關(guān)勇，孟慶婭，徐國棟，張富義，舒劍波

兔口腔黏膜上皮細(xì)胞與PCL電紡纖維的復(fù)合尿道支架的制備及可行性分析

關(guān)勇，孟慶婭，徐國棟，張富義，舒劍波

目的探討兔口腔黏膜上皮細(xì)胞與聚己內(nèi)酯（PCL）電紡纖維的復(fù)合支架用于尿道修復(fù)的可行性。方法用三氯甲烷和無水甲醇體積比5∶1的混合液配制25%PCL混合液，通過靜電紡絲得到PCL纖維管狀支架，在其管腔內(nèi)種植1.5×105個(gè)兔口腔黏膜上皮細(xì)胞，然后埋入裸鼠皮下，2周后取出，通過HE和細(xì)胞角蛋白抗體免疫熒光染色對該復(fù)合尿道支架進(jìn)行生物學(xué)評價(jià)。未種植兔口腔黏膜上皮細(xì)胞的PCL管為對照組，其評價(jià)方法同上。結(jié)果與對照組比較，種植兔口腔黏膜上皮細(xì)胞的PCL管展現(xiàn)出良好的細(xì)胞化，并且兔口腔黏膜上皮細(xì)胞在PCL管腔表面形成了一層致密的細(xì)胞層，兔口腔黏膜上皮細(xì)胞能夠在PCL管腔表面存活增殖。結(jié)論兔口腔黏膜上皮細(xì)胞可以作為組織工程化尿道支架的種子細(xì)胞來源之一，其與PCL電紡纖維相結(jié)合，可以構(gòu)建適合于尿道修復(fù)需要的組織工程替代材料。

口腔黏膜；上皮細(xì)胞；組織工程；聚己內(nèi)酯；尿道支架；靜電紡絲

尿道損傷、狹窄或缺損主要由于外傷或腫瘤、先天畸形、炎癥等所致，需要進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)與重建，長段狹窄或大面積的缺損往往需要替代材料，臨床上常因缺乏理想的材料或替代選擇不當(dāng)導(dǎo)致重建手術(shù)遇到困難，甚至失敗，因而尿道修復(fù)重建成為泌尿外科、兒科和整形外科面臨的難題［1］。隨著組織工程技術(shù)的快速發(fā)展，可降解高分子材料逐漸成為尿道修復(fù)材料的研究熱點(diǎn)［2］。聚己內(nèi)酯［Poly（εcaprolactone），PCL］是由 ε-己內(nèi)酯開環(huán)聚合所得到的線性脂肪族聚酯，具有良好的生物降解性、力學(xué)性能、藥物通過性［3］，但PCL缺乏生物活性?？谇火つど掀ぜ?xì)胞因與尿道黏膜細(xì)胞同屬上皮組織中的被覆上皮，在尿液環(huán)境中有向尿路上皮轉(zhuǎn)化的潛能［4］，并且有取材方便、創(chuàng)傷小、上皮細(xì)胞層厚、組織韌性強(qiáng)、抗感染能力較強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，成為理想的尿道修復(fù)種子細(xì)胞［5］。本研究以PCL為材料，通過靜電紡絲制備PCL纖維尿道支架，與兔口腔黏膜細(xì)胞相結(jié)合，構(gòu)建種子細(xì)胞與可降解高分子材料復(fù)合的尿道支架，并對其細(xì)胞浸潤、血管形成以及兔口腔黏膜上皮細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動物。清潔級（CL）雄性裸鼠8只，體質(zhì)量20～25 g，購自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心；兔口腔黏膜上皮細(xì)胞，購自齊氏生物科技公司。（2）主要試劑及儀器。PCL顆粒（數(shù)均分子量為80 000）和MTT購自美國Sigma公司；三氯甲烷和無水甲醇購自天津化學(xué)試劑六廠；一抗：細(xì)胞角蛋白抗體（Rabbit Anti-Cytokeratin 19），工作濃度 1∶100，購自武漢博士德公司；二抗：Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG，工作濃度為 1∶200，購自Invitrogen。掃描電子顯微鏡（SEM，型號QUANTA 200，美國FEI公司），高級正置熒光顯微鏡（型號Axio Imager Z1，德國ZEISS公司），正置顯微鏡（型號Leica DM3000，德國Leica公司），多功能酶標(biāo)儀（美國PerkinElmer LLC）。

