李 驄，李寒姝，張彩華，姜妙娜，袁麗君，賈玉杰

肝復(fù)康經(jīng)JNK信號(hào)通路在肝星狀細(xì)胞凋亡中的調(diào)節(jié)機(jī)制

李 驄，李寒姝，張彩華，姜妙娜，袁麗君，賈玉杰*

目的 探討中藥肝復(fù)康經(jīng)JNK(c-Jun N-terminal kinase，JNK)信號(hào)通路在肝星狀細(xì)胞凋亡中的調(diào)節(jié)機(jī)制。方法 將SD大鼠隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組(C)，模型組(M)，肝復(fù)康高(HT)、中(MT)、低(LT)劑量治療組，每組給予相應(yīng)的處理；HSC-T6細(xì)胞株隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組、乙醛組及肝復(fù)康治療組。HE染色法觀察肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化；RT-PCR法測(cè)定MKK4、MKK7、JNK1、JNK2、COX-2、Survivin、Caspase-3、α-SMA、collagenⅠ和collagenⅢ的基因表達(dá)水平；免疫組織化學(xué)法和免疫蛋白印記法觀察COX-2在肝組織和肝星狀細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果 正常組中COX-2幾乎不表達(dá)。與正常組相比，模型組中COX-2表達(dá)顯著增加(P<0.05)。與模型組相比，肝復(fù)康治療組各組中COX-2表達(dá)均明顯降低，其中，中劑量組最明顯(P<0.05)。與正常組相比，模型組中MKK4、MKK7、JNK1、JNK2、COX-2、Survivin的基因表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.05)。與模型組相比，肝復(fù)康治療組各基因表達(dá)水平均明顯減弱，中劑量組最明顯(P<0.05)，其中Caspase-3基因表達(dá)呈相反趨勢(shì)。COX-2和Survivin的表達(dá)呈正相關(guān)，和Caspase-3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。檢測(cè)α-SMA、collagenⅠ與collagenⅢ基因表達(dá)，與模型組相比，中劑量治療組表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論 肝復(fù)康可通過(guò)抑制JNK信號(hào)通路的傳導(dǎo)誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗纖維化作用。

肝纖維化；JNK；肝復(fù)康；肝星狀細(xì)胞；凋亡

0 引言

肝纖維化系指肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)過(guò)度增生與異常沉積，導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)、功能發(fā)生異常改變[1-2]。其病理變化的中心事件是肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cell，HSC)激活并產(chǎn)生大量ECM，ECM的分泌增加，而降解減少，以致其在肝內(nèi)大量沉積，導(dǎo)致肝纖維化逐漸形成。肝纖維化是所有慢性肝病進(jìn)展成肝硬化的共同病理基礎(chǔ)[3-4]，且具有逆轉(zhuǎn)的可能[5]。因此一直以來(lái)都是相關(guān)研究領(lǐng)域的熱門(mén)課題。

c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino-terminal kinase，JNK)是絲裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中轉(zhuǎn)導(dǎo)并調(diào)控細(xì)胞凋亡信號(hào)的重要信號(hào)通路。JNK信號(hào)通路可以被多種胞外刺激激活，JNK有2個(gè)雙特異性上游激酶：絲裂原活化蛋白激酶激酶4 (Mitogen-activated protein kinase kinase 4，MKK4)和絲裂原活化蛋白激酶激酶7 (Mitogen-activated protein kinase kinase 7，MKK7)。研究表明，JNK參與了肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[6]，然而，目前JNK在凋亡中的作用尚不明確。環(huán)氧化酶2(Cyclooxygenase-2，COX-2)是一種誘導(dǎo)酶，在炎癥反應(yīng)和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。COX-2可以通過(guò)激活HSC從而在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。而JNK通路的激活又可以調(diào)控COX-2的表達(dá)。Caspase在凋亡過(guò)程中處于關(guān)鍵地位，Caspase-3是各凋亡通路的最終執(zhí)行者。Survivin是一種凋亡抑制蛋白，可通過(guò)多種調(diào)控機(jī)制發(fā)揮其強(qiáng)大的抗凋亡作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖。而COX-2可以通過(guò)上調(diào)Survivin的表達(dá)、下調(diào)Caspase-3的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)其抗凋亡的作用。

