謝清靈+徐桂+彬堯凱+何永忠

【摘要】 目的：對比自噬相關(guān)蛋白在腎透明細胞癌與癌旁組織中表達狀況。方法：選取2016年3月20日-2017年3月20日本院收治的50例實施根治性腎切除術(shù)患者為研究對象，手術(shù)過程中切取患者兩部分組織，一部分為癌變組織，一部分為癌旁組織（即正常組織），且將其制作為標(biāo)本，對其進行免疫組化染色測定、組織芯片制作、IMAGE PRO PLUS6.0軟件測量，并對自噬相關(guān)蛋白表達水平變化進行相關(guān)性分析。結(jié)果：從免疫組化染色評分角度分析，腫瘤組織的ATG7（1.36±0.58）、LC3（2.05±0.36）、Beclin 1（0.55±0.32）水平均低于正常組織[（2.63±0.78）、（3.48±0.45）、（2.47±0.69）]，而ULK1（3.69±0.45）、P62（3.54±0.37）、P-mTOR（2.99±0.85）均高于正常組織[（2.69±0.35）、（2.31±0.45）、（2.05±0.36）]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），腫瘤組織和正常組織的ATG5值分別為（2.67±0.54）、（2.45±0.66），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；從IMAGE PRO PLUS6.0軟件測量結(jié)果角度分析，腫瘤組織的ATG7（0.029±0.010）、LC3（0.021±0.010）、Beclin 1（0.003±0.006）、P-mTOR（0.038±0.019）均低于正常組織[（0.034±0.020）、（0.043±0.015）、（0.023±0.016）、（0.031±0.013）]，而P62（0.029±0.018）、ULK1（0.032±0.014）均高于正常組織（0.020±0.009、0.025±0.010），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），腫瘤組織和正常組織的ATG5值分別為（0.034±0.020）、（0.043±0.010），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；根據(jù)自噬相關(guān)蛋白表達水平變化的相關(guān)性分析結(jié)果，P-mTOR、LC3、P62的表達與ATG7的表達水平變化有關(guān)，Beclin 1的表達與其他蛋白不相關(guān)，ULK1的表達變化與ATG7和P62相關(guān)。結(jié)論：自噬的表達水平在腎透明細胞癌中表現(xiàn)為下調(diào)狀態(tài)，而其下調(diào)可受到ATG7、LC3、Beclin 1、ULK1、P62、P-mTOR等多種自噬相關(guān)蛋白協(xié)同影響。

【關(guān)鍵詞】 自噬相關(guān)蛋白； 腎透明細胞癌； 癌旁組織； 對比

Expression of Autophagy Related Proteins in Renal Clear Cell Carcinoma and Adjacent Tissues/XIE Qing-ling，XU Gui-bin，YAO Kai，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（17）：001-004

【Abstract】 Objective：To explore the expression of autophagy related protein in renal cell carcinoma and adjacent tissues.Method：From March 2016 to March 2017，50 cases with radical nephrectomy were selected as the experimental object.During the operation，part of cancerous tissue and adjacent tissues（normal tissue） of patients were cut out to make specimens which were processed by immunohistochemical staining，made to tissue microarray and measured by IMAGE PRO PLUS6.0 software.Correlation analysis of autophagy related protein expression were conducted.Result：According to the immunohistochemical staining score，ATG7（1.36±0.58），LC3（2.05±0.36），Beclin 1（0.55±0.32） of cancerous tissue were lower than ATG7（2.63±0.78），LC3（3.48±0.45），Beclin 1（2.47±0.69） of adjacent tissues，ULK1 （3.69±0.45），P62（3.54±0.37），P-mTOR（2.99±0.85） of cancerous tissue were higher than ULK1（2.69±0.35），P62（2.31±0.45），P-mTOR（2.05±0.36） of adjacent tissues，the differences had statistical significance（P<0.05），ATG5 of tumor tissues and normal tissues were （2.67±0.54），（2.45±0.66），the difference had no statistical significance（P>0.05）.By the measurement results of IMAGE PRO PLUS6.0 software，ATG7（0.029±0.010），LC3（0.021±0.010），Beclin 1（0.003±0.006），P-mTOR（0.038±0.019） of cancerous tissue were lower than ATG7（0.034±0.020），LC3（0.043±0.015），Beclin 1（0.023±0.016），P-mTOR（0.031±0.013） of adjacent tissues，and P62（0.029±0.018），ULK1（0.032±0.014） of cancerous tissue were higher than P62（0.020±0.009），ULK1（0.025±0.010） of adjacent tissues，the differences had statistical significance（P<0.05），ATG5 of tumor tissue and normal tissue were （0.034±0.020），（0.043±0.010），the difference had no statistical significance（P>0.05）.From the perspective of correlation analysis，the expression of P-mTOR，LC3，P62 was related to the expression level of ATG7.The expression of Beclin 1 was not related to other proteins.The expression of ULK1 was correlated with ATG7 and P62.Conclusion：The expression level of autophagy is down regulated in renal clear cell carcinoma，and its down-regulation may be affected by ATG7，LC3，Beclin 1，ULK1，P62，P-mTOR and other autophagy related proteins.