1.2 PCL纖維支架的制備 將PCL顆粒溶于三氯甲烷和無水甲醇（體積比為5∶1）的混合溶液中制成250 g/L的PCL電紡液。將PCL電紡液倒入10 mL的注射器內(nèi)，注射器頂端為21 G不銹鋼針頭。針頭與高壓電源的輸出端相連，接收器為旋轉(zhuǎn)的不銹鋼棒，直徑為2.5 mm（用于尿道管支架）和15 cm（用于紡膜），噴射速度8 mL/h，發(fā)射器與接收器的距離為15 cm，電壓為14 kV。制備尿道管支架的紡絲時(shí)間為4 min，制備膜支架的紡絲時(shí)間為30 min。將制得的PCL支架置于真空干燥箱內(nèi)干燥48 h后備用。將得到的PCL尿道管支架噴金處理后，通過掃描電鏡觀察其橫截面及內(nèi)腔纖維排布情況。

1.3 細(xì)胞相容性檢測 將PCL電紡膜裁成直徑為1 cm的圓片，正面朝上放入48孔板中，用直徑為9 mm的塑料環(huán)固定PCL膜片。經(jīng)75%乙醇浸泡、紫外線殺菌后，取出固定塑料環(huán)并鋪入5.0×103個(gè)兔口腔黏膜上皮細(xì)胞，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每24 h更換培養(yǎng)液1次。分別在第1、3、5天時(shí)間點(diǎn)終止細(xì)胞生長，MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)試劑盒測定細(xì)胞的增殖情況。具體步驟如下：在既定時(shí)間點(diǎn)每孔加入MTT反應(yīng)液 100 μL、37℃反應(yīng) 4 h，加入 300 μL DMSO 37℃搖床震動15 min，每孔反應(yīng)液吸取50 μL放入96孔酶標(biāo)板中測定光密度（OD）550值。

1.4 兔口腔黏膜上皮細(xì)胞與PCL復(fù)合尿道管支架的制備 將PCL尿道管裁成長度為1.5 cm的圓柱。經(jīng)75%乙醇浸泡30 min滅菌，超凈工作臺中晾干后，沿管腔壁均勻鋪入1.5×105個(gè)（每管）兔口腔黏膜上皮細(xì)胞，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)1 h后，加入一定量的培養(yǎng)基沒過PCL尿道管，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，即可得到兔口腔黏膜上皮細(xì)胞與PCL復(fù)合尿道管支架。本研究以沒有種植兔口腔黏膜上皮細(xì)胞的PCL纖維尿道管作為對照組。

1.5 復(fù)合尿道支架裸鼠皮下埋植及生物學(xué)評價(jià) 裸鼠腹腔注射水合氯醛（7.2 mg/kg），待充分麻醉后將其放置到實(shí)驗(yàn)臺，背部朝上，固定四肢和頭部，碘伏消毒，75%乙醇脫碘后，以脊柱為中線，在兩側(cè)對稱位置用眼科剪剪出寬為1 cm的開口，用平頭剪刀將裸鼠皮膚與結(jié)締組織分離，將種植兔口腔黏膜上皮細(xì)胞的PCL尿道管支架從開口處植入裸鼠皮下，脊柱左右各1根。對照組埋植方式同上。共皮下埋植8只裸鼠，每組4只。

2周后，將裸鼠安樂死，取出皮下埋植的兔口腔黏膜上皮細(xì)胞與PCL復(fù)合尿道管支架和空白PCL管，小心剔除周圍多余的組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脫水，OCT包埋后，進(jìn)行冰凍切片，切片厚度為6 μm，通過HE染色及CK19抗體免疫熒光對復(fù)合尿道支架的性能進(jìn)行生物學(xué)評價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 PCL尿道支架形態(tài)特征 通過實(shí)驗(yàn)室自制的靜電紡絲設(shè)備制備的PCL尿道管，掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)該P(yáng)CL尿道管的形態(tài)保持良好，壁厚在500 μm左右，具有疏松多孔的結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞浸潤，內(nèi)腔表面纖維分布均勻，見圖1。

Fig.1 The structure of electrospinning PCL urethral scaffold materials圖1 電紡PCL尿道支架材料結(jié)構(gòu)圖

2.2 PCL電紡纖維可促進(jìn)兔口腔黏膜上皮細(xì)胞增殖 第 1、3、5天細(xì)胞 MTT OD550值分別為 0.16±0.03、0.29±0.01、0.39±0.02，即隨時(shí)間延長，PCL 電紡膜表面細(xì)胞MTT OD值逐漸增加。