本實(shí)驗(yàn)采用CCI4誘導(dǎo)的肝纖維化模型，對(duì)于離體實(shí)驗(yàn)部分選用乙醛作為有效刺激HSC-T6細(xì)胞的激活因子。目前許多研究證明，傳統(tǒng)中藥由于其多途徑、多靶點(diǎn)、不良反應(yīng)少的特點(diǎn)，在肝纖維化的治療中具有顯著療效[7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究中藥肝復(fù)康對(duì)JNK信號(hào)通路在肝星狀細(xì)胞凋亡中的影響，以期探索肝纖維化治療的新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 山羊抗大鼠COX-2多克隆抗體、兔β-actin多克隆抗體由Santa Cruz公司提供，兔血清工作液由北京中杉公司提供，二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供，DAB顯色液由北京中杉公司提供，PCR試劑盒由北京天根生物技術(shù)有限公司提供，引物由大連寶生物工程有限公司提供，胎牛血清由美國(guó)Sigma公司提供。

1.1.2 動(dòng)物 清潔級(jí)健康SD大鼠55只，雌雄不限，體重180～220 g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.3 藥物 肝復(fù)康制劑由丹參、黃芪、白芍、白術(shù)、當(dāng)歸、茯苓、赤芍、生地、柴胡、甘草、枳殼組成，其中以黃芪與丹參為主要成分，其次為茯苓與枳殼。前期多次預(yù)試驗(yàn)已經(jīng)確定了中藥的治療劑量。

1.1.4 細(xì)胞 大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6細(xì)胞株由上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所徐列明教授贈(zèng)送。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 清潔級(jí)健康SD大鼠55只，體重180～220 g，雌雄不限，隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組(C)，模型組(M)，肝復(fù)康高(HT)、中(MT)、低(LT)劑量治療組。

1.2.2 造模 除正常對(duì)照組外，其余組大鼠每周2次皮下注射橄欖油稀釋的10% CCI4(0.5 mL/kg)共12周。正常對(duì)照組注射同體積生理鹽水。第12周末，處死模型組和正常組大鼠，迅速取出肝組織。肝復(fù)康治療組從CCI4注射的第9周開(kāi)始，分別給予高、中、低劑量肝復(fù)康治療[3 125、312.5、31.25 mg/(kg·d)]，至第20周末，與正常對(duì)照組一同處死，迅速取出肝組織。所有大鼠均標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2.3 藥物血清的制備 SD清潔級(jí)大鼠20只，體重300～350 g，雌雄各半。大鼠隨機(jī)分為2組，每組10只，分別為正常對(duì)照組和肝復(fù)康治療中劑量組。肝復(fù)康治療中劑量組大鼠每日中劑量肝復(fù)康灌胃1次，灌胃1周。最后一次灌胃前12 h禁食，灌胃后1 h用苯巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，在無(wú)菌條件下，打開(kāi)腹腔，腹主動(dòng)脈取血，取血后3 000 r/min、4 ℃離心10 min，離心后血清在無(wú)菌細(xì)胞間用0.22 μm濾器抽濾后，于56 ℃、30 min條件下滅活。置-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｕ?duì)照組血清制備方法同上。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠HSC-T6細(xì)胞株用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DEMN培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2混合氣體的孵箱中培養(yǎng)，所有細(xì)胞用無(wú)血清的DEMN培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組(含10%正常大鼠血清的DEMN培養(yǎng)基)；乙醛組(含10%正常大鼠血清、乙醛200 μmol/L的DEMN培養(yǎng)基)；肝復(fù)康治療組(含10%肝復(fù)康治療中劑量組大鼠血清、乙醛200 μmol/L的DEMN培養(yǎng)基)。以上三組細(xì)胞均在37 ℃、5% CO2混合氣體的孵箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.5 肝臟病理學(xué)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn) 肝組織經(jīng)多聚甲醛固定后制成4 μm厚石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。Ishak評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0，正常組織，沒(méi)有發(fā)生纖維化；1+，部分匯管區(qū)發(fā)生纖維化，有或沒(méi)有短的纖維間隔；2+，匯管區(qū)纖維化，纖維間隔形成；3+，大部分匯管區(qū)纖維化伴明顯門(mén)門(mén)橋接；4+，可見(jiàn)門(mén)門(mén)橋接和門(mén)靜脈-中心靜脈橋接；5+，顯著的門(mén)門(mén)橋接和/或門(mén)靜脈-中心靜脈橋接，偶有結(jié)節(jié)。

