朱 琳，章智華，謝鳳英

（東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

酶聯免疫法（ELISA）測定月餅中黃曲霉毒素B1

朱 琳，章智華，*謝鳳英

（東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

采用酶聯免疫法對月餅中黃曲霉毒素B1含量進行測定，并對該方法的線性、靈敏度、回收率和重現性進行驗證；黃曲霉毒素B1標準品在1.00～50.00 g/kg范圍內線性良好，Y=-40.291C+88.365，R2=0.998 4，該方法對黃曲霉毒素B1的最低檢出含量為1.00 g/kg，不同含量添加所得回收率為96.7%～105.0%，重復性好，精密度為1.96%。通過對9個不同產品特性月餅中黃曲霉毒素B1的測定，發(fā)現所有樣品均有檢出，但黃曲霉毒素B1的含量均小于5.00 g/kg。結果表明，酶聯免疫檢測方法測定快速、定量準確、重現性好，可高效率地定量檢測大量市售月餅中黃曲霉毒素B1的含量。關鍵詞：酶聯免疫法（ELISA）；黃曲霉毒素B1；月餅

黃曲霉毒素主要由黃曲霉、寄生曲霉、煙曲霉和少數溫特霉菌株產生，是一組化學結構類似的二呋喃香豆素衍生物。目前，分離鑒定出的天然黃曲霉素主要類型為B和G毒素，包括黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素G1（AFG1）和黃曲霉毒素G2（AFG2），其中以黃曲霉毒素B1毒性最強。1993年，國際癌癥研究機構定義黃曲霉毒素B1為一類致癌物，其毒性相當于氰化鉀的10倍、砒霜的68倍，尤其對人和動物肝臟具有極強致癌性[1]。毒理學研究表明，黃曲霉毒素的危害還包括導致機體免疫力低下、致畸和致突變性。根據GB 2761—2011食品國家標準食品中真菌毒素限量規(guī)定，稻谷、糙米、大米及其制品中黃曲霉毒素B1限量為10 g/kg，小麥、大麥、其他谷物及其制品的限量為5 g/kg，嬰幼兒配方食品和輔助食品限量為0.5 g/kg。歐盟國家規(guī)定更為嚴格，要求加工谷類食品和嬰兒食品中黃曲霉毒素B1的含量不能超過0.1 g/kg，因此及時檢測黃曲霉毒素B1已成為世界各國都非常重視的問題。

目前，食品中應用比較廣泛的黃曲霉毒素檢測方法有高效液相色譜法（HPLC）、薄層色譜法（TLC）、酶聯免疫測定法（ELISA）、液相色譜質譜串聯分析技術（LC-MS/MS）等。HPLC和LC-MS/MS方法雖然定量準確，但是樣品前處理一般需特定的凈化柱，凈化柱價格相對較高，同時需要配置價格昂貴的檢測儀器，操作人員需專門經過儀器培訓；而酶聯免疫法（ELISA）只需要全掃描酶標儀，操作簡單、快速、靈敏度高，檢測人員容易上手，在許多企業(yè)和小型檢測機構得到了廣泛應用。月餅因含有大量油脂、糖分、蛋白質，黃曲霉毒素B1污染可能性較大[2]。由于月餅節(jié)令性較強，短時間內需完檢，試驗利用酶聯免疫檢測技術（ELISA）以月餅為樣本，檢測了當地市場中隨機抽取月餅中黃曲霉毒素B1的含量，并對檢測方法進行有效評估[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

月餅，隨機購于廣東省某超市，品種包括五仁、蛋黃蓮蓉、水果、火腿4種口味，各8批次共32批次；甲醇、三氯甲烷、無水硫酸鈉，均為分析純。

1.2 儀器

Thermo multiskan MK3型酶標儀，美國熱電公司產品；HY-5型水浴恒溫回旋振蕩器，國華電器有限公司產品；恒溫干燥箱，德國BINDER公司產品；黃曲霉毒素B1檢測試劑盒，德國R-Biopharm拜發(fā)有限公司產品。

