董佳麗，路璐，樊賽軍

3,3′-二吲哚甲烷對小鼠造血系統(tǒng)輻射損傷的保護作用

董佳麗，路璐，樊賽軍△

目的探討3,3′-二吲哚甲烷（3,3′-diindolylmethane,DIM）對2 Gy輻射損傷小鼠造血系統(tǒng)的保護作用。方法30只雄性C57BL/6小鼠隨機區(qū)組法分為對照組、2 Gy照射組和2 Gy照射+DIM組，每組10只。對照組小鼠接受假照射（0 Gy），其余2組小鼠接受2 Gy137Cs γ-射線一次性全身照射。2 Gy照射+DIM組小鼠照射前30 min腹腔注射DIM（75 mg/kg），其余2組小鼠腹腔注射對照溶液。照后7 d和15 d每組取5只小鼠，取外周血進行血象測定，取骨髓細胞測定骨髓有核細胞（BMNCs）數(shù)目，活性氧檢測探針（DCFH-DA）檢測細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平、骨髓粒-單核巨噬細胞集落（CFU-GM）形成數(shù)目檢測克隆形成能力。結(jié)果與對照組比較，2 Gy照射組外周血白細胞、血小板數(shù)量、BMNCs數(shù)目和克隆形成能力顯著下降，細胞內(nèi)ROS水平顯著提高（P＜0.05）。與2 Gy照射組比較，2 Gy照射+DIM組外周血白細胞、血小板數(shù)量、BMNCs數(shù)目和克隆形成能力顯著提高，細胞內(nèi)ROS水平顯著下降（P＜0.05）。結(jié)論DIM對小鼠2 Gy照射后造血系統(tǒng)損傷有一定的保護作用，其機制可能與降低骨髓細胞內(nèi)ROS水平有關(guān)。

輻射損傷；造血系統(tǒng)；活性氧；骨髓細胞；小鼠，近交C57BL；3,3′-二吲哚甲烷

吲哚-3-甲醇（indole-3-carbinol,I3C）廣泛存在于包括花莖甘藍、蘿卜、大白菜、花椰菜以及水田芥菜等十字花科植物中，I3C是受到咀嚼或浸漬等組織結(jié)構(gòu)破壞時，3-吲哚甲基蕓苔葡糖硫苷在內(nèi)源性黑芥子硫苷酸酶的作用下水解產(chǎn)生的衍生物［1］。

I3C能夠在胃酸環(huán)境下發(fā)生縮合反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為多種低 聚 物 ，包 括 3,3- 二 吲 哚 甲 烷（3,3′-diindolylmethane,DIM）、［2-（吲哚-3-甲基）-吲哚-3-甲基］吲哚-3-甲烷［2（indol-3-ylmethyl）3,3 diindolylmethane,LTr1］、吲哚（3,2b）咔唑［indolo（3,2b）carbazole,ICZ］等［2］。而 DIM 和 LTr1 是 I3C進入體內(nèi)血清中的主要代謝產(chǎn)物，在肝臟中的I3C各種代謝產(chǎn)物中DIM占24%，LTr-1占20%［3］。因此，I3C的各種生物學(xué)效應(yīng)可能主要應(yīng)歸因于這些多聚體的作用，其中DIM的作用尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，I3C及其主要代謝產(chǎn)物DIM可以正向調(diào)節(jié)電離輻射導(dǎo)致的DNA損傷和修復(fù)密切相關(guān)蛋白ATM和BRCA1的表達及其磷酸化［4-6］。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，DIM可以通過ATM/BRCA1磷酸化的激活，選擇性增加正常組織的耐輻射能力，延長受照動物的存活時間，而不影響腫瘤組織的放射治療敏感性，提示DIM可以作為選擇性強、療效好的輻射防護藥物候選藥［7］。DIM對4 Gy照射小鼠造血系統(tǒng)輻射損傷具有較好的防護效果［8］。本研究旨在探討DIM對2 Gy輻射損傷小鼠造血系統(tǒng)的保護作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑137Cs γ-射線照射源，劑量率為1.01 Gy/min（Autocell40，加拿大原子能有限公司）；流式細胞儀（BD Accuri C6，美國）；全自動血細胞分析儀（Sysmex，日本）。DIM由美國Georgetown大學(xué)化學(xué)合成并提供。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco公司。甲基纖維素培養(yǎng)基M3534（MethoCult?GF M3534）購 自 加 拿 大 Stem Cell Technologies公司。活性氧檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗動物 C57BL/6小鼠30只，雄性，SPF級，8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，合格證號：SCXK（京）2009-0017，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心提供SPF級條件飼養(yǎng)。飼料為清潔級全價鼠料，購自北京科奧協(xié)力飼料有限公司。實驗動物操作均遵從中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實驗動物倫理委員會審定的規(guī)范要求。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及給藥方案 隨機區(qū)組法將小鼠分為對照組、2 Gy照射組和2 Gy照射+DIM組，每組10只。對照組接受假照射，其余2組進行137Cs γ-射線一次性全身照射，吸收劑量為2.0 Gy，源靶距15 cm。2 Gy照射+DIM組小鼠在照射前30 min腹腔注射DIM 75 mg/kg。對照組和2 Gy照射組給予等體積溶劑。實驗過程中，所有動物在同等條件下飼養(yǎng)，自由飲水和攝食。