1.2.6 免疫組織化學(xué)分析 石蠟常規(guī)脫蠟至水；3% H2O2滴到組織切片上，室溫靜置15 min，滅活內(nèi)源性酶；高壓熱抗原修復(fù)，修復(fù)液為0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液，5 min；滴加正常兔血清封閉液，室溫20 min；滴加稀釋后的一抗(COX-2稀釋比例為1∶100) 4 ℃過(guò)夜；加生物素化二抗，37 ℃水浴箱中20 min；加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，37 ℃水浴箱中20 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染3 min，流水沖洗10 min；氨水返藍(lán)，脫水，透明，封片。鏡檢：組織中棕黃色顆粒沉淀為陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域。Image-Pro-plus 圖像分析軟件進(jìn)行定量分析，顯微鏡下每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)這些區(qū)域累計(jì)光密度值(IOD)，計(jì)算平均光密度值。

1.2.7 RT-PCR法測(cè)定基因表達(dá)水平 Trizol法提取總RNA，4 ℃孵育5 min；加入氯仿，蓋緊蓋后用力震蕩15 s，4 ℃孵育5 min；4 ℃、12 000 r/min離心15 min；移取上清至離心管中，加入250 μL異丙醇，混勻，-20 ℃靜置30 min；4 ℃、12 000 r/min離心10 min；棄上清，緩慢加入事先用冰預(yù)冷的75%乙醇1 mL，4 ℃、10 000 r/min離心5 min；棄上清保留沉淀，濾紙上倒置，空氣干燥5～10 min；加30 μL去DEPC水，室溫靜置10 min；瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度及完整性，應(yīng)用Quant Reverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以適量cDNA為模板、β肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參照，PCR擴(kuò)增各基因片段。RT-PCR相關(guān)引物序列及反應(yīng)條件見(jiàn)表1。循環(huán)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54～66 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃時(shí)延伸5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，置于凝膠圖像分析(UVP)檢測(cè)條帶灰度，以β-actin作為內(nèi)參校正，計(jì)算目的基因與β-actin基因擴(kuò)增條帶像素灰度比值，并作為目的基因mRNA表達(dá)的相對(duì)水平。每個(gè)樣本、每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測(cè)量3次，取均值。

表1 RT-PCR相關(guān)引物序列及反應(yīng)條件

1.2.8 免疫蛋白印記(Western blot)檢測(cè) 分別提取組織與細(xì)胞中的總蛋白，配置聚丙烯酰胺凝膠，濃縮膠5%，分離膠10%；按順序上樣，加入電泳液，跑膠電流：上膠25 mA，下膠30～35 mA。當(dāng)電泳跑至底部需要位置時(shí)停止電泳；將電泳后凝膠切至需要大小，測(cè)量，將6張濾紙和PVDF膜剪成膠的大小，連同膠一起放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10 min；按順序制作“三明治”，連接石墨轉(zhuǎn)膜儀電源，轉(zhuǎn)膜50 min左右；取出轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜，放入TBS和Tween20配置的5%脫脂奶粉封閉液中4 ℃過(guò)夜；取出封閉后的PVDF膜，加入用5%脫脂奶粉稀釋后的一抗(COX-2稀釋比例為1∶300)，于37 ℃搖床中孵育3 h，TBST洗膜3次，每次10 min；加入按比例稀釋的HRP標(biāo)記的二抗(稀釋比例為1∶2 000)，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次，每次12 min；配置需要體積的ECL發(fā)光液，將PVDF膜去除殘液，放入X光片夾中，滴上ECL發(fā)光液；暗室中打開(kāi)X光片夾，根據(jù)熒光強(qiáng)弱來(lái)決定曝光時(shí)間。曝光完成后迅速取出膠片，浸入顯影液中晃動(dòng)，當(dāng)膠片上出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影，將膠片放入定影液中，不?；蝿?dòng)，至膠片透明為止。然后用自來(lái)水沖去殘留的定影液終止反應(yīng)。室溫下晾干。

2 結(jié)果

2.1 肝組織形態(tài)學(xué)改變?nèi)庋塾^察 正常組大鼠肝臟表面光滑，顏色紅潤(rùn)，質(zhì)地柔軟。模型組大鼠肝臟固縮，表面粗糙有結(jié)節(jié)，呈土黃色，肝質(zhì)硬而脆，包膜緊張，油膩感。肝復(fù)康治療組與模型組比較肝臟略腫大，表面較光滑，質(zhì)地較柔軟。根據(jù)Ishak評(píng)分，各組纖維化程度評(píng)分見(jiàn)表2。HE染色組織病理切片：正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝索放射狀排列，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1A)。模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞排列紊亂，大量纖維組織增生，假小葉形成，肝細(xì)胞腫大，脂肪變性明顯，部分壞死，炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn)(圖1B)。與模型組相比，肝復(fù)康治療組大鼠肝臟均有不同程度改善，中劑量組效果最明顯，肝小葉結(jié)構(gòu)明顯改善，纖維增生明顯減輕，纖維間隔變細(xì)，肝細(xì)胞脂肪變性得到改善 (圖1C～圖1E)。

