NH3-N暴露菲律賓蛤仔后，6個備選內(nèi)參基因在鰓組織中表達(dá)穩(wěn)定性依次為：EF1α>CyPA>Actin>Tubu>Ub>18S，EF1α和CyPA是表達(dá)最為穩(wěn)定的2個內(nèi)參基因。另一方面，各組的Vn/Vn+1都大于0.15，按照geNorm軟件設(shè)定的默認(rèn)條件Vn/Vn+1≤0.15來取舍，應(yīng)該選擇≥n+1個看家基因來做內(nèi)參，不過geNorm操作手冊中也提到0.15也非其最大設(shè)定值。由于本次實(shí)驗(yàn)設(shè)定的暴露時間范圍(0～30 d)跨度大，樣本間基因表達(dá)差異較大，所以可以選擇1個或者2個較優(yōu)的管家基因作為內(nèi)參基因，而不必拘泥于Vn/Vn+1≤0.15，蔣婷婷等[30]在篩選石蒜屬植物的內(nèi)參基因?qū)嶒?yàn)中也遇到了類似的問題。

NormFinder是由Andersen等2004年開發(fā)的另一款用于篩選穩(wěn)定內(nèi)參基因的軟件，其運(yùn)行結(jié)果以穩(wěn)定值的大小排序。與geNorm相似的是，NormFinder中表達(dá)穩(wěn)定值越小意味著該基因表達(dá)越穩(wěn)定。此外，NormFinder運(yùn)算結(jié)果中還提示最優(yōu)的內(nèi)參基因。本研究實(shí)驗(yàn)條件下，各內(nèi)參基因在鰓組織中的表達(dá)穩(wěn)定性從高到低的排序?yàn)椋篍F1α>Actin>Tubu>CyPA>Ub>18S，最優(yōu)的內(nèi)參基因?yàn)镋F1α。

由于geNorm和NormFinder軟件的篩選結(jié)果中存在一定的差異，因此需綜合2種軟件的排序結(jié)果來統(tǒng)一分析。在這里采用Su等[23]的加權(quán)賦值方法，按照分?jǐn)?shù)越小越穩(wěn)定的原則，綜合確定最適合的內(nèi)參基因。分析得出內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性綜合排序?yàn)椋篍F1α>Actin>CyPA>Tubu>Ub>18S，這一結(jié)果中EF1α最為穩(wěn)定。從而，進(jìn)一步確定出在氨氮暴露后的鰓組織中最優(yōu)的內(nèi)參基因?yàn)镋F1α。

為了驗(yàn)證上面的篩選結(jié)果，我們以轉(zhuǎn)錄組中隨機(jī)一個unigene(c112601_g1)為對象，利用EF1α和CyPA作為內(nèi)參基因，對目的基因的表達(dá)趨勢進(jìn)行驗(yàn)證(圖4)。qRT-PCR結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)比對后，發(fā)現(xiàn)以EF1α作為其內(nèi)參基因獲得的表達(dá)趨勢和實(shí)際轉(zhuǎn)錄組獲得數(shù)據(jù)的變化趨勢一致，但CyPA并非如此。由此可知，菲律賓蛤仔受到氨態(tài)氮暴露后，EF1α可以作為最佳的內(nèi)參基因進(jìn)行鰓組織轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。

[1] 中華人民共和國環(huán)境保護(hù)部. 2010年中國近岸海域環(huán)境質(zhì)量公報[EB/OL]. (2011-07-27) [2016-07-05]. http://www.zhb.gov.cn/hjzl/shj/jagb/201605/P02016052756263 0107006.pdf

[2] 中華人民共和國環(huán)境保護(hù)部. 2011年中國近岸海域環(huán)境質(zhì)量公報[EB/OL]. (2012-07-27) [2016-07-05]. http://www.zhb.gov.cn/hjzl/shj/jagb/201605/P02016052756319 5693481.pdf

[3] 中華人民共和國環(huán)境保護(hù)部. 2014年中國近岸海域環(huán)境質(zhì)量公報[EB/OL]. (2015-07-27) [2016-07-05]. http://www.zhb.gov.cn/hjzl/shj/jagb/201605/P02016052756568 1035413.pdf

[4] 中華人民共和國環(huán)境保護(hù)部. 2015中國環(huán)境狀況公報[EB/OL]. (2016-06-01) [2016-07-05]. http://www.zhb.gov.cn/hjzl/zghjzkgb/lnzghjzkgb/201606/P020160602333160471955.pdf

[5] 王文琪, 姜令緒, 楊寧, 等. 氨氮對菲律賓蛤仔免疫力的影響[J]. 海洋科學(xué), 2007, 31(1): 23-27

Wang W Q, Jiang L X, Yang N, et al. The effect of ammonia-N on immune activity of Ruditapes philippinarum [J]. Marine Sciences, 2007, 31(1): 23-27 (in Chinese)

[6] 方軍, 閆茂倉, 張炯明, 等. pH和氨氮對毛蚶稚貝生長與存活影響的初步研究[J]. 浙江海洋學(xué)院學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2008, 27(3): 281-285

