陳 斌，顧聰穎，陳必成，鄭 磊

線粒體輔酶Q改善高脂飲食大鼠腎血流動(dòng)力學(xué)的研究

陳 斌a*，顧聰穎a，陳必成b，鄭 磊a

目的 探討線粒體輔酶Q(MitoQ，Mitoquinone)對(duì)高脂飲食大鼠腎血流灌注的影響。方法 8周齡雄性SD大鼠30只，隨機(jī)分成模型組(H組，n=10)、治療組(HM組，n=10)和對(duì)照組(N組，n=10)。N組喂食基礎(chǔ)飼料，H組、HM組喂食高脂飼料。9周后，HM組自飲水中加入MitoQ。三組大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)10周后進(jìn)行腎臟聲學(xué)造影檢查，并檢測(cè)大鼠血生化及腎組織丙二醛(MDA)含量，比較各指標(biāo)的組間差異。結(jié)果 與N組及HM組比較，H組大鼠腎皮質(zhì)達(dá)峰時(shí)間(TTOP)延長,增強(qiáng)強(qiáng)度(A)及充盈速度(C)下降(P<0.01)，總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)均明顯增高(P<0.01)，HM組與H組比較，以上各指標(biāo)明顯改善。H組血清及腎組織丙二醛(MDA)含量明顯高于HM組及N組(P<0.01)。結(jié)論 MitoQ可降低機(jī)體內(nèi)過氧化物含量，改善高脂飲食大鼠腎血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)。

線粒體輔酶Q；大鼠；高脂飲食；腎血流動(dòng)力學(xué)

0 引言

高脂飲食是導(dǎo)致肥胖的重要原因，長期高脂飲食可導(dǎo)致高脂血癥?！爸|(zhì)腎毒性”假說[1]認(rèn)為,脂質(zhì)具有腎毒性，導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激水平升高，而腎臟對(duì)氧化損傷比較敏感[2]。近年來，線粒體輔酶Q(MitoQ ，Mitoquinone)作為線粒體靶向抗氧化劑備受關(guān)注[3-4]，對(duì)于MitoQ能否對(duì)高脂飲食大鼠腎血流灌注起到保護(hù)作用的報(bào)道較少，本研究旨在探討MitoQ對(duì)腎臟血流灌注的改善作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 8周齡SD雄性SPF級(jí)大鼠30只,280～320 g(溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。大鼠2～3只一籠，自由飲食，自然光照，動(dòng)物室溫適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成3組：正常對(duì)照組(N組,n=10)、模型組(H組,n=10)、MitoQ治療組(HM組,n=10)。對(duì)照組喂食基礎(chǔ)飼料(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，其他兩組給予高脂飼料(80%基礎(chǔ)飼料，18%豬油，2%膽固醇, 江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司提供)，9周后，HM組飲水中添加MitoQ (蘇州沃盛化學(xué)有限公司提供)，給藥濃度參照(232±4)mol/(kg·d)加入50 mL飲用水中[5]，三組大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)10周。

1.2 儀器與方法

1.2.1 主要儀器、試劑 GE公司LogiqE9彩色多普勒超聲診斷系統(tǒng)，15L線陣探頭，探頭頻率為12～14 MHz。小動(dòng)物氣體麻醉機(jī)(ABS型，上海玉研科學(xué)儀器有限公司提供)。全自動(dòng)生化分析儀(日立7600型)。大鼠丙二醛(MDA)試劑盒(購于杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)。

1.2.2 聲學(xué)造影檢查方法 SD大鼠空腹8～10 h后，予1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉，取平臥位，以硫化鈉去除腹部體毛后，取仰臥位固定于動(dòng)物板，經(jīng)小動(dòng)物氣體麻醉機(jī)吸入2%異氟烷維持麻醉。造影劑為意大利博萊克公司生產(chǎn)的聲諾維(Sono Vue)，向Sono Vue 25 mg干粉瓶內(nèi)注入5 mL生理鹽水，充分搖勻備用。首先，應(yīng)用常規(guī)二維超聲獲得清晰大鼠最大右腎冠狀切面后選用聲學(xué)造影模式，將焦點(diǎn)置于腎臟后方，探查深度固定于3 cm，機(jī)械指數(shù)0.06，幀頻15～20 Hz，實(shí)驗(yàn)過程中所有儀器調(diào)節(jié)設(shè)定不變，保持右腎冠狀切面穩(wěn)定，取0.2 mL造影劑懸液經(jīng)尾靜脈快速注入，同時(shí)啟動(dòng)記錄、觀察造影過程中腎實(shí)質(zhì)回聲變化，記錄至少3 min連續(xù)實(shí)時(shí)造影動(dòng)態(tài)影像并將其保存在儀器硬盤及光盤用于脫機(jī)分析。