表2 GFK對(duì)肝纖維化評(píng)分的影響

注：*與正常對(duì)照組比較，P<0.05；#與模型組比較，P<0.05

2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)肝復(fù)康對(duì)COX-2在肝組織中表達(dá)的影響 COX-2在正常組大鼠肝組織幾乎無(wú)表達(dá)，或偶爾少量表達(dá)于Disse間隙，門(mén)管區(qū)基底膜或間質(zhì)細(xì)胞(圖2A)。在模型組大鼠肝組織中，可見(jiàn)大量棕黃色顆粒廣泛分布于細(xì)胞漿中，尤其在中心靜脈周?chē)母渭?xì)胞和門(mén)靜脈周?chē)蚀蟮腒upfffer細(xì)胞中最為明顯(圖2B)。與模型組相比，肝復(fù)康治療組COX-2陽(yáng)性表達(dá)顯著減少(圖2C～圖2E)，以中劑量組最為明顯。見(jiàn)圖3。

2.3 Western blot檢測(cè)肝復(fù)康對(duì)COX-2在肝組織及HSC中表達(dá)的影響 正常組大鼠肝組織及細(xì)胞中COX-2低表達(dá)。與正常組相比，模型組大鼠肝組織及細(xì)胞中COX-2表達(dá)顯著上調(diào)。與模型組相比，肝復(fù)康治療組大鼠肝組織及細(xì)胞COX-2表達(dá)顯著下調(diào)(見(jiàn)圖4)。COX-2蛋白在各組中表達(dá)趨勢(shì)和基因表達(dá)相一致。

2.4 RT-PCR檢測(cè)肝復(fù)康對(duì)大鼠肝組織JNK通路各指標(biāo)mRNA表達(dá)的影響 見(jiàn)圖5、表3。

與正常對(duì)照組相比，模型組中JNK通路主要的標(biāo)志酶-MKK4、MKK7、JNK1和JNK2的mRNA表達(dá)明顯增多。與模型組相比，肝復(fù)康治療組各個(gè)酶的表達(dá)明顯降低，中劑量最為明顯。對(duì)于COX-2和Survivin的表達(dá)，與正常組相比，模型組表達(dá)顯著上調(diào)。肝復(fù)康治療組COX-2和Survivin的表達(dá)較模型組明顯下調(diào)，以中劑量組最為明顯。模型組凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)較正常組顯著下調(diào)。與模型組相比，肝復(fù)康治療組Caspase-3表達(dá)顯著上調(diào)，中劑量組最為顯著。為了證明凋亡的發(fā)生，本實(shí)驗(yàn)亦檢測(cè)了凋亡標(biāo)志物α肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、Ⅰ型膠原(ColleganⅠ)、Ⅲ型膠原(Collagen Ⅲ)的mRNA表達(dá)。與模型組相比，肝復(fù)康治療組中各指標(biāo)的表達(dá)明顯下調(diào)。

圖1 肝組織病理形態(tài)變化(HE，400×)

圖2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)肝組織表達(dá)

圖3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)肝復(fù)康對(duì)COX-2在肝組織中表達(dá)的影響

圖4 Western blot檢測(cè)肝復(fù)康對(duì)COX-2的影響

注：A.肝組織數(shù)據(jù)分析；B.細(xì)胞數(shù)據(jù)分析。圖4A中，C為正常對(duì)照組，M為模型組，HT為GFK高劑量組，MT為GFK中劑量組，LT為GFK低劑量組；圖4B中，C為正常對(duì)照組，M為乙醛組，MT為GFK治療組。*與C組比較，P<0.05；#與M組比較，P<0.05

圖5 JNK通路各指標(biāo)mRNA的表達(dá)

注：肝組織中，C為正常對(duì)照組，M為模型組，HT為GFK高劑量組，MT為GFK中劑量組，LT為GFK低劑量組；HSC中，C為正常對(duì)照組，M為乙醛組，MT為GFK治療組