Fang J, Yan M C, Zhang J M, et al. Preliminary studies on the effects of pH and ammonia on growth and survival to Scapharca subcrenata juveniles [J]. Journal of Zhejiang Ocean University: Natural Science, 2008, 27(3): 281-285 (in Chinese)

[7] 陳金鳳, 黃鶴忠, 徐汗富, 等. 氨氮對文蛤存活及能量收支的影響[J]. 海洋科學(xué), 2010, 34(3): 40-46

Chen J F, Huang H Z, Xu H F, et al. Ammonia effects the survival and the energy budget of clam Meretrix meretrix [J]. Marine Sciences, 2010, 34(3): 40-46 (in Chinese)

[8] 羅杰, 杜濤, 劉楚吾, 等. 不同鹽度、pH條件下氨氮對管角螺稚貝毒性影響[J]. 動物學(xué)雜志, 2010, 45(3): 102-109

Luo J, Du T, Liu C W, et al. Toxic effects of ammonia to Hemifusus tuba juveniles at different pH and salinity [J]. Chinese Journal of Zoology, 2010, 45(3): 102-109 (in Chinese)

[9] Wang X Q, Wang L L, Yao C, et al. Alternation of immune parameters and cellular energy allocation of Chlamys farreri under ammonia-N exposure and Vibrio anguillarum challenge [J]. Fish and Shellfish Immunology, 2012, 32(5): 741-749

[10] Reddy-Lopata K, Auerswald L, Cook P. Ammonia toxicity and its effect on the growth of the South African abalone Haliotis midae Linnaeus [J]. Aquaculture, 2006, 261(2): 678-687

[11] Keppler C J. Effects of ammonia on cellular biomarker responses in oysters (Crassostrea virginica) [J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 2007, 78(1): 63-66

[12] Dondero F, Banni M, Negri A, et al. Interactions of a pesticide/heavy metal mixture in marine bivalves: A transcriptomic assessment [J]. BMC Genomics, 2011, 12(1): 1-18

[13] Milan M, Coppe A, Reinhardt R, et al. Transcriptome sequencing and microarray development for the Manila clam, Ruditapes philippinarum: Genomic tools for environmental monitoring [J]. BMC Genomics, 2011, 12(10): 1-18

[14] Romano N, Zeng C S. Ontogenetic changes in tolerance to acute ammonia exposure and associated gill histological alterations during early juvenile development of the blue swimmer crab, Portunus pelagicus [J]. Aquaculture, 2007, 266(1): 246-254

[15] Liu S N, Pan L Q, Liu M Q, et al. Effects of ammonia exposure on nitrogen metabolism in gills and hemolymph of the swimming crab Portunus trituberculatus [J]. Aquaculture, 2014, 432(432): 351-359

[16] Zarivi O, Cesare P, Ragnelli A M, et al. Validation of reference genes for quantitative real-time PCR in Périgord black truffle (Tuber melanosporum) developmental stages [J]. Phytochemistry, 2015, 116(1): 78-86

[17] Li B, Chen C S, Xu Y, et al. Validation of housekeeping genes as internal controls for studying the gene expression in Pyropia haitanensis (Bangiales, Rhodophyta) by quantitative real-time PCR [J]. Acta Oceanologica Sinica, 2014, 33(9): 152-159

[18] 孫亞麗, 張德輝, 趙亮, 等. 銅脅迫下天藍(lán)苜蓿根組織實(shí)時定量PCR內(nèi)參基因的選擇[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報, 2014, 22(10): 1223-1231

Sun Y L, Zhang D H, Zhao L, et al. Reference gene selection for real-time quantitative PCR in black medic (Medicago lupulina L.) root tissue under copper stress [J]. Journal of Agricultural Biotechnology, 2014, 22(10): 1223-1231 (in Chinese)

[19] Vandesompele J, Preter D K, Pattyn F, et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes [J]. Genome Biology, 2002, 3(7): research0034.1-research0034.11

[20] Andersen C L, Jensen J L, Orntoft T F. Normalization of realtime quantitative reverse transcription-PCR data: A model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets [J]. Cancer Research, 2004, 64(15): 5245-5250

[21] 國家環(huán)境保護(hù)局. GB11607—89 漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 1990

[22] Livak K J, Schmittgent T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CTmethod [J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408

[23] Su J G, Zhang R F, Dong J, et al. Evaluation of internal control genes for qRT-PCR normalization in tissues and cell culture for antiviral studies of grass carp (Ctenopharyngodon idella) [J]. Fish and Shellfish Immunology, 2011, 30(3): 830-835

[24] 張艷君, 朱志峰, 陸融, 等. 基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄分析中內(nèi)參基因的選擇[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2007, 34(5): 546-550

Zhang Y J, Zhu Z F, Lu R, et al. Selection of control genes in transcription analysis of gene expression [J]. Progress in Biochemistry and Biophysics, 2007, 34(5): 546-550 (in Chinese)