1.2.3 圖像分析 應(yīng)用儀器自帶的TIC.Analysis(GE)軟件包對(duì)造影動(dòng)態(tài)影像進(jìn)行脫機(jī)分析，取樣框置于與腎門相對(duì)的外層腎皮質(zhì)，大小約3 mm×3 mm，避開弓形動(dòng)脈及腎周組織干擾。生成大鼠腎皮質(zhì)灌注聲學(xué)造影時(shí)間-強(qiáng)度曲線(TIC曲線)，自動(dòng)測(cè)出增強(qiáng)強(qiáng)度A、達(dá)峰時(shí)間TTOP、充盈速度C等參數(shù)值。所有參數(shù)均測(cè)量3次取平均值以減小誤差。

1.2.4 樣本采集及檢測(cè) 超聲造影檢查完成后立即開胸、開腹，腹主動(dòng)脈取血10 mL，所有血液標(biāo)本立即低溫(4 000℃ r/min、10 min)離心分離血清，置-40 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血漿總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)、尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)。血及腎組織丙二醛(MDA)按試劑盒說明書檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠一般情況比較 H組及HM組在前12周體重增長較N 組明顯，隨后增長放緩，實(shí)驗(yàn)?zāi)┤M大鼠體重比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 三組大鼠不同時(shí)期體重比較(g)

注：與N組比較，*P<0.05

2.2 聲學(xué)造影 H組與N組及HM組比較，大鼠腎皮質(zhì)TIC曲線達(dá)峰時(shí)間(TTOP)延長、增強(qiáng)強(qiáng)度(A，為聲學(xué)強(qiáng)度的絕對(duì)增加值)及充盈速度(C)下降(P<0.01)，HM組與N組比較，TTOP、A及C值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1、表2。

圖1 N組(圖a)、H組(圖b)和HM組(圖c)大鼠腎臟聲學(xué)造影時(shí)間-強(qiáng)度曲線及A、C和TTOP參數(shù)

表2 三組大鼠腎臟聲學(xué)造影相關(guān)參數(shù)的比較

注：A：增強(qiáng)強(qiáng)度；TIOP：達(dá)峰時(shí)間；C：充盈速度。與N組比較，*P<0.01；與H組比較，#P<0.01

2.3 腎組織勻漿檢查 H組MDA顯著高于N組及HM組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，HM組與N組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 三組腎組織MDA含量比較

2.4 血生化檢查 H組與N組比較，TC、TG、LDL-c及MDA含量均明顯增高(P<0.01)。HM組MDA及LDL-c較H組明顯降低(P<0.01)；HM組TC及TG較H組稍下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；且仍高于N組(P<0.01)。三組HDL-c、BUN及SCr比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

3 討論

飲食所致的高脂血癥是世界性的衛(wèi)生問題，我國成人血脂異常率達(dá)18.6%[6]。不當(dāng)?shù)纳罘绞剿碌姆逝旨把x紊亂引起機(jī)體氧化應(yīng)激水平增高，活性氧簇(ROS)造成細(xì)胞、組織和器官的氧化損傷，在腎臟損害及腎臟疾病進(jìn)展中起重要作用[2,7]。大鼠以高脂飲食飼養(yǎng)6～12周時(shí)即可出現(xiàn)腎臟病理結(jié)構(gòu)的損害[8-10]，氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常、白細(xì)胞黏附和細(xì)胞凋亡增多，損害腎臟的微血管功能[11-13]。正常情況下活性氧簇的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡，體內(nèi)抗氧化酶如SOD、GSH-Px、CAT等在清除氧自由基中有重要作用。MDA為脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物，其含量能夠間接反映機(jī)體氧化應(yīng)激損傷程度，本研究中，H組飼養(yǎng)19周后血脂表現(xiàn)異常，血MDA及腎組織MDA含量增高，表明高脂飲食導(dǎo)致了機(jī)體氧化應(yīng)激水平增高。本研究血Scr及BUN濃度組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明本組高脂飲食大鼠腎功能尚沒有受到嚴(yán)重?fù)p害。

