薛佩彤，張全勝，李欣，李宏△

依達(dá)拉奉對不同冷缺血時間大鼠移植供肝JAK2/STAT3信號通路的影響

薛佩彤1，張全勝2，李欣3，李宏3△

目的探討依達(dá)拉奉對不同冷缺血時間大鼠移植供肝缺血再灌注損傷（IRI）后JAK2/STAT3信號通路的影響。方法SD大鼠102只，隨機分為假手術(shù)組、對照組及實驗組。假手術(shù)組6只，游離肝臟，不進行移植；對照組及實驗組各48只，2組各自按照不同冷缺血時間30 min、6 h、12 h、18 h分為4個處理亞組，每處理組供體、受體各6只。采用改良的“二袖套法”建立大鼠原位肝移植模型，供體采用腹主動脈灌注法，熱缺血時間為3～5 min。供肝在不同冷缺血時間后，實驗組分別于新肝血管開放前5 min經(jīng)鼠尾靜脈注射依達(dá)拉奉3 mg/kg；對照組分別注射生理鹽水3 mg/kg。各組受體均于6 h后處死取材。采用實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測受體供肝組織中JAK2和STAT3 mRNA的相對表達(dá)量。結(jié)果內(nèi)參基因GAPDH與檢測基因JAK2、STAT3擴增良好；在同一冷缺血時間，與對照組比較，實驗組大鼠供肝基因JAK2/STAT3相對表達(dá)量均明顯降低（P＜0.05）；隨冷缺血時間延長，對照組JAK2、STAT3 mRNA和實驗組STAT3 mRNA相對表達(dá)量均呈逐漸降低趨勢，而實驗組JAK2 mRNA相對表達(dá)量呈先增后降趨勢（P＜0.05）。結(jié)論依達(dá)拉奉對不同冷缺血時間移植供肝具有一定的保護作用。依達(dá)拉奉可延長供肝冷缺血時間至18 h，其機制可能與抑制肝細(xì)胞JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

肝移植；活體供者；冷缺血；再灌注損傷；疾病模型，動物；大鼠,Sprague-Dawley；JAK2/STAT3；依達(dá)拉奉

目前，肝移植已成為治療終末期肝病患者的有效方式之一［1］。通常情況下，在手術(shù)中，供體的肝臟要經(jīng)過熱缺血、冷缺血及植入受體等多個重要環(huán)節(jié)，這就不可避免地會發(fā)生肝臟的缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI），而其中冷缺血作為器官保存的主要不利因素直接影響了供肝的存活質(zhì)量。既往研究認(rèn)為，肝臟缺血后再灌注產(chǎn)生的過量氧自由基是引起肝臟IRI的主要原因［2］。依達(dá)拉奉（Edaravone，MCI-186）作為一種新的氧自由基清除劑，具有抗氧化作用，能夠減輕多種再灌注損傷，臨床中最早用于缺血性腦血管疾病的防治［3］。本研究通過建立不同冷缺血時間下供肝移植大鼠的體內(nèi)實驗?zāi)Ｐ停绕涫轻槍﹂L時間冷缺血的肝臟供體，觀察依達(dá)拉奉的作用結(jié)果并探討其可能機制，為臨床合理把握移植供肝冷缺血的安全時限提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 （1）實驗動物。成年、健康、SPF級近交系、雄性SD大鼠102只（中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心），體質(zhì)量260～300 g，月齡3～4個月。普通喂養(yǎng)于層流動物房內(nèi)，室溫20～25℃。（2）主要試劑及儀器。氯化鈉注射液（0.9%，CISEN 辰欣?；國藥準(zhǔn)字 H20013310）、依達(dá)拉奉注射液（1.5 g/L，積華尤敏?，國藥準(zhǔn)字H20080495）、Belzer UW液（北京慧鑫清源科技發(fā)展有限公司）、電泳緩沖液（TAE，北京Biotopped公司）、TriPure分離試劑盒（瑞士Roche）、脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseΙ，美國 NEB），cDNA 合成試劑盒、qPCR混合合成試劑盒、qPCR引物試劑盒（美國GeneCopoeia），實時熒光定量 PCR 系統(tǒng)（美國 ABI），8000超微分光光度計（美國Thermo），PCR儀（日本Takara）。