1.3 方法與步驟

1.3.1 樣品前處理方法

參照國標（GB/T5009.22—2003），準確稱取20.0 g粉碎樣品于250 mL具塞錐形瓶中，加入100 mL的甲醇-水（55∶45）提取液和30 mL正己烷，振蕩30 min，過濾于125 mL分液漏斗中，靜置分層，取下層清液于燒杯中，準確量取20 mL三氯甲烷，加塞振蕩2 min，靜置分層，經盛有約10 g預先用三氯甲烷潤濕的無水NaSO4定量快速濾紙過濾于蒸發(fā)皿中，再加5 mL三氯甲烷于分液漏斗中，重復提取，將三氯甲烷層一并濾于蒸發(fā)皿中，最后用少量的三氯甲烷洗滌無水Na2SO4過濾器，洗液濾于蒸發(fā)皿中，將蒸發(fā)皿放入通風櫥于65℃水浴揮干，用10 mL甲醇-PBS（2∶8）將凝結物分3次溶解，制作樣品提取液。

1.3.2 檢測步驟

將測試盒放置于室溫中30 min，平衡至室溫25℃；準確加入1.5 mL酶標抗原稀釋液，充分溶解，稀釋為試驗用酶標抗原溶液，于2～8℃下保存；取適量濃縮洗滌液，用蒸餾水稀釋20倍，作為試驗用洗滌液。酶聯免疫試驗詳細步驟如下：①根據待測樣品量，截取相應酶標板孔數，每孔加入250 L洗滌液洗滌，放置1 min后甩掉洗滌液，在吸水紙上排干，重復洗板1次。②依次加入配置好的標準溶液和月餅樣品提取液50 L，除儀器調零孔加入50 L酶標抗原稀釋液外，其余各孔均加入50 L酶標抗原溶液。③將反應板放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min。④取出反應板，用力甩掉反應液，拍干后，每孔加入250 L洗滌液洗滌，重復洗板4次。⑤每孔加入顯色底物液A和B，搖勻，將反應板放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中顯色15 min。⑥顯色結束后，每孔加入50 L終止液，搖勻后用酶標儀于波長450 nm處測定各孔的吸光度。

1.3.3 方法評價

從方法的線性、回收率、靈敏度、重現性4個方面，對月餅中黃曲霉毒素B1的酶聯免疫法進行方法評價。

1.3.4 結果計算

樣品中黃曲霉毒素B1含量按式（1）計算：

式中：W——試樣中黃曲霉毒素B1含量，g/kg；

C——樣品液中黃曲霉毒素B1含量，g/kg；

V——樣品定容體積，mL；

m——樣品質量，g；

D——稀釋倍數。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理方法篩選

對于月餅的前處理方法，試驗測試了2種提取溶劑，一種是以甲醇為提取溶劑，分別設置甲醇與水的體積比為1∶1和7∶3；另一種是三氯甲烷。通過比較，用三氯甲烷作為提取溶劑，回收率達標，本底值偏低，對試驗結果干擾小，最后選定三氯甲烷作為提取溶劑。

2.2 線性

將系列黃曲霉毒素B1標準溶液（0，1.00，5.00，10.00，20.00，50.00 g/L）測得的吸光度，繪制標準曲線，橫坐標為標準曲線質量濃度的常用對數值（lgC），縱坐標為各標準液吸光度與0 ng/mL標準溶液孔吸光度的比值，得線性方程Y=-40.291C+88.365，黃曲霉毒素B1在0～50.00 μg/L范圍內呈線性相關。

黃曲霉毒素B1標準曲線見圖1。

圖1 黃曲霉毒素B1標準曲線

2.3 靈敏度測定

按照試驗步驟，通過依次添加黃曲霉毒素B1到樣品中，降低黃曲霉毒素B1于波長450 nm處的光密度來確定最低檢測濃度，即檢測的靈敏度。

黃曲霉毒素B1靈敏度試驗見表1。

由表1可知，黃曲霉毒素B1含量為1.00 g/kg時，酶標儀于波長450 nm處的吸光度為1.812。與黃曲霉毒素B1為0時的吸光度1.714之差大于0.1，此值可確定為此方法的靈敏度，由于對黃曲霉毒素B1的最低檢出量為1.00 g/kg，因此將月餅黃曲霉毒素B1的檢測靈敏度確定為1.00 g/kg。

