李廣闊，趙文，劉勇

高濃度葡萄糖對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中g(shù)hrelin表達(dá)的影響

李廣闊，趙文，劉勇△

目的探討葡萄糖對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）中g(shù)hrelin表達(dá)的影響。方法體外培養(yǎng)HUVECs，經(jīng)過12 h無糖培養(yǎng)后分別觀察不同濃度葡萄糖和不同培養(yǎng)時(shí)間對ghrelin表達(dá)的影響。（1）細(xì)胞經(jīng)0、5、10、15、20 mmol/L葡萄糖處理2 h，RT-PCR法測定ghrelin mRNA表達(dá)水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測定細(xì)胞裂解液及培養(yǎng)上清中 ghrelin 蛋白水平。（2）細(xì)胞以 10 mmol/L 葡萄糖處理 0、0.5、1、2、6、12 h 后，測定 ghrelin mRNA 及其蛋白表達(dá)情況。結(jié)果（1）隨著葡萄糖濃度的升高，ghrelin mRNA及蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)下降，但當(dāng)葡萄糖濃度大于15 mmol/L時(shí)，繼續(xù)增加葡萄糖濃度對ghrelin mRNA及蛋白表達(dá)無明顯影響。（2）在10 mmol/L葡萄糖作用下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，ghrelin mRNA及蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)下降，當(dāng)超過6 h后，繼續(xù)增加作用時(shí)間對ghrelin mRNA及蛋白表達(dá)無明顯影響。結(jié)論高濃度葡萄糖可抑制ghrelin的表達(dá)，可能是發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制之一。

動(dòng)脈粥樣硬化；葡萄糖；ghrelin；臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

Ghrelin是胃部分泌的一種肽類激素，作為生長激素促分泌受體的內(nèi)源性配體而存在。研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞也能合成并分泌ghrelin，并且ghrelin可以抑制心力衰竭患者心肌細(xì)胞的凋亡，提高左心室功能，延緩心臟惡病質(zhì)［1-2］。在心肌梗死動(dòng)物模型中，ghrelin對心臟重塑的調(diào)節(jié)具有重要作用，可以抑制心室的擴(kuò)張［3］。同時(shí)ghrelin也可作為預(yù)測動(dòng)脈粥樣硬化（AS）的一項(xiàng)指標(biāo)［4］。機(jī)體持續(xù)的高血糖同樣是AS的危險(xiǎn)因素，血管內(nèi)皮細(xì)胞在高血糖的影響下可出現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及功能紊亂，但是AS具體的發(fā)生機(jī)制仍不明確，是否因?yàn)槭hrelin的保護(hù)作用而發(fā)生尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究高糖對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）中g(shù)hrelin表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探討高血糖導(dǎo)致AS的發(fā)生機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 HUVECs及其相應(yīng)的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、無糖培養(yǎng)基、胎牛血清、非必需氨基酸均購自國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)，L-谷氨酰胺、0.25%胰酶消化液購自索萊寶，5%葡萄糖購自大連大冢制藥，肝素購自萬邦醫(yī)藥，胰島素購自諾和諾德，青霉素/鏈霉素購自Gibco，RNA提取試劑盒購自美國Qiagen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司，人 ghrelin酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購自CUSABIO公司，PCR引物由北京奧科公司合成。顯微鏡購自O(shè)lympus公司，PCR儀購自AB公司，酶標(biāo)儀購自Tecan公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取1 mL HUVECs復(fù)蘇后，加入到8 mL完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、4×10-5U/L胰島素、40 U/mL肝素、1%非必需氨基酸的DMEM培養(yǎng)基）中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，次日全量更換培養(yǎng)基1次。待細(xì)胞生長至80%～90%融合時(shí)，0.25%胰酶消化，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1次后以1∶2或1∶3的比例傳代培養(yǎng)。