1.2 實驗分組 大鼠按隨機數(shù)字表法分組。假手術(shù)組6只，只游離肝臟，不進行移植。對照組和實驗組96只，2組均各自再分為4個處理亞組，每處理組供體（體質(zhì)量小者）、受體大鼠各6只，分別于30 min、6 h、12 h及18 h作相應(yīng)冷缺血處理：冷缺血30 min，受體肝臟切除后立即將供肝植入受體；冷缺血6 h，切取供肝冷保存6 h后行肝移植術(shù)；冷缺血12 h，切取供肝冷保存12 h后行肝移植術(shù)；冷缺血18 h，切取供肝冷保存18 h后行肝移植術(shù)。另外選取若干體質(zhì)量范圍內(nèi)的大鼠備用，以作為在實驗過程中出現(xiàn)手術(shù)模型失敗后每組大鼠數(shù)量的補充。

1.3 操作與干預(yù) 供體大鼠術(shù)前不禁食水；受體大鼠術(shù)前禁食12 h，自由飲水。采用5%水合氯醛（0.7 mL/100 g）腹腔注射麻醉。供體采用腹主動脈灌注法，熱缺血時間控制在3～5 min，供肝切取后立即保存在4℃的UW器官保存液（the University of Wisconsin solution，UW液）中，參照改良的“二袖套法”建立原位肝移植模型［4－5］。對照組對 30 min、6 h、12 h、18 h 4個不同冷缺血時間各移植后大鼠均分別于新肝血管開放前5 min，經(jīng)鼠尾靜脈注射生理鹽水3 mg/kg；實驗組則分別于新肝血管開放前5 min經(jīng)鼠尾靜脈注射依達(dá)拉奉注射液3 mg/kg。所有受體大鼠均在移植6 h后處死，取移植肝組織標(biāo)本進行檢測；假手術(shù)組不經(jīng)處理，直接取肝組織作為參照。

1.4 RNA提取和分離 按照Trizol法操作說明進行RNA的抽提，取約80～100 mg肝組織進行液氮研磨處理，經(jīng)過分離、沉淀、洗滌、溶解后-70℃保存，用分光光度計測定RNA的濃度及純度。配制1%的TAE瓊脂凝膠、制備膠板、加樣、調(diào)整電壓為10 V/cm進行RNA電泳，結(jié)束后在紫外燈下以DL2000 DNA Marker觀察。每一樣本總RNA均取2 μL去除污染DNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)cDNA首鏈合成說明操作，反轉(zhuǎn)錄后-20℃保存。

1.5 定量 PCR檢測 反應(yīng)體系 20 μL：2×All-in-OneTM qPCR Mix 10 μL，All-in-OneTM qPCR Primer（2 μmol/L）2 μL，cDNA（1∶8 稀釋）2 μL，ddH2O 6 μL。短暫離心，標(biāo)準(zhǔn)程序進行反應(yīng)，擴增條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸15 s，循環(huán)40次。PCR反應(yīng)后，72～95℃，0.5℃溫度間隔，每10 s測定光密度（OD）值并進行熔解曲線分析，ABI 7500 Software v2.0.1軟件測各組Ct值。引物由廣州易錦生物有限公司合成，引物序列見表1。以GAPDH作為內(nèi)參，假手術(shù)組所得Ct值作為正常標(biāo)準(zhǔn)值，將目的基因的 Ct值進行相對表達(dá)量 2-ΔΔCt計算［6］分析各組檢測供肝JAK2和STAT3 mRNA的表達(dá)。

