辛宇 Melia BogariZin Mar Aung 陳偉 柴崗 張艷

·基礎(chǔ)研究·

CD26分子在正常皮膚組織和瘢痕疙瘩組織中成纖維細(xì)胞表達(dá)的差異分析

辛宇 Melia BogariZin Mar Aung 陳偉 柴崗 張艷

目的 探究CD26表面分子在正常皮膚組織和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中表達(dá)的差異。方法 正常皮膚成纖維細(xì)胞（NFs）組的正常皮膚組織取自接受腹部整形術(shù)的10例患者；瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（KFs）組瘢痕疙瘩組織取自此前未經(jīng)過任何治療的10例瘢痕疙瘩患者的胸部和腹部。利用酶消化法獲得原代KFs和NFs，應(yīng)用流式分析技術(shù)檢測(cè)CD26表面分子在2組細(xì)胞中的表達(dá)差異。用流式分選技術(shù)對(duì)NFs和KFs組中CD26表達(dá)陽(yáng)性（CD26+）與表達(dá)陰性（CD26-）細(xì)胞進(jìn)行分選，體外常規(guī)培養(yǎng)4 d后對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行初步分析。結(jié)果 CD26表面分子在KFs和NFs中均可表達(dá)，但KFs組表達(dá)率（46.65±13.97）%明顯高于NFs組（24.75±16.85）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。經(jīng)流式分選后，CD26+與CD26-細(xì)胞群在NFs與KFs組中形態(tài)均無明顯差異。結(jié)論 CD26分子在瘢痕疙瘩組織成纖維細(xì)胞中的表達(dá)率明顯高于正常皮膚組織成纖維細(xì)胞中的表達(dá)率，CD26-和CK26+細(xì)胞群在形態(tài)上無明顯差異。

CD26分子；成纖維細(xì)胞；瘢痕疙瘩；正常皮膚；流式細(xì)胞術(shù)

目前，瘢痕疙瘩治療中的高復(fù)發(fā)率和治療的復(fù)雜性仍是臨床面對(duì)的棘手問題[1-3]。盡管瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，大多數(shù)病因理論認(rèn)為其與成纖維細(xì)胞功能障礙相關(guān)[4]。因此，將治療方向轉(zhuǎn)向細(xì)胞學(xué)水平有可能為臨床治療帶來全新的視角，并且為進(jìn)一步深入分析疾病分子學(xué)病理機(jī)制奠定基礎(chǔ)。自2016年1～7月，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科以流式分析技術(shù)為基礎(chǔ)，研究CD26分子在瘢痕疙瘩中成纖維細(xì)胞的表達(dá)情況，為進(jìn)一步的功能學(xué)研究做好基礎(chǔ)，并為在細(xì)胞學(xué)水平治療瘢痕疙瘩疾病提供新思路。

1 對(duì)象和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)主要試劑和儀器

0.2 %復(fù)合膠原酶NB4（SERVA Electrophoresis-GmbH，德國(guó)）；0.2%中性蛋白酶（Roche，德國(guó)）；磷酸鹽緩沖液、0.25%胰蛋白酶（上海思吉生物制品有限公司）；胎牛血清（FBSGibco，美國(guó)）；DMEM高糖培養(yǎng)液（Gibco，美國(guó)）；FITC anti-human CD26（BioLegend，美國(guó)）。

FACSCalibur流式細(xì)胞儀（BD，美國(guó)），恒溫CO2培養(yǎng)箱（Forma Scientific，美國(guó)）；普通臺(tái)式離心（Heraeus，美國(guó)）；倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）；超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；10 cm培養(yǎng)皿、50 ml離心管、15 ml離心管、200目尼龍濾網(wǎng)（Falcon，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本取材及實(shí)驗(yàn)分組 正常皮膚成纖維細(xì)胞（normal skin fibroblasts,NFs）組正常皮膚組織取自接受腹部整形術(shù)且無瘢痕疙瘩病史和家族史的10例患者，其中男性3例，女性7例；年齡30～50歲。瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（keloid fibroblasts,KFs）組10例瘢痕疙瘩組織取自瘢痕疙瘩切除術(shù)獲得的胸部和腹部瘢痕疙瘩組織，其中男性4例，女性6例；年齡25～45歲。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過上海市第九人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，NFs組和KFs組中所有患者在試驗(yàn)前均簽署了知情同意書。