1.3 不同濃度葡萄糖和不同培養(yǎng)時(shí)間對ghrelin表達(dá)的影響 （1）取對數(shù)生長期細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞1次，更換無糖DMEM 培養(yǎng) 12 h。然后分別以 0、5、10、15、20 mmol/L 葡萄糖干預(yù)2 h，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，收集培養(yǎng)的細(xì)胞及培養(yǎng)基上清用于后續(xù)檢測。（2）無糖DMEM培養(yǎng)HUVECs 12 h后，以 10 mmol/L 葡萄糖分別干預(yù) 0、0.5、1、2、6、12 h 后收集培養(yǎng)的細(xì)胞及培養(yǎng)基上清備用，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.4 半定量RT-PCR檢測ghrelin mRNA表達(dá) 處理結(jié)束后以預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，按照試劑盒說明提取細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)NCBI給出的ghrelin基因序列，利用Oligo 6軟件設(shè)計(jì)RT-PCR引物，并在NCBI上進(jìn)行BLAST驗(yàn)證其特異性。ghrelin引物：上游5′-CCCACAAGCCTTACCACCTC-3′，下游 5′-CCTCTTTGGCCTCTTCCCAG-3′。內(nèi)參 β-actin引物：上游5′-GGTCAGAAGGATTCCTATGTG-3′，下游 5′-ATTGCCAATGGTGATGACCTG-3′。PCR 反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 2 μL（10 mmol/L），上、下游引物各 0.5 μL（0.2 μmol/L），TakaraEXTaqHS 0.5 μL，cDNA模板 5 μL，RNase Free dH2O 補(bǔ)足至 50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，25 個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，利用凝膠成像儀成像，Image lab分析目的條帶灰度值，以ghrelin/β-actin表示ghrelin相對表達(dá)量。

1.5 ELISA檢測ghrelin蛋白水平 將1.3中收集的細(xì)胞以預(yù)冷的PBS洗滌1次后重懸，加入1%PMSF于冰上超聲裂解，4℃10 000×g離心15 min，收集上清，將細(xì)胞裂解液與培養(yǎng)基上清按照ELISA試劑盒說明書設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣本孔。每孔分別加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣本100 μL，于37℃溫育2 h；隨后棄去液體，甩干，加生物素標(biāo)記抗體工作液100 μL，于37℃孵育1 h，洗滌3次。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100 μL，37℃溫育1 h，洗滌5次。加入底物溶液90 μL，37℃避光顯色 15～30 min，終止液終止顯色。酶標(biāo)儀記錄450 nm處的吸光度（A）值，620 nm作為校正。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度葡萄糖對ghrelin mRNA及蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果顯示，不同濃度葡萄糖對ghrelin mRNA及蛋白表達(dá)水平有影響（F分別為68.871、29.870，均P＜0.01）。隨著葡萄糖濃度上升，ghrelin mRNA及蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)下降，但當(dāng)葡萄糖濃度大于15 mmol/L時(shí)，繼續(xù)增加葡萄糖濃度對ghrelin mRNA及蛋白表達(dá)無明顯影響。由于培養(yǎng)上清中g(shù)hrelin含量極低，不同濃度葡萄糖處理后ghrelin蛋白表達(dá)水平無明顯差異（F=6.486）。見圖1、2。

2.2 不同處理時(shí)間對ghrelin mRNA及蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果顯示，不同處理時(shí)間對ghrelin mRNA及蛋白的表達(dá)有影響（F分別為51.76和147.00，均P＜0.01）。10 mmol/L葡萄糖作用下，與0 h組相比，處理1 h后ghrelin mRNA及蛋白表達(dá)水平下降（P＜0.01），隨著處理時(shí)間的延長，ghrelin mRNA及蛋白表達(dá)水平繼續(xù)下降，當(dāng)超過6 h后，繼續(xù)增加作用時(shí)間對ghrelin mRNA及蛋白表達(dá)無明顯影響。10 mmol/L葡萄糖處理不同時(shí)間后培養(yǎng)基上清中g(shù)hrelin蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.738），見圖 3、4。

3 討論

Ghrelin最初被認(rèn)為與調(diào)節(jié)食欲有關(guān)，近年來ghrelin在心血管系統(tǒng)疾病中的作用被逐步發(fā)現(xiàn)。Kotani等［5］研究顯示，血清ghrelin水平的降低與頸動(dòng)脈內(nèi)膜和中膜厚度增加有關(guān)。V?r?s等［6］發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化患者ghrelin?；匠霈F(xiàn)下降，并且ghrelin的水平是由胰島素水平?jīng)Q定的，可見ghrelin水平可能是預(yù)測冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的一項(xiàng)新型指標(biāo)。