Tab.1 RT-PCR primer sequence表1RT-PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以±s表示，2組間比較采用t檢驗；組內(nèi)多時點比較采用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 定量PCR檢測結(jié)果 OD260/OD280均在1.7～2.0內(nèi)，表示提取的RNA純度較高；瓊脂糖凝膠電泳可見28 s、18 s兩條較清晰的條帶，無其他雜帶，其中28 s條帶亮度約為18 s條帶的2倍，說明被檢組織PCR產(chǎn)物RNA完整，沒有降解，見圖1。其次，內(nèi)參基因GAPDH與檢測基因JAK2、STAT3擴增曲線良好，呈“S型”，均得到Ct值；各基因產(chǎn)物熔解曲線均為單峰形狀，表明呈特異性擴增，見圖2。

2.2 2組JAK2、STAT3 mRNA相對表達(dá)量比較 同一冷缺血時間下，與對照組相比，實驗組基因JAK2/STAT3相對表達(dá)量均降低（P＜0.05）；隨冷缺血時間延長，對照組JAK2、STAT3 mRNA和實驗組STAT3 mRNA相對表達(dá)量均呈逐漸降低趨勢，而實驗組JAK2 mRNA相對表達(dá)量呈先增后降趨勢（P＜0.05），見表 2。

Fig.1 Total RNA agarose gel electrophoresis image of control group and experimental group圖1 對照組和實驗組總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

Fig.2 Amplification plot and dissolution melt curve of gene GAPDH，JAK2 and STAT3圖2 基因GAPDH、JAK2、STAT3的擴增曲線和熔解曲線圖

3 討論

肝臟是人體最大的代謝性器官，目前肝移植仍然是治療終末期肝病的唯一有效途徑［2］。早期研究顯示，與有心跳或活體親屬供肝移植相比較，心臟死亡供體（Donate after cardiac death，DCD）術(shù)后原發(fā)性移植功能障礙（Primary graft dysfunction，PGD）的發(fā)生率明顯更高，IRI可能是影響肝移植患者預(yù)后的主要風(fēng)險因素［7］。研究認(rèn)為，在手術(shù)過程中，首先影響供體器官的就是冷缺血時間，而實際上，組織或器官在缺血期形成的可逆性損傷在恢復(fù)血流后的進一步加重或者轉(zhuǎn)化為不可逆損傷的過程即為再灌注損傷，因此，一定程度上來說，IRI依賴于缺血時間［8］。

3.1 冷缺血安全時限的研究現(xiàn)狀 一般認(rèn)為，冷缺血是移植器官保存的不利因素之一［1］。在臨床開展肝移植初期認(rèn)為，熱缺血時間為5 min時，供肝在UW 液中冷缺血保存的時間不應(yīng)超過 8 h［9］。Monbaliu等［10］進行的豬原位肝移植實驗顯示，熱缺血15 min時，為避免術(shù)后早期膽管壞死，DCD供肝冷缺血時間最長不應(yīng)超過8 h。楊士明［11］研究認(rèn)為，供肝冷保存12 h內(nèi)，可有效降低肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的發(fā)生。另外，Sibulesky等［12］總結(jié)了350例肝移植術(shù)后患者資料，認(rèn)為長時間的冷缺血可導(dǎo)致患者早期出現(xiàn)同種異體移植功能障礙，但冷缺血時間在8～12 h時，對移植器官或患者生存率并無太大影響。因此，目前針對供肝耐受冷缺血的時限范圍仍無統(tǒng)一的認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)。本實驗通過建立大鼠不同冷缺血時間的模型，在供肝血管開放前使用依達(dá)拉奉進行干預(yù)，結(jié)果顯示，隨著冷缺血時間的延長，依達(dá)拉奉可降低JAK2/STAT3的表達(dá)，并可延長冷缺血時間至18 h。

Tab.2 Comparison of relative expression of JAK2 and STAT3 mRNA between two groups表22組JAK2、STAT3 mRNA相對表達(dá)量比較（n=6，±s）

Tab.2 Comparison of relative expression of JAK2 and STAT3 mRNA between two groups表22組JAK2、STAT3 mRNA相對表達(dá)量比較（n=6，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與 30 min 比較，b與 6 h 比較，c與 12 h 比較，P＜0.05