2.3 兔口腔黏膜上皮細(xì)胞與PCL復(fù)合尿道細(xì)胞浸潤顯著 HE染色結(jié)果顯示，種植兔口腔黏膜上皮細(xì)胞的PCL尿道管的細(xì)胞浸潤要顯著好于對照組，且其內(nèi)腔有一層連續(xù)致密的細(xì)胞層，見圖2。免疫熒光染色結(jié)果顯示復(fù)合管內(nèi)腔表面的連續(xù)致密的細(xì)胞為兔口腔黏膜上皮細(xì)胞，見圖3。兔口腔黏膜上皮細(xì)胞可以在PCL尿道管上存活和增殖，且有利于細(xì)胞向PCL尿道管的浸潤。

3 討論

創(chuàng)傷、感染引起的尿道狹窄是臨床上較為常見的泌尿系統(tǒng)疾病［6］。尿道狹窄段切除端端吻合術(shù)主要用于治療狹窄段小于2 cm的尿道狹窄，當(dāng)狹窄段長于2 cm時(shí)，臨床上主要利用舌黏膜、頰黏膜及結(jié)腸黏膜等代替物進(jìn)行尿道修復(fù)，但術(shù)后易發(fā)生并發(fā)癥，手術(shù)成功率降低［7-9］。組織工程研究的進(jìn)展為尿道損傷的修復(fù)開辟了新的道路。劉春曉等［10］采用單純多孔絲素蛋白支架修復(fù)1.5 cm的新西蘭大白兔尿道缺損，術(shù)后16周，尿道上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞排列有序，與正常對照組無明顯差別，但是由于絲素蛋白吸收速度較快，在尿道完全修復(fù)前就已被吸收，會導(dǎo)致修復(fù)段尿道的攣縮。而PCL體內(nèi)降解速度緩慢，可與其他高分子材料共聚，實(shí)現(xiàn)可控降解，且PCL具有良好的力學(xué)性能和生物相容性。Wang等［11］研究證實(shí)粗絲大孔的PCL靜電紡絲支架有利于M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變，促進(jìn)組織再生。周哲等［3］證明人永生化尿路上皮細(xì)胞系（SVHUC-1）能在PCL與絲素蛋白共聚物纖維上較好地生長，說明PCL具備應(yīng)用于尿道修復(fù)的潛能。

Fig.2 The HE staining results of PCL urethral tube that implanted rabbit oral mucosal epithelial cells and control group after two weeks of implantation圖2 皮下埋植2周后種植兔口腔黏膜上皮細(xì)胞的PCL尿道管和對照組的HE染色結(jié)果

Fig.3 The CK19 antibody immunofluorescence staining of PCL urethral tube implanted rabbit oral mucosal epithelial cells and control group after two weeks of implantation圖3 皮下埋植2周后種植兔口腔黏膜上皮細(xì)胞的PCL尿道管和對照組的CK19抗體免疫熒光染色結(jié)果

單純的生物材料代替物缺少生物活性，術(shù)后可能會引起憩室、尿瘺、狹窄復(fù)發(fā)等一系列嚴(yán)重的并發(fā)癥，而種子細(xì)胞的加入，將會在很大程度上促進(jìn)材料植入后的血管再生，從而減少并發(fā)癥的產(chǎn)生［12］。干細(xì)胞被認(rèn)為是理想的組織工程種子細(xì)胞，張亞等［13］證明利用脂肪干細(xì)胞與多孔絲素材料復(fù)合支架具有促進(jìn)尿道缺損修復(fù)的作用；Wu等［14］體外分離培養(yǎng)尿源性干細(xì)胞，誘導(dǎo)分化為尿道上皮細(xì)胞和尿道平滑肌細(xì)胞，并將其接種到改良的多孔小腸黏膜下層支架上，植入裸鼠1個(gè)月后，移植物細(xì)胞表面可表達(dá)尿路上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物。相比干細(xì)胞，成體細(xì)胞取材和培養(yǎng)過程較為簡單，有利于縮短尿道支架的制備時(shí)間。林陽彥等［15］用尿道上皮細(xì)胞與片狀多孔絲素蛋白構(gòu)成的復(fù)合支架修復(fù)兔尿道缺損取得了良好的結(jié)果。雖然尿道上皮細(xì)胞保證了上皮細(xì)胞的同源性，但其取材相對繁瑣，且容易造成二次損害。兔口腔黏膜上皮與尿道黏膜上皮同屬于上皮組織的被覆上皮，均具有防御功能［16］，但兔口腔黏膜上皮細(xì)胞具有取材方便、可以分泌β-防御素抑制微生物的侵襲等特點(diǎn)［17］，是理想的尿道支架種子細(xì)胞。本研究以兔口腔黏膜上皮細(xì)胞作為種子細(xì)胞，與PCL纖維尿道支架復(fù)合，經(jīng)體內(nèi)皮下埋植，結(jié)果顯示兔口腔黏膜上皮細(xì)胞在PCL纖維尿道支架的管腔面形成一層連續(xù)的上皮細(xì)胞，結(jié)合體外的MTT增殖實(shí)驗(yàn)，說明無論體外還是實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)，PCL尿道支架均能夠支持細(xì)胞的生長和增殖，并維持細(xì)胞活性。