在健康人中，血液循環(huán)中的ghrelin能夠影響葡萄糖耐量，同時(shí)刺激胰島素分泌［7］。在對2型糖尿病大鼠的胃組織檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著糖尿病病程的延長，ghrelin免疫陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，ghrelin水平顯著升高［8］。Ghrelin被認(rèn)為有抗炎作用，能夠抑制HUVECs中細(xì)胞因子的釋放，激活核因子（NF）-κB和單核細(xì)胞，而這一作用可以認(rèn)為是干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化的切入點(diǎn)［9］。然而，ghrelin對血糖的影響機(jī)制尚不明確，結(jié)論尚存在爭議［10］。

Fig.1 Effects of different doses of glucose on expression levels of ghrelin mRNA圖1 不同濃度葡萄糖對ghrelin mRNA表達(dá)的影響

Fig.2 Effects of different doses of glucose on expression levels of ghrelin protein圖2 不同濃度葡萄糖對ghrelin蛋白表達(dá)的影響

Fig.3 Effects of different time points of glucose on expression levels of ghrelin mRNA圖3 不同葡萄糖作用時(shí)間對ghrelin mRNA表達(dá)的影響

Fig.4 Effects of different time points of glucose on expression levels of ghrelin protein圖4 不同葡萄糖作用時(shí)間對ghrelin蛋白表達(dá)的影響

本研究通過觀察不同葡萄糖濃度和不同干預(yù)時(shí)間對ghrelin表達(dá)的影響，前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)血糖濃度大于25 mmol/L時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)了部分死亡。同時(shí)趙宏等［11］發(fā)現(xiàn)33.3 mmol/L葡萄糖干預(yù)72 h會(huì)顯著引起血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，因此考慮將葡萄糖干預(yù)濃度范圍確定在0～20 mmol/L。為充分模擬糖尿病患者餐后2 h血糖水平［12］，筆者觀察了10 mmol/L葡萄糖干預(yù)不同時(shí)間對ghrelin的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著葡萄糖濃度的升高以及干預(yù)時(shí)間的延長，HUVECs中g(shù)hrelin表達(dá)呈動(dòng)態(tài)下降，但當(dāng)葡萄糖濃度＞15 mmol/L、干預(yù)時(shí)間＞6 h后，ghrelin下降不顯著。筆者推測可能是HUVECs中存在其他途徑能夠拮抗高糖的抑制作用。

目前ghrelin在心血管，尤其是AS相關(guān)疾病中的保護(hù)作用日漸凸顯。而高糖抑制ghrelin，使得心血管喪失其保護(hù)作用，可能是糖尿病導(dǎo)致AS的原因之一。遺憾的是本文沒有進(jìn)一步觀察濃度和時(shí)間的交互作用，需體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證ghrelin對心血管的影響。

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（2017-02-04收稿 2017-05-03修回）

（本文編輯 胡小寧）

The effect of high-level of glucose on ghrelin expression in human umbilical vein endothelial cells

LI Guang-kuo,ZHAO Wen,LIU Yong△
Department of Cardiology,Tianjin Fourth Center Hospital,Tianjin 300140,China△

E-mail:13820788667@163.com

ObjectiveTo investigate the influence of high-level of glucose on the expression of ghrelin in human umbilical vein endothelial cells(HUVECs).MethodsAfter 12 h glucose free culturing,the effects of different concentrations of glucose and different incubation times on expressions of ghrelin were observed in HUVECs.(1)The cells were treated with 0,5,10,15,20 mmol/L glucose for 2 h,then ghrelin mRNA expression levels were detected by RT-PCR,and the protein levels of ghrelin were detected by ELISA.(2)The cells were treated with 10 mmol/L glucose for 0,0.5,1,2,6,12 hours,ghrelin mRNA and protein levels were detected respectively.Results(1)The expression levels of ghrelin mRNA and protein decreased along with increased glucose concentrations,which showed no obvious changes when the glucose was above 15 mmol/L.(2)The expression levels of ghrelin mRNA and protein decreased with the prolonged incubation time.But more than 6 h culturing time showed no further effect on reducing the expression level of ghrelin.ConclusionHigh levels of glucose can inhibit the expression level of ghrelin,which may be one of the mechanisms of atherosclerosis.

atherosclerosis;glucose;ghrelin;umbilical vein endothelial cell

R543.3

：A

10.11958/20170146

天津市第四中心醫(yī)院心內(nèi)科（郵編300140）

李廣闊（1980），男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事心力衰竭、冠心病介入治療等方面研究

△通訊作者 E-mail:13820788667@163.com