1.3.2 外周血、體質(zhì)量及臟器系數(shù)的測定 照射后第7天和第15天，從眼靜脈叢取外周血于提前加入抗凝劑K3EDTA的EP管中，用全自動血細胞分析儀測定白細胞數(shù)、紅細胞數(shù)和血小板。小鼠稱質(zhì)量后，頸部脫臼處死，75%乙醇浸泡消毒，剝離小鼠的胸腺和脾臟，用精密電子天平稱質(zhì)量，計算胸腺、脾臟系數(shù)。臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

1.3.3 骨髓有核細胞（BMNCs）的獲取 無菌條件下取小鼠股骨、脛骨，用含2%胎牛血清的PBS緩沖液沖洗骨髓腔，獲取骨髓細胞，過濾后進行細胞計數(shù)。

1.3.4 骨髓細胞克隆形成能力檢測 調(diào)整骨髓細胞濃度為1×105/mL，緩慢接種于24孔培養(yǎng)板中，每組6個平行樣，37℃，5%CO2培養(yǎng)5 d后判讀并計數(shù)粒-單核巨噬細胞集落（CFU-GM）數(shù)目，≥50個細胞群落為陽性克隆，結(jié)果以每單側(cè)股骨生成的CFU-GM數(shù)量表示［9］。

1.3.5 骨髓有核細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平檢測 調(diào)整骨髓細胞濃度為1×105/mL，細胞懸液與活性氧檢測探針（DCFHDA）以 1 000∶1的比例加入DCFH-DA，37℃水浴孵育 30 min，離心，棄上清，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌3次以洗去探針，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基將細胞懸起，流式細胞儀檢測平均熒光強度［10］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用GraphPad Prism 5.0進行統(tǒng)計分析，多組間比較采用方差分析，組間多重比較采用Tukey’s檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DIM對輻射損傷小鼠體質(zhì)量和臟器系數(shù)的影響 3組間體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組比較，照后7 d,2 Gy照射組小鼠胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），2 Gy照射+DIM組小鼠胸腺系數(shù)明顯高于2 Gy照射組（P＜0.05）；照后15 d時3組體質(zhì)量及臟器系數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

2.2 DIM對輻射損傷小鼠外周血象的影響 照后7 d和15 d,2 Gy照射組、2 Gy照射+DIM組白細胞和血小板數(shù)量均低于對照組；照后7 d，2 Gy照射+DIM組白細胞、血小板數(shù)量高于2 Gy照射組（均P＜0.05）。照后7 d，2 Gy照射組紅細胞數(shù)量低于對照組（P＜0.05），見表2。

2.3 DIM對輻射損傷小鼠造血功能的影響 照后7 d和15 d，2 Gy照射組、2 Gy照射+DIM組BMNCs數(shù)量和克隆形成數(shù)量均低于對照組，ROS水平高于對照組，2 Gy照射+DIM組BMNCs數(shù)量和克隆形成數(shù)量均高于2 Gy照射組，ROS水平低于2 Gy照射組（均P＜0.05），見表3。

Tab.1 Effects of DIM and radiation on the body weight and organ index in three groups表1 DIM及照射對小鼠體質(zhì)量和臟器系數(shù)的影響 （n=5，±s）

Tab.1 Effects of DIM and radiation on the body weight and organ index in three groups表1 DIM及照射對小鼠體質(zhì)量和臟器系數(shù)的影響 （n=5，±s）