通過分析腎皮質(zhì)造影時(shí)間-強(qiáng)度曲線，可為腎臟血流灌注量的判定提供依據(jù)，腎皮質(zhì)血流灌注的情況直接影響腎功能，與腎損害程度密切相關(guān)[14]。本研究聲學(xué)造影敏感地檢測(cè)到高脂飲食大鼠達(dá)峰時(shí)間延長、增強(qiáng)強(qiáng)度下降及充盈速度降低等血流動(dòng)力學(xué)異常，提示脂質(zhì)氧化損傷機(jī)制發(fā)揮作用，血管內(nèi)皮功能受損，微循環(huán)阻力增加。微泡進(jìn)入皮質(zhì)微循環(huán)的速度逐漸減慢，增強(qiáng)強(qiáng)度下降，達(dá)峰時(shí)間延長[6]。這些因素導(dǎo)致高脂飲食大鼠腎超聲造影定量參數(shù)A值及C值降低、達(dá)峰時(shí)間TTOP延長，因此，本研究表明腎血流動(dòng)力學(xué)的異常變化早于Scr及BUN所反映的腎功能異常改變。

表3 三組大鼠血漿相關(guān)指標(biāo)的比較

注：與N組比較，*P<0.01;與H組比較,#P<0.01

細(xì)胞內(nèi)線粒體既是活性氧產(chǎn)生的部位，也是活性氧介導(dǎo)損傷的靶點(diǎn)，針對(duì)高脂血癥時(shí)機(jī)體氧化應(yīng)激水平升高這一現(xiàn)象，MitoQ 作為一種新型的線粒體靶向抗氧化劑備受關(guān)注。與其他與非靶向抗氧化劑均衡分布在細(xì)胞中不同，其親脂性的陽離子有助于MitoQ中抗氧化成份泛醌-又稱輔酶Q(CoQ)選擇性地大量聚集在細(xì)胞中的線粒體，從而更高效地保護(hù)線粒體功能,保護(hù)細(xì)胞免受過氧化物的損傷[15-17]。本研究表明，MitoQ能有效降低血液及腎組織的MDA含量，這是腎臟血流動(dòng)力狀態(tài)改善的基礎(chǔ)，MitoQ治療組腎臟聲學(xué)造影參數(shù)較H組明顯改善，與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明MitoQ發(fā)揮了抗氧化作用，改善了血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，降低了腎皮質(zhì)微循環(huán)阻力，增加腎血流灌注，對(duì)腎臟起到了保護(hù)作用。本研究表明，MitoQ治療組血脂異常較高脂飲食組稍降低，但未能得到明顯改善。

綜上所述，長期高脂飲食大鼠血脂紊亂、血液及腎組織過氧化物增加，導(dǎo)致腎血流動(dòng)力異常。具有線粒體靶向抗氧化功能的MitoQ，能有效降低自由基對(duì)線粒體及細(xì)胞的氧化損害，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，從而有效改善腎血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)。

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Effect of MitoQ on renal hemodynamics in rats fed with high-fat diet

CHEN Bina*,GU Cong-yinga,CHEN Bi-chengb,ZHENG Leia*

(a.Department of Medical Ultrasound，b.Department of Surgery,the First Affiliated Hospital,Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,China)

Objective To explore the effect of MitoQ on renal hemodynamics in rats fed with high-fat diet.Methods Thirty 8-week-old male SD rats were enrolled and divided into 3 groups randomly.Group N were fed with routine diet,Group H and group HM were fed with high-fat diet.From the 10th week,MitoQ was administered to group HM in the drinking water.At the end of 19th week,All animals underwent Contrast-enhanced ultrasound examination on kidney.The animals were sacrificed for the serum biochemical and renal MDA investigation.Results Compared with group N and group HM,value A(the difference between peak intensity and basement) and value C(related to ascending branch) in group H decreased significantly (P<0.01,respectively).The TTOP (time to peak) and levels of MDA and LDL-c were remarkably increased in group H than that of group N and group HM (P<0.01,respectively).There was no prominent difference in LDL-c between group N and group HM.TC (Total cholesterol) and TG(Triglycerides) in group H and HM were higher than those of group N(P<0.01,respectively).MDA in kidney was significantly increased in group H in comparison with group N and group HM (P<0.01,respectively).Conclusion MitoQ could reduced the level of MDA and protect against the impairment of renal hemodynamics in rats fed with high-fat diet.

MitoQ;Rat;High-fat diet;Renal hemodynamics

2017-04-17

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院a.超聲影像科， b.外科實(shí)驗(yàn)中心，溫州 325000

溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(Y20140602)

10.14053/j.cnki.ppcr.201706002

*通信作者