2.4 回收率

選2#月餅樣品作為添加回收試驗樣品，分別添加0，1.5，3.0，5.0 g/kg，按照試驗步驟測定添加樣品中黃曲霉毒素B1含量，每個樣品做3個重復，樣品的加標回收率在95%左右。

黃曲霉毒素B1回收率試驗見表2。

表1 黃曲霉毒素B1靈敏度試驗

表2 黃曲霉毒素B1回收率試驗

2.5 重現性

按照試驗檢測步驟重復測定月餅中黃曲霉毒素B1的含量6次，計算其標準差和相對標準偏差。

黃曲霉毒素B1重現性試驗見表3。

表3 黃曲霉毒素B1重現性試驗

由表3可知，多次樣品測定的平均值為1.441，標準差為0.03%，相對標準偏差為1.96%，重現性能夠滿足分析方法的要求。

2.6 不同品種月餅中黃曲霉毒素B1的含量

選取目前市場上消費較多的五仁、蛋黃蓮蓉、水果、火腿4類月餅樣品，樣品編號1～9測定黃曲霉毒素B1的含量。

月餅中黃曲霉毒素B1含量的測定見表4。

表4 月餅中黃曲霉毒素B1含量的測定

由表4可知，9個隨機購買的月餅樣品中均檢出黃曲霉毒素B1[4]，其中3個樣品黃曲霉毒素B1含量小于0.5 g/kg，4個樣品黃曲霉毒素B1含量為0.5～1.0 g/kg，2個樣品黃曲霉毒素B1含量大于1.0 g/kg且小于2.0 g/kg?？傮w來看，隨機購買的月餅樣品中黃曲霉毒素B1含量低。參考食品中真菌毒素限量標準（GB 2761—2011），抽取的9個月餅樣品中黃曲霉毒素B1含量均未超標。

3 結論

在測定的9個月餅樣品中，雖然黃曲霉毒素B1含量沒有超出標準，但是檢出率達100%，由此觀之，月餅作為一種受歡迎的食品，存在一定的食品安全風險。月餅因含有大量油脂、糖分、蛋白質，黃曲霉毒素B1污染可能性較大。

[1]Liu S W，Bai F，Li，et al.Investigation on AFB1toxin contamination in the pig feed in Southwest China[J].Animal Husbandry&Veterinary Medicine，2016，48（3）：51-54.

[2]管笛，亢子佳，賈迪，等.磁性酶聯免疫吸附法檢測玉米中黃曲霉毒素B1[J].食品研究與開發(fā)，2016，37（5）：101-105.

[3]吉小鳳，陳笑蕓，魏巍.酶聯免疫法（ELISA）測定瓶裝黃酒中黃曲霉毒素B1[J].浙江農業(yè)學報，2015，27（11）：2 006-2 010.

[4]邱楊，劉建麗，趙麗.食品中黃曲霉毒素B1的抽查檢驗與安全評價[J].現代食品科技，2008，24（10）：1 055-1 057.◇

Determination of Aflatoxin B1in Chinese Moon Cake by Enzyme-linked Immunosorbant Assay（ELISA）

ZHU Lin，ZHANG Zhihua，*XIE Fengying
（College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin，Heilongjiang 150030，China）

The content of aflatoxin B1in the moon cakes is measured by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The linearity，sensitivity，recovery and reproducibility of the method are verified.The linear range of aflatoxin B1standard is 1.00～50.00 μg/kg，Y=-40.291C+88.365，R2=0.998 4.The lowest detectable concentration of aflatoxin B1is 1.00 μg/kg.The recoveries are 96.7%～105.0%with good reproducibility and precision of 1.96%.The results of aflatoxin B1detection show that the contents of aflatoxin B1are less than 5.00 g/kg.The results of enzyme-linked immunosorbent assay show that the method is simple，determination of fast quantitative and accurate，reproducible，and can be highly effective quantitative detection of large quantities of commercially available moon cake in the aflatoxin B1content.

enzyme-linked immunosorbant assay（ELISA）；aflatoxin B1；Chinese moon cake

TS201.6

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.05.044

1671-9646（2017）05b-0056-03

2017-04-26

朱琳（1997—），女，本科，研究方向為食品科學。

*通訊作者：謝鳳英（1975—），女，博士，講師，研究方向為糧食、油脂、植物蛋白質工程。