1.2.2 KFs組入選及排除標(biāo)準(zhǔn) KFs組入選標(biāo)準(zhǔn)：⑴符合瘢痕疙瘩疾病的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。①病損范圍超過原病灶范圍；②病變組織質(zhì)硬、發(fā)紅，表面光滑且高于正常皮膚組織；③存在痛、癢等刺激癥狀。⑵年齡為18～65歲，性別不限。⑶病變發(fā)生部位為軀干。⑷病程小于2年，尚處于疾病急性期。⑸患者充分理解并且簽署知情同意書。KFs組排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴之前接受過任何形式的瘢痕疙瘩治療。⑵病灶區(qū)內(nèi)有潰瘍現(xiàn)象。

1.2.3 細(xì)胞獲取方法 瘢痕疙瘩標(biāo)本以氯霉素沖洗液沖洗3遍，PBS充分振蕩洗滌3遍，去除血漬及其他組織碎片；無菌條件下去除表皮及皮下脂肪組織，將獲得的瘢痕疙瘩真皮部分剪至2 mm×2 mm，PBS振蕩洗滌1遍，用0.2%復(fù)合膠原酶NB4以37℃恒溫振蕩消化，5～8 h收獲真皮層細(xì)胞。消化產(chǎn)物以200目尼龍篩過濾，細(xì)胞懸液以1500 r/min離心5 min，棄去上清液。加入PBS振蕩混勻，1500 r/min離心5 min，棄去上清液，接種于含10%FBS的DMEM的培養(yǎng)皿，并置于37℃恒溫混合氣體（5%CO2和95%O2）環(huán)境中進(jìn)行原代培養(yǎng)，每隔3 d換液1次。

正常皮膚組織標(biāo)本以氯霉素沖洗液沖洗3遍，PBS充分振蕩洗滌3遍，去除血漬及其他組織碎片；無菌條件下去除皮下組織，并剪至2 mm×3 mm組織塊，PBS振蕩洗滌1遍；加入0.2%中性蛋白酶4℃消化過夜，PBS清洗、終止消化，并輕輕揭去表皮層。余下的真皮組織用無菌剪刀剪成l mm×l mm組織塊，用0.2%復(fù)合膠原酶NB4以37℃恒溫振蕩消化，4～6 h收獲真皮層細(xì)胞。消化產(chǎn)物以200目尼龍篩過濾，細(xì)胞懸液1500 r/min離心5 min，棄上清。加入PBS振蕩混勻，1500 r/min離心5 min，棄上清，接種于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)皿，并置于37℃恒溫混合氣體（5%CO2，和95%O2）環(huán)境中進(jìn)行原代培養(yǎng)，每隔3 d換液1次。

1.2.4 流式分析 原代成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合度時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，離心，重懸濃度為1×104/μl的細(xì)胞懸液。10μl抗人CD26試劑加入到100μl細(xì)胞懸液中，充分混勻，室溫下避光孵育20～30 min，同時(shí)在NFs和KFs組內(nèi)分別設(shè)置陰性對(duì)照組，除不加10μl抗人CD26試劑外，均與組內(nèi)實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過相同處理。隨后樣本經(jīng)流式分析儀在488 nm激光下檢測(cè)綠色熒光發(fā)射。經(jīng)流式分選后NFs和KFs組細(xì)胞均可分為CD26表達(dá)陰性（CD26-）和CD26表達(dá)陽(yáng)性（CD26+）細(xì)胞群。

1.2.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 分選后將兩組CD26-/+細(xì)胞接種于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)皿，并置于37℃恒溫混合氣體（5%CO2，和 95%O2）環(huán)境中進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，4 d后在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和密度，比較兩組細(xì)胞差異。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD26表達(dá)率流式分析結(jié)果

在NFs和KFs組內(nèi)的陰性對(duì)照組中，細(xì)胞陰性率均大于98%，證明在無CD26抗體孵育時(shí)細(xì)胞基本無熒光表達(dá)。CD26在NFs組中表達(dá)率為（24.75±16.85）%，在 KFs組中表達(dá)率為（46.65±13.97）%，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1。

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析

兩組中CD26-和CD26+成纖維細(xì)胞均呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞的紡錘形，細(xì)胞大小及密度均勻，在細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞密度上基本一致，未呈現(xiàn)明顯差異（圖2）。