[25] Schmid H, Cohen C D, Henger A, et al. Validation of endogenous controls for gene expression analysis in microdissected human renal biopsies [J]. Kidney International, 2003, 64(1): 356-360

[26] 史艷艷, 盧潔, 王藝?yán)? 等. 17α, 20β雙羥孕酮誘導(dǎo)鯉卵母細(xì)胞最終成熟相關(guān)基因表達(dá)內(nèi)參基因的篩選[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2014, 21(5): 910-919

Shi Y Y, Lu J, Wang Y L, et al. Reference gene validation for quantification of gene expression during final oocyte maturation induced by 17α, 20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one in common carp (Cyprinus carpio) [J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2014, 21(5): 910-919 (in Chinese)

[27] 劉穎, 王雙耀, 安立會, 等. 櫛孔扇貝內(nèi)參基因穩(wěn)定性研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報, 2013, 8(4): 616-622

Liu Y, Wang S Y, An L H, et al. Study on the expression stability of reference genes in Chlamys farrer [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2013, 8(4): 616-622 (in Chinese)

[28] 王琦, 何毛賢. 合浦珠母貝實(shí)時定量PCR內(nèi)參基因的穩(wěn)定性比較[J]. 南方水產(chǎn)科學(xué), 2013, 9(6): 33-40

Wang Q, He M X. Stability comparison of reference genes of Pinctada fucata by real-time qPCR [J]. South China Fisheries Science, 2013, 9(6): 33-40 (in Chinese)

[29] 李迪, 吳萍, 何美鳳, 等. qRT-PCR分析鱖魚內(nèi)參基因的篩選[J]. 生命科學(xué)研究, 2016, 20(3): 214-217

Li D, Wu P, He M F, et al. Screening of reference genes in Siniperca chuatsi for qRT-PCR analysis [J]. Life Science Research, 2016, 20(3): 214-217 (in Chinese)

[30] 蔣婷婷, 高燕會, 童再康. 石蒜屬植物實(shí)時熒光定量PCR內(nèi)參基因的選擇[J]. 園藝學(xué)報, 2015, 42(6): 1129-1138

Jiang T T, Gao Y H, Tong Z K. Selection of reference genes for quantitative real-time PCR in Lycoris [J]. Acta Horticulturae Sinica, 2015, 42(6): 1129-1138 (in Chinese)

◆

Selection of Reference Genes for Toxicological Mechanism Research onRuditapesphilippinarumExposed to Ammonia Nitrogen

Cao Tengfei1, Cong Ming2,, Li Zhaoyan3, Zhao Jianmin2, Lv Jiasen3, Li Chenghua1

1. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China2. Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China3. College of Life Science, Yantai University, Yantai 264005, China

27 July 2016 accepted 28 August 2016

In order to analyze the transcriptome data accurately and systemically, a suitable reference gene is necessary. In the present study, geNorm and Normfinder softwares were used to analyze the expression stabilities of six candidate reference genes of Ruditapes philippinarum after ammonia nitrogen exposure for 30 days. The reference genes included 18S rRNA (18S), beta-actin (Actin), beta-tubulin (Tubu), elongation factor 1-alpha (EF1α), cyclophilin A (CyPA) and Ubiquitin (Ub). Based on a 50-times diluted cDNA in gills as the quantitative real-time PCR template, the geNorm software analysis demonstrated that the expression stabilities of the six candidate reference gene after NH3-N exposure were as follows: EF1α>CyPA>Actin>Tubu>Ub>18S, and EF1α and CyPA were the best two ones among the six reference genes. A little different order was detected by the NormFinder software as follows: EF1α>Actin>Tubu>CyPA>Ub>18S. And EF1α was recommended as the optimal reference gene. As an assay, EF1α and CyPA were employed to examine one target unigene by qRT-PCR respectively. Final results showed that the variation trend detected by EF1α was more consistent with the foldchange value of the transcriptome. So EF1α was selected as the housekeeping gene to analyze the transcriptome data of gills in Ruditapes philippinarum after ammonia nitrogen exposure.

ammonia nitrogen; Ruditapes philippinarum; reference gene

國家自然科學(xué)基金(41406132)

曹滕飛(1992-)，男，碩士，研究方向?yàn)樯鷳B(tài)毒理和分子生物學(xué)，E-mail: caotengfei2012@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: mcong@yic.ac.cn；

10.7524/AJE.1673-5897.20160727001

2016-07-27 錄用日期：2016-08-28

1673-5897(2017)2-182-09

X171.5

A

叢明(1976-)，女，海洋生物學(xué)專業(yè)，博士，助理研究員，主要研究方向?yàn)楹０稁鷳B(tài)毒理和分子生物學(xué)。

曹滕飛, 叢明, 李兆艷, 等. 氨態(tài)氮對菲律賓蛤仔毒理機(jī)制研究的內(nèi)參基因篩選[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2017, 12(2): 182-190

Cao T F, Cong M, Li Z Y, et al. Selection of reference genes for toxicological mechanism research on Ruditapes philippinarum exposed to ammonia nitrogen [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(2): 182-190 (in Chinese)