＊P ＜ 0.05，＊＊P ＜ 0.01；a與對照組比較，b與 2 Gy照射組比較，P＜ 0.05；表 2、3同

組別對照組2 Gy照射組2 Gy照射+DIM組F體質(zhì)量（g）7 d 19.10±1.00 18.96±1.76 20.22±1.42 1.169 15 d 22.46±1.90 21.90±2.02 22.30±2.15 0.102胸腺系數(shù)（mg/g）7 d 2.43±0.23 1.13±0.20a1.50±0.19ab52.390＊＊15 d 1.88±0.20 1.48±0.19 1.86±0.49 2.489脾臟系數(shù)（mg/g）7 d 3.43±0.31 1.68±0.29a2.23±1.07 9.074＊＊15 d 2.56±0.34 2.41±0.19 2.46±0.26 0.402

Tab.2 Effects of DIM and radiation on the peripheral blood of three groups表2 DIM及照射對小鼠外周血的影響 （n=5，±s）

Tab.2 Effects of DIM and radiation on the peripheral blood of three groups表2 DIM及照射對小鼠外周血的影響 （n=5，±s）

組別對照組2 Gy照射組2 Gy照射+DIM組F白細胞（×109/L）7 d 8.44±0.95 2.62±0.22a3.74±0.55ab115.132＊＊15 d 7.30±1.56 2.98±0.46a4.58±0.63a23.471＊＊紅細胞（×1012/L）7 d 9.42±0.21 8.65±0.66a9.02±0.41 5.750＊15 d 9.23±0.29 8.74±0.46 9.14±0.24 2.546血小板（×109/L）7 d 714.16±87.40 339.82±43.86a550.43±50.67ab43.562＊＊15 d 801.19±53.41 602.61±54.69a689.56±62.08a15.334＊＊

Tab.3 Effects of DIM and radiation on the hematopoietic function in three gorups表3 DIM及照射對小鼠造血系統(tǒng)功能的影響 （n=5，±s）

Tab.3 Effects of DIM and radiation on the hematopoietic function in three gorups表3 DIM及照射對小鼠造血系統(tǒng)功能的影響 （n=5，±s）

組別對照組2 Gy照射組2 Gy照射+DIM組F BMNCs（×107/根股骨）7 d 2.51±0.08 1.48±0.37a2.09±0.24ab19.911＊＊15 d 2.86±0.17 2.09±0.18a2.42±0.22ab20.502＊＊ROS水平（平均熒光強度）7 d 21 228±1 338 40 261±5 734a31 504±3 896ab27.313＊＊15 d 23 744±1 230 29 746±1 881a26 134±2 678ab11.211＊＊克隆數(shù)目（個/105細胞）7 d 120.80±11.99 38.00±8.75a61.80±10.21ab93.020＊＊15 d 107.60±10.21 48.80±8.41a75.20±8.98ab50.887＊＊

3 討論

隨著我國國民經(jīng)濟的迅速發(fā)展，核能與核技術(shù)在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)療及軍事等國民經(jīng)濟各領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，核戰(zhàn)爭、涉核恐怖襲擊、地震或海嘯等引起核電站發(fā)生核泄露，臨床上對惡性腫瘤患者進行的放療以及管理不善或操作失誤等因素都可導(dǎo)致放射性工作相關(guān)的從業(yè)人員、放射事故時事故處理急救人員、軍隊相關(guān)人員以及廣大公眾受到照射而發(fā)生急性輻射損傷。為了減緩急性輻射損傷對人體的危害，研究輻射損傷的防治手段，特別是積極尋找有效的輻射防護藥物已成為減少急性輻射損傷和輻射損傷防護研究中迫切需要解決的問題和熱門研究課題之一。

急性電離輻射損傷根據(jù)受到輻射劑量的大小分為骨髓型、腸型和腦型。骨髓型輻射損傷以造血系統(tǒng)為主要關(guān)鍵病變［11］。造血系統(tǒng)對輻射高度敏感。機體受到輻射后，骨髓細胞的增殖、分裂功能受到損傷，導(dǎo)致血細胞來源減少，從而引起外周血象不同程度的變化［8］。本研究通過測定小鼠外周血常規(guī)的變化，觀察了輻射及DIM對小鼠造血功能的影響，研究結(jié)果顯示在2 Gy照射后，外周血白細胞和血小板數(shù)量與對照組相比均呈明顯減少趨勢，而DIM可以提高外周血白細胞總數(shù)和血小板數(shù)量，尤其是血小板數(shù)量有較大幅度升高，這可能與DIM能夠提高大劑量輻射損傷大鼠存活率相關(guān)［7］。