3 討論

成纖維細(xì)胞作為皮膚組織中支撐結(jié)構(gòu)和分泌基質(zhì)的主要功能細(xì)胞，長(zhǎng)期以來被視為單一的功能細(xì)胞群體，而其多樣性研究鮮有報(bào)道。近年來，已有實(shí)驗(yàn)利用移植和系譜示蹤技術(shù)證明，真皮組織中的成纖維細(xì)胞是分別來自于上、下真皮層的兩個(gè)功能不同的細(xì)胞系。在正常生理狀態(tài)下，包含有真皮乳頭層的上層真皮層細(xì)胞系成纖維細(xì)胞可以調(diào)節(jié)毛發(fā)生長(zhǎng)和立毛肌功能，而包含有網(wǎng)織層真皮成纖維細(xì)胞的下層真皮層細(xì)胞則合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)和脂肪細(xì)胞前體細(xì)胞以及真皮脂肪細(xì)胞[5]。在皮膚損傷過程中，兩種來源細(xì)胞也不相同，在損傷修復(fù)的最初階段，是由下層真皮成纖維細(xì)胞發(fā)動(dòng)，當(dāng)進(jìn)入上皮再生階段，上層成纖維細(xì)胞才會(huì)參與修復(fù)過程。Rinkevich等[6]利用非選擇性損耗的熒光活性細(xì)胞分類方法在小鼠動(dòng)物模型中分選出了胚胎期表達(dá)基因Engrailed-1（En1）成纖維細(xì)胞系，證明了該細(xì)胞系在正常組織細(xì)胞外基質(zhì)的分泌以及在創(chuàng)傷、放射和癌癥模型的纖維化相關(guān)過程中均起主要作用。最后，利用表面分子篩查技術(shù)，最終確定了CD26分子可作為區(qū)分En1+和En1-細(xì)胞系的表面標(biāo)記物。CD26分子作為一種廣譜表達(dá)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的二肽酶，在免疫系統(tǒng)激活和調(diào)節(jié)機(jī)制中起到重要作用，在多種皮膚相關(guān)疾病中也被證實(shí)有CD26 分子上調(diào)[7]。

圖1 NFs和KFs組CD26分子表達(dá)率流式分析結(jié)果（B3代表CD26-細(xì)胞，B4代表CD26+細(xì)胞，因本實(shí)驗(yàn)加入的是單標(biāo)抗體，故B1，B2無實(shí)際意義） a.NFs組陰性對(duì)照 b.NFs組加入抗人CD26試劑 c.KFs組陰性對(duì)照 d.KFs組加入抗人CD26試劑

圖2 NFs和KFs組CD26-/+成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)4 d后形態(tài)學(xué)觀察 a.NFs組CD26-（×40） b.NFs組CD26+（×40） c.KFs組 CD26-（×40） d.KFs組 CD26+（×40） e.NFs組 CD26-（×100） f.NFs組 CD26+（×100） g.KFs組 CD26-（×100） h.KFs組 CD26+（×100）

CD26是一種在大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的Ⅱ型跨膜糖蛋白，可以從多肽或蛋白N端釋放二肽，在人體中可以表達(dá)在多種細(xì)胞表面，包括上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及激活的免疫細(xì)胞表面[8]。CD26主要與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)制相關(guān)。此外，免疫系統(tǒng)中T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和單核細(xì)胞都有其表達(dá)，該分子也是免疫系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞激活的表面標(biāo)志物。CD26在免疫系統(tǒng)調(diào)控細(xì)胞分化和增殖方面起到關(guān)鍵作用[9-10]。在皮膚組織中，CD26在人體不同起源的角質(zhì)細(xì)胞中對(duì)于DNA合成以及細(xì)胞增殖起到了極為重要的作用，此外，其還可以結(jié)合纖連蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間相互作用發(fā)揮重要作用[11]，在一些損傷誘發(fā)的皮膚腫瘤和疾病中，其表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞都存在有明顯的CD26分子的上調(diào)[7,12]。