2.5 相關(guān)性分析 COX-2與JNK1、JNK2、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、α-SMA之間均呈正相關(guān)(P<0.01),見(jiàn)表4。COX-2與Survivin之間呈正相關(guān)，與Caspase-3之間呈負(fù)相關(guān)，見(jiàn)表5。

2.6 肝復(fù)康對(duì)HSC-T6 的作用 細(xì)胞RT-PCR結(jié)果顯示，乙醛組中JNK通路主要標(biāo)志酶、COX-2和Survivivn的表達(dá)與正常組相比明顯上調(diào)；而肝復(fù)康治療組中上述指標(biāo)的表達(dá)和乙醛組相比明顯下調(diào)(圖5、表6)。乙醛組中Caspase-3的表達(dá)與正常組相比明顯下調(diào)，肝復(fù)康治療組中Caspase-3的表達(dá)與乙醛組相比明顯上調(diào)(圖5、表6)。在Western blot實(shí)驗(yàn)中，乙醛組中COX-2的蛋白表達(dá)水平與正常組相比明顯增多，肝復(fù)康治療組中COX-2的蛋白表達(dá)水平與乙醛組相比明顯減少(圖4)。

表3 JNK通路各指標(biāo)mRNA 在肝組織中的表達(dá)

注：與C組比較，*P<0.05，**P<0.01；與M組比較，#P<0.05，##P<0.01

表4 COX-2與JNK1、JNK2、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和α-SMA之間的相關(guān)性分析

表5 COX-2與Survivin、Caspase-3之間的相關(guān)性分析

表6 肝復(fù)康對(duì)HSC-T6相關(guān)基因mRNA的影響

注：與C組比較，*P<0.05，**P<0.01；與M組比較，#P<0.05，##P<0.01

3 討論

肝纖維化是各種慢性肝損傷進(jìn)展為肝硬化的必經(jīng)階段，發(fā)病率較高。本實(shí)驗(yàn)采用的中藥肝復(fù)康是以黃芪、丹參、白芍、赤芍、柴胡等為主要成分的中藥復(fù)方，具有活血化瘀、軟堅(jiān)消癥的功效。盡管目前尚未應(yīng)用于臨床治療，但以往的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已多次成功證實(shí)了肝復(fù)康對(duì)肝纖維化組織具有預(yù)防及治療作用[8-9]。

HSC是位于肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞與肝細(xì)胞之間的一種肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，正常情況下肝星狀細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)。當(dāng)肝臟受到炎癥或機(jī)械刺激等損傷時(shí)，肝星狀細(xì)胞被激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞(Myofibroblastic-like cell，MFC)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)，活化的HSC在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，亦是ECM的主要來(lái)源[10-11]。HSC活化的主要特征是HSC的大量而頻繁的增殖和α-SMA的表達(dá)，活化的HSC合成大量ECM，包括CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、層黏連蛋白、透明質(zhì)酸、纖維連接蛋白等多種ECM成分。凋亡在肝纖維化的逆轉(zhuǎn)中亦起到關(guān)鍵作用，HSC凋亡不僅可以減少已經(jīng)活化的HSC的數(shù)量，還可以抑制HSC活化，進(jìn)而有利于ECM的降解和肝纖維化的逆轉(zhuǎn)。

JNK是MAPK家族中轉(zhuǎn)導(dǎo)并調(diào)控細(xì)胞凋亡信號(hào)的重要傳導(dǎo)通路[12]。JNK位于胞質(zhì)，作為JNK的2個(gè)特異性上游激酶，MKK4和MKK7通過(guò)雙磷酸化JNK的Thr、Tyr位點(diǎn)而激活JNK。JNK通路的活化也參與了HSC的活化和增殖，有研究證明，在大鼠HSC實(shí)驗(yàn)中使用JNK特異性抑制劑抑制JNK活性，可以有效抑制肝星狀細(xì)胞的增殖，而且隨著抑制劑劑量的增加，其抑制 HSC 增殖的作用逐漸增強(qiáng)，表明激活JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與HSC的增殖和肝纖維化有著密切關(guān)系[13]。