骨髓是對輻射高度敏感的組織，輻射引起骨髓損傷必將導(dǎo)致骨髓造血細胞的變化［12］。骨髓有核細胞水平的變化在一定程度上反映了骨髓的造血能力。本研究結(jié)果表明，C57BL/6小鼠照射后7 d和15 d，DIM可有效減輕小鼠骨髓造血損傷，對骨髓有核細胞有較好的保護作用。DIM能提高骨髓有核細胞數(shù)量，表明DIM對輻射損傷小鼠的造血組織有一定的保護作用。克隆形成實驗是功能實驗，可以檢測骨髓造血祖細胞的增殖能力。本研究顯示，應(yīng)用DIM后骨髓細胞克隆形成數(shù)量顯著提高，造血祖細胞增殖能力增強。電離輻射可以引起細胞內(nèi)ROS水平升高［13］。ROS是輻射引起造血細胞損傷的主要原因。本研究結(jié)果顯示DIM可以有效降低骨髓細胞的ROS水平，與之前亞致死劑量照射的研究結(jié)果一致［8］。

綜上，DIM對2 Gy電離輻射造成的小鼠造血功能損傷具有一定的保護作用，尤其是能提高骨髓有核細胞數(shù)量和骨髓細胞克隆形成能力，降低骨髓細胞內(nèi)的ROS水平。本研究僅從DIM對2 Gy電離輻射小鼠造血系統(tǒng)損傷的角度說明其具有一定的輻射損傷防護作用，但這種保護作用的作用機制及其是否與吲哚-3-甲醇其他衍生物具有協(xié)同作用還有待更深層次的研究。

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（2017-04-11收稿 2017-04-28修回）

（本文編輯 李國琪）

Protective effects of 3,3′-diindolylmethane on radiation damage of hematopoietic system in mice

DONG Jia-li,LU Lu,FAN Sai-jun△
Tianjin Key Laboratory of Radiation Medicine and Molecular Nuclear Medicine,Institute of Radiation Medicine,Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College,Tianjin 300192,China△

E-mail:fansaijun@irm-cams.ac.cn

ObjectiveTo investigate the protective effect of 3,3′-diindolylmethane(DIM)on radiation-induced injury in mouse hematopoietic system.MethodsThirty C57BL/6 mice were randomly divided into control group,2 Gy irradiation group and 2 Gy irradiation+DIM group(n=10 for each group).Mice of control group

sham irradiation,and the other two groups accepted 2 Gy137Cs γ-ray total body irradiation.Mice in 2 Gy irradiation+DIM group were intraperitoneally injected 75 mg/kg DIM 30 min before irradiation.Mice of other two groups were treated with reference solution.After 7 d and 15 d of 2 Gy irradiation,the peripheral blood samples were collected to count the number of bone marrow nuclear cells(BMNCs).The level of reactive oxygen species(ROS)was measured by DCFH-DA.The levels of colony forming unitsgranulocyte-macrophage(CFU-GM)were also detected.ResultsThe numbers of white blood cell(WBC),platelet count(PLT),BMNCs and CFU-GM were significantly decreased and the ROS level of bone marrow cells increased significantly in the irradiated group than those of control group(P＜0.05).Compared to 2 Gy irradiation group,the numbers of WBC,PLT,BMNCs and CFU-GM were significantly increased in 2 Gy irradiation+DIM group,and the level of ROS was decreased significantly(P＜0.05).ConclusionDIM has a protective effect on hematopoietic cells following radiation-induced injury,which may be related with the decreased ROS level.

radiation injuries;hematopoietic system;reactive oxygen species;bone marrow cells;mice,inbred C57BL;3,3′-diindolylmethane

R331.2

：A

10.11958/20170457

國家自然科學(xué)基金面上項目（81071906，81172127，81572969）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃青年項目（15JCQNJC46000）；“協(xié)和青年基金資助”和“中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金資助”（3332013044）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院“中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費”（2016RC310016）

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點實驗室（郵編300192）

董佳麗（1992），女，碩士在讀，主要從事輻射損傷防護藥物的機制研究

△通訊作者 E-mail:fansaijun@irm-cams.ac.cn