組別對照組實驗組t組別對照組實驗組t 30 min 10.70±1.72 3.96±0.72 8.87＊＊12 h 5.85±1.08ab3.69±1.22ab3.26＊18 h 5.01±1.25abc2.19±0.45abc5.20＊F 24.08＊＊16.45＊＊30 min 5.10±0.64 3.12±0.37 6.63＊＊JAK2 6 h 7.34±0.76a5.55±0.74a4.14＊STAT3 6 h 4.33±0.89a3.10±0.70a2.68＊12 h 3.77±0.59ab2.75±0.80ab2.52＊18 h 3.00±0.32abc1.70±0.45abc5.70＊＊F 11.56＊＊7.15＊

3.2 依達(dá)拉奉對JAK2/STAT3信號通路的影響 JAK/STAT信號通路是近年來研究較多的由細(xì)胞因子刺激引發(fā)的一條細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，分別由JAKs和STATs蛋白家族組成，參與了細(xì)胞增殖、分化、凋亡和免疫應(yīng)答等多種生物過程，JAK2/STAT3是其中一種［13］。JAK2/STAT3信號通路主要活化過程為：酪氨酸激酶相關(guān)配體與受體結(jié)合使受體二聚體化激活 JAKs，JAKs作為 STATs的上游激酶將STATs磷酸化，STATs形成二聚體使進入細(xì)胞核的信號暴露，隨后調(diào)節(jié)下游的基因表達(dá)［14］。

在肝移植手術(shù)進行至再灌注期時，缺血后再開放血流，炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、活性氧等大量產(chǎn)生，這些細(xì)胞因子可作為配體與其胞內(nèi)相應(yīng)受體結(jié)合發(fā)生二聚體化，JAKs則與二聚體化的受體的功能區(qū)結(jié)合發(fā)生磷酸化進而被激活，而STATs則作為JAKs的底物進一步被激活轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控下游的基因轉(zhuǎn)錄，最終發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。有研究指出，由于Bcl-2和Bax是抗細(xì)胞凋亡的重要基因，STAT1、STAT3的過量活化能降低Bcl-2、Bax的表達(dá)，進而加劇細(xì)胞凋亡［15］。Hayashi等［16］認(rèn)為依達(dá)拉奉不僅能夠清除氧自由基，而且可以抑制Fas誘導(dǎo)的線粒體凋亡通路；抑制中性粒細(xì)胞浸潤及炎癥因子表達(dá)。藍(lán)柳根等［17］研究認(rèn)為，依達(dá)拉奉能夠抑制與炎性因子及氧化應(yīng)激相關(guān)的胞內(nèi)JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而減輕大鼠肝移植的IRI。與既往研究結(jié)果相符，本研究結(jié)果表明：同一冷缺血時間下，實驗組中的JAK2/STAT3 mRNA相對表達(dá)量明顯低于對照組，表明其表達(dá)通路受到了抑制；隨冷缺血時間延長，對照組JAK2、STAT3 mRNA和實驗組STAT3 mRNA相對表達(dá)量均逐漸減少；實驗組JAK2 mRNA相對表達(dá)量則先增加后減少；而實驗組中JAK2/STAT3 mRNA相對表達(dá)量整體下降的趨勢比對照組更加明顯。由此筆者推斷，依達(dá)拉奉能夠通過抑制JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而延長大鼠移植供肝冷缺血時間，進一步減輕大鼠移植供肝的IRI，減輕肝細(xì)胞損傷，適當(dāng)保護長時間冷缺血的供體肝臟。其次提示，供體肝臟JAK2與STAT3 mRNA的表達(dá)受冷缺血時間的影響，實驗組在冷缺血6 h時出現(xiàn)JAK2的表達(dá)量較30 min時增加，這可能與依達(dá)拉奉作用于JAK2的藥代動力學(xué)相關(guān)，但其具體機制還有待進一步研究。同時，本研究參照文獻(xiàn)［4－5］選擇改良后的“二袖套法”進行大鼠原位肝移植，在冷缺血30 min對照組中，JAK2的表達(dá)量明顯較高，這不排除在實驗起初由于人為操作的因素導(dǎo)致移植模型不穩(wěn)定，引起結(jié)果可能出現(xiàn)了相對誤差。另外，我國肝病患者居多，臨床供體短缺、受體需求擴大以及供肝普遍要經(jīng)歷長時間的保存和較遠(yuǎn)距離的運送，因此保證移植供肝在冷缺血的安全時限內(nèi)仍然是肝移植手術(shù)中亟待解決的主要問題之一。目前UW液已作為移植器官的最佳保護液，術(shù)前可再通過藥物干預(yù)保護［18］。但是，在本實驗中只是將供肝冷缺血的最長時間設(shè)定為18 h進行大鼠肝臟移植，而能否通過干預(yù)進一步保護更長時間冷缺血的供體還有待進一步的探究。