本研究結(jié)果表明，與正常組相比，模型組中，隨著JNK通路中的2個(gè)特異性上游激酶MKK4和MKK7表達(dá)上調(diào)，JNK1和JNK2的表達(dá)亦顯著上調(diào)，同時(shí)，α-SMA、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的表達(dá)均上調(diào)；而與模型組相比，肝復(fù)康治療組中，MKK4和MKK7的表達(dá)顯著下調(diào)，JNK1和JNK2的表達(dá)亦明顯下調(diào)，同時(shí)α-SMA、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的表達(dá)均相應(yīng)下調(diào)。與離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。結(jié)果表明，在CCI4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠和乙醛刺激的HSC中，JNK通路通過(guò)發(fā)揮抑制HSC凋亡的作用來(lái)促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展，而肝復(fù)康可以通過(guò)抑制JNK通路的表達(dá)來(lái)促進(jìn)HSC凋亡的發(fā)生，最終緩解肝纖維化程度。

COX-2是一種炎癥反應(yīng)過(guò)程中的誘導(dǎo)酶，具有促進(jìn)HSC活化的作用[14]。JNK通路的激活也參與了對(duì)COX-2表達(dá)的調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了JNK通路在COX-2的表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。在COX-2抑制細(xì)胞凋亡事件中，兩種凋亡相關(guān)因子Caspase-3和Survivin亦起到重要作用。本研究顯示，與正常組相比，模型組中COX-2、Survivin的表達(dá)明顯增多，而Caspase-3的表達(dá)相對(duì)減少；在肝復(fù)康治療組中，伴隨著COX-2表達(dá)的下調(diào)，Survivin亦顯著下調(diào)，而Caspase-3表達(dá)明顯上調(diào)，即COX-2和Survivin的表達(dá)呈正相關(guān)，而與Caspase-3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果證實(shí)，在CCI4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠和乙醛刺激的HSC中，COX-2通過(guò)發(fā)揮抑制凋亡作用，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展，其抑制凋亡的發(fā)生是通過(guò)上調(diào)Survivin表達(dá)、下調(diào)Caspase-3表達(dá)的途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，傳統(tǒng)中藥復(fù)方制劑肝復(fù)康對(duì)于CCI4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠和乙醛刺激的HSC具有一定的抗纖維化作用，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制JNK信號(hào)通路的傳導(dǎo)進(jìn)而誘導(dǎo)HSC的凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。期待隨著細(xì)胞生物學(xué)、基因治療等研究的深入發(fā)展，能夠有更多新靶點(diǎn)、新途徑的抗肝纖維化藥物被研發(fā)。

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Regulation mechanisms of Ganfukang in hepatic stellate apoptosis through JNK signaling pathways

LI Cong,LI Han-shu,ZHANG Cai-hua,JIANG Miao-na,YUAN Li-jun,JIA Yu-jie*

(Department of Pathophysiology,Dalian Medical University,Dalian 116044,China)

Objective To explore the regulation mechanisms of Ganfukang (GFK) in hepatic stellate cells (HSC) apoptosis through JNK signaling pathways.Methods All the SD rats were randomly divided into 5 groups:normal control group (group C),model group (group M) and high,middle and low dose treatment groups (group HT,group MT and group LT).HSC-T6 cell line was randomly divided into three groups:control group,acetaldehyde group and GFK group.The pathological changes of hepatic tissues were observed under light microscope by HE staining.The mRNA expression of MKK4,MKK7,JNK1,JNK2,COX-2,Survivin,Caspase-3,α-SMA,typeⅠcollagen and typeⅢcollagen was measured by RT-PCR,and the hepatic expression of COX-2 was detected by immunohistochemistry and western blot.Results The COX-2 was rarely expressed in group C.The expression of COX-2 protein in group M increased more significantly than that of group C (P<0.05).Compared with group M,the expression of COX-2 protein decreased in group MT (P<0.05).The expression levels of main kinases in JNK pathway (MKK4,MKK7,JNK1 and JNK2) and Survivin in group M were higher than those of group C (P<0.05),and they were lower in GFK treatment groups than those of group M (P<0.05),while the tendency of expression levels in Caspase-3 mRNA was contrary.The expression of COX-2 was significantly positively correlated with Survivin,and negatively correlated with Caspase-3.The expression of colleganⅠ,collagenⅢ and α-SMA mRNA in group MT was lower than that of group M (P<0.05).Conclusion GFK has therapeutic effect on liver fibrosis by inducing the apoptosis of HSC through inhibiting the transduction of JNK signal pathway in liver fibrosis.

Liver fibrosis;JNK;Ganfukang;HSC;Apoptosis

2017-01-21

大連醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，大連 116044

遼寧省教育廳課題(2009A190)

10.14053/j.cnki.ppcr.201706003

*通信作者