瘢痕形成是干擾尿道修復(fù)的主要難點(diǎn)之一，能導(dǎo)致尿道狹窄、愈合差。如果尿道代替物中包含充足的血管網(wǎng)絡(luò)就可以避免組織纖維化，減少瘢痕形成等問題，所以組織工程化的尿道替代物與尿道修復(fù)是否成功息息相關(guān)［18］。Li等［19］將口腔黏膜細(xì)胞接種在膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)（BAMG）移植物來進(jìn)行尿道狹窄治療，雖然目前階段實(shí)驗(yàn)效果理想，但該支架重建尿道的膠原纖維較正常的尿道更加無序，且容易留下瘢痕。本研究制備的兔口腔黏膜上皮細(xì)胞與PCL復(fù)合尿道管在裸鼠皮下埋植2周后，HE染色結(jié)果說明該復(fù)合尿道管展現(xiàn)出良好的細(xì)胞浸潤，推測可能是兔口腔黏膜上皮細(xì)胞自身分泌了某些物質(zhì)或因子，從而促進(jìn)了PCL纖維尿道管的細(xì)胞浸潤，而細(xì)胞浸潤在一定程度上與支架材料的血管化息息相關(guān)，從而有可能減少瘢痕等并發(fā)癥的產(chǎn)生。

綜上，本研究制備的兔口腔黏膜上皮細(xì)胞與PCL復(fù)合支架，經(jīng)裸鼠皮下埋植實(shí)驗(yàn)證明兔口腔黏膜上皮細(xì)胞在動物體內(nèi)依然可以保持良好的新陳代謝，并且與空白PCL相比，兔口腔黏膜上皮細(xì)胞的引入使得PCL尿道管的細(xì)胞化顯著增強(qiáng)，有利于日后用于尿道修復(fù)，證實(shí)了該管用于尿道修復(fù)的可行性。

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（2016-12-12收稿 2017-05-08修回）

（本文編輯 李國琪）

The preparation and feasibility study of composite urethral stent-rabbit oral mucosal epithelial cells and PCL electrospun fiber

GUAN Yong,MENG Qing-ya,XU Guo-dong,ZHANG Fu-yi,SHU Jian-bo
Department of Urology,Tianjin Children’s Hospital,Tianjin 300134,China△

E-mail:guanyongyisheng@163.com

ObjectiveTo explore the feasibility of using composite scaffolds of rabbit oral epithelial cells and polycaprolactone(PCL)electrospun fibers for urethral repair.MethodsThe 25%PCL was prepared using a 5∶1 by volume mixture of trichloromethane and anhydrous methanol,and PCL fiber tubular scaffolds were obtained by electrospinning.Rabbit oral mucosa epithelial cells(1.5×105)were implanted on the PCL scaffold.Subsequently,they were embedded in nude mice subcutaneous,explanted in 2 weeks.PCL fiber tubular scaffolds without rabbit oral mucosa epithelial cells were used as control.The complex urethral scaffolds were evaluated by immunofluorescence staining with cytokeratin antibody and HE staining.ResultsCompared with blank PCL group,the rabbit oral mucosa epithelial cell group showed a good cellularization.Rabbit oral mucosa epithelial cells formed a dense cell layer on the surface of PCL lumen,which suggested that rabbit oral mucosa epithelial cells can proliferate on the surface of PCL lumen.ConclusionRabbit oral epithelial cells can be used as one of the seed cells for tissue engineered urethral scaffolds,and it is possible to construct tissue engineering substitute materials for urethral repair by rabbit oral epithelial cells combined with PCL.

mouth mucosa;epithelial cells;tissue engineering;polycaprolactone;urethral stent;electrospinning

R695

：A

10.11958/20161525

天津市衛(wèi)生局科技基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2013KR08）

天津市兒童醫(yī)院泌尿外科（郵編300134）

關(guān)勇（1971），男，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師，主要從事兒童泌尿外科疾病治療研究

△通訊作者 E-mail：guanyongyisheng@163.com