綜上所述，依達(dá)拉奉對長時間的冷缺血供肝具有一定的保護作用，在熱缺血時間控制在3～5 min時，依達(dá)拉奉作用于供肝冷缺血時間可延長至18 h，這一作用機制可能與其可調(diào)控JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)。

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（2017-02-13收稿 2017-04-05修回）

（本文編輯 陸榮展）

Effects of edaravone on JAK2/STAT3 signaling pathway in transplanted donor liver of rats with different cold ischemia times

XUE Pei-tong1,ZHANG Quan-sheng2,LI Xin3,LI Hong3△
1 Gansu University of Chinese Medicine,Gansu 730030,China;2 Tianjin Key Laboratory of Organ Transplantation;3 Department of Anesthesiology,the Affiliated Hospital of Logistics College of the Chinese People’s Armed Police Force△

E-mail:fch6161@sina.com

ObjectiveTo investigate the effect of edaravone on the JAK2/STAT3 signaling pathway after ischemiareperfusion injury in donor rat liver under different cold ischemia times.MethodsA total of 102 SD rats were randomly divided into sham operation group，control group and experimental group.Six rats were in sham operation group with free liver operation and no transplantation.Forty-eight rats were in control group and experimental group respectively,and divided into subgroups according to the different cold ischemia times(30 min,6 h,12 h and 18 h).There were 6 donors and 6 recipients in each group.The rat model of orthotopic liver transplantation was established by modified"two cuff method".All the donors were perfused by abdominal aorta and the warm ischemia time was 3-5 min.After different cold ischemia times,the experimental group was treated with edaravone(3 mg/kg)at 5 min before the opening of the new hepatic artery,and control group was injected with 3 mg/kg saline.Recipients of each group were sacrificed after 6 h.Finally,real-time fluorescence quantitative PCR was used to analyze the relative expression of JAK2/STAT3 mRNA of donor liver.ResultsThe GAPDH gene and JAK2/STAT3 were well amplified.Under the same cold ischemia time,compared with the control group,the relative expression of JAK2/STAT3 was significantly decreased in the experimental group(P＜0.05).With the prolongation of cold ischemia time,the relative expressions of JAK2 and STAT3 mRNA showed a decreasing trend in control group and experimental group,while the relative expression of JAK2 mRNA increased first and then decreased in the experimental group(P＜0.05).ConclusionEdaravone has a protective effect on transplanted donor liver during differentcold ischemia times,and extends the cold ischemia time for 18 h,which may be related to the inhibition of JAK2/STAT3 signal transduction pathway.

liver transplantation；living donors；cold ischemia；reperfusion injury；disease models,animal；rats,Sprague-Dawley；JAK2/STAT3；edaravone

R657.3

：A

10.11958/20170174

武警醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院種子基金（FYM201102）

1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)（郵編730030）；2天津市器官移植重點實驗室；3武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉一科

薛佩彤（1990），女，碩士在讀，主要從事肝臟保護方面研究

△通訊作者 E-mail：fch6161@sina.com