瘢痕疙瘩由于僅發(fā)生于人體，至今尚無理想的動(dòng)物疾病模型，而目前關(guān)于該疾病的病理學(xué)機(jī)制仍存在爭(zhēng)議，因此，從細(xì)胞學(xué)水平探究疾病發(fā)生機(jī)制，并且直接以細(xì)胞為功能單位尋找治療方案，可能為瘢痕疙瘩臨床治療帶來全新的視角。同時(shí)，瘢痕疙瘩作為一種良性皮膚疾病，其特殊侵襲性與惡性腫瘤疾病有相似表現(xiàn)，已有相關(guān)研究證實(shí)該疾病與免疫機(jī)制失調(diào)有關(guān)[13]，而CD26分子表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的侵襲力增加有關(guān)[14-16]。在瘢痕疙瘩中成纖維細(xì)胞作為主要的免疫應(yīng)答細(xì)胞，其侵襲力也高于一般的成纖維細(xì)胞[2]。

據(jù)此我們推測(cè)，在瘢痕疙瘩中的成纖維細(xì)胞，其功能異常表現(xiàn)可能與CD26分子表達(dá)有關(guān)。本研究中以正常皮膚的成纖維細(xì)胞作為NFs組，以瘢痕疙瘩組織中的成纖維細(xì)胞作為KFs組，初步探索了CD26在2組細(xì)胞中表達(dá)的差異，而在KFs組中的CD26低表達(dá)也指示瘢痕疙瘩組織CD26+細(xì)胞群在功能上與細(xì)胞的高侵襲性有關(guān)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中，本課題組將繼續(xù)探索CD26+細(xì)胞群在該疾病纖維化相關(guān)功能以及細(xì)胞侵襲能力中的作用，并且希望通過應(yīng)用CD26分子特異性抑制劑對(duì)細(xì)胞功能起到抑制作用。若能在細(xì)胞學(xué)水平證實(shí)CD26+成纖維細(xì)胞系在瘢痕疙瘩疾病中的作用及其機(jī)制，將有助于進(jìn)一步解釋該疾病的發(fā)病機(jī)制，并且為疾病的臨床治療奠定基礎(chǔ)。

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Analysis of expression of the CD26 marker on keloid fibroblasts

XIN Yu,Melia Bogari,Zin Mar Aung,CHEN Wei,CHAI Gang,ZHANG Yan.(Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China)

ObjectiveTo analyze the expression of the CD26 marker on normal skin fibroblasts(NFs)and keloid fibroblasts(KFs).MethodsNormal skin tissues in the NFs group were obtained from individuals who underwent abdominal plastic resection.Keloid tissues in the breast and abdomen were harvested in surgery from patients who did not receive any treatment for their keloids.Then NFs and KFs were obtained through the enzyme digestion method.Flow cytometry technology was used to analyze the expression of the CD26 marker on NFs and KFs,and isolate the CD26 positive expressed (CD26+)and CD26 negative expressed(CD26-)cell population of NFs and KFs.Then the cell morphology of CD26-/+fibroblasts were observed after 4 days in vitro culture by inverted microscope.ResultsThe CD26 marker was expressed in both KFs and NFs.KFs exhibited a higher expression rate of CD26(46.65±13.97)%than NFs with that of(24.75±16.85)%(P＜0.01).Observation of cell morphology after 4 days in vitro culture exhibited similar shape and cell density between CD26-cell population and CD26+cell population in both the NFs and KFs groups.ConclusionKFs exhibited a higher expression rate of CD26 than NFs,while the CD26-and CD26+cell population in both the NFs and KFs groups showed similar morphological characteristics.

CD26 marker;Fibroblasts;Keloid;Normal skin;Flowcytometrytechnology

CHAI Gang,Email:13918218178@163.com;ZHANG Yan,Email:13651817522@163.com

2016-11-30）

10.3969/j.issn.1673-7040.2017.01.011.

10.3969/j.issn.1673-7040.2017.01.011

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81372097）；上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科研計(jì)劃項(xiàng)目（14441900800，14441900802）；上海交通大學(xué)“醫(yī)工交叉研究基金”（YG2014MS06）；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院高峰高原計(jì)劃研究型醫(yī)師（20161420）

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院 整復(fù)外科，上海200011

柴崗，Email:13918218178@163.com；

張艷，Email:13651817522@163.com

本文引用格式：辛宇,Bogari M,AungZM,等.CD26分子在正常皮膚組織和瘢痕疙瘩組織中成纖維細(xì)胞表達(dá)的差異分析[J].中國(guó)美容整形外科雜志,2017,28(1):39-42.