【Key words】 Autophagy related protein； Renal clear cell carcinoma； Para-carcinoma tissue； Contrast

First-authors address：The Fifth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510700，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.17.001

腎細胞癌屬于惡性腫瘤之一，在泌尿科較為常見。自噬主要是指細胞通過雙層膜或單層膜包裹等待降解物形成自噬體，隨后形成自噬溶酶體，并進行多種酶的降解和消化，從而實現(xiàn)穩(wěn)定細胞內(nèi)微環(huán)境和實現(xiàn)細胞內(nèi)成分的更新，其主要標(biāo)志物為微管相關(guān)蛋白1輕鏈3，常參與自噬體的形成[1]。近年來，腫瘤和自噬的關(guān)系廣泛受到專家重視，且有研究表明，自噬在腫瘤形成中起到重要作用，且部分學(xué)者認(rèn)為BECLIML在自噬中屬于抑癌基因[2]。而本文旨在探索自噬相關(guān)蛋白在腎透明細胞癌與癌旁組織中表達的臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本次的探索對象為50例實施根治性腎切除術(shù)患者，所有患者均在2016年3月

20日-2017年3月20日期間收治。在患者手術(shù)中選取一塊正常腎組織和一塊腎癌組織，并將其制作成標(biāo)本，進行免疫組化染色。其中癌旁組織設(shè)定為正常對照，所有患者年齡24～58歲，平均（38.47±3.47）歲，男35例，女15例；TNM分期：Ⅳ期5例，Ⅲ期16例，Ⅱ期14例，I期15例；FUHRMAN 分級：低分化18例，中分化20例，高分化12例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均簽署書面同意書；（2）癌旁組織距癌組織邊緣>2 cm；（3）術(shù)前未進行過免疫、化療、放療；（4）經(jīng)病理檢查，患者均確診為腎透明細胞癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）心功能不全患者；（2）依從性較差患者；（3）手術(shù)禁忌證患者；（4）先天性語言功能障礙或聽力功能障礙患者；（5）危重癥患者；（6）資料不全患者。

1.2 方法 （1）生化試劑：由美國ABCAM公司提供一抗，包括ATG7（ab52472）、ATG5（ab64227）、ULK1（ab65056）、Beclin 1（ab51031）、LC3（ab48394）、P62（ab56416）、P-mTOR（ab51044）。其中P62屬于自噬特異性底物，P-mTOR的活性負(fù)性調(diào)節(jié)自噬，以上兩類蛋白的自噬負(fù)和表達相關(guān)，而ATG7、ATG5、ULK1、Beclin 1、LC3屬于自噬通路蛋白，其表達的高低能夠反映出自噬含量。由北京中杉金橋公司提供二抗、DAB、檢測試劑盒PV6000，且實施二步法檢測。（2）免疫組化染色和組織芯片：采用QUICK RAY組織芯片制備儀（由韓國UNITMA公司提供）制作組織芯片。首先使用梯度乙醇脫蠟水化后，在雙氧水（3%）中孵育30 min，且封閉內(nèi)源性過氧化物酶。二抗室溫孵育30 min；一抗在溫度為4 ℃環(huán)境下過夜，蘇木精復(fù)染，DAB染色。

1.3 觀察指標(biāo)與評定標(biāo)準(zhǔn) 使用兩種方法對結(jié)果進行判定：（1）使用IMAGE PRO PLUS6.0軟件對組織染色程度進行測量，同時再進行統(tǒng)計學(xué)分析；（2）由醫(yī)生對標(biāo)本進行染色結(jié)果判定，且根據(jù)標(biāo)本染色程度，進行0～4分的標(biāo)準(zhǔn)打分，判定依據(jù)為顏色深淺。對比癌組織和正常組織的免疫組化染色評分以及IMAGE PRO PLUS6.0軟件測量結(jié)果。分析自噬相關(guān)蛋白表達水平變化的相關(guān)性分析P值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗和相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常組織和癌組織免疫組化染色評分比較 腫瘤組織的ATG7、LC3、Beclin 1水平均低于正常組織，ULK1、P62、P-mTOR均高于正常組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而ATG5含量對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.2 正常組織和癌組織免疫組化染色IMAGE PRO PLUS6.0軟件測量結(jié)果比較 腫瘤組織和正常組織ATG7、LC3、Beclin 1、ULK1、P62、P-mTOR含量對比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而ATG5含量對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表2。

2.3 自噬相關(guān)蛋白表達水平變化相關(guān)性分析 Beclin 1

的表達與其他蛋白不相關(guān)，ULK1的表達變化與ATG7和P62相關(guān)，P-mTOR、LC3、P62的表達與ATG7的表達水平變化有關(guān)。

3 討論

在腫瘤進展、發(fā)生過程中，為了維護細胞增殖，需大量的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)。而自噬便屬于腫瘤細胞代謝應(yīng)激和抵抗缺氧的原因，在腫瘤缺乏營養(yǎng)素時，通過增強自噬，無法觀察到較高的血管化區(qū)域[3]，反而言之，自噬的激活能夠產(chǎn)生腫瘤生長必須的底物和能量，其可利于腫瘤細胞的繁殖、生存。同時腫瘤的缺氧化狀態(tài)，可導(dǎo)致預(yù)后較差，且促使血管的凋亡，形成腫瘤組織[4]。腫瘤的中心缺氧，還可促進侵襲細胞存活，誘導(dǎo)自噬。常規(guī)情況下，在BH3區(qū)域中，BCL-2和BCL-XL形成復(fù)合物，當(dāng)機體處于缺氧狀態(tài)，可促使Beclin 1轉(zhuǎn)化為BNIP3，從而釋放Beclin 1誘導(dǎo)自噬激活，克服缺氧[5]。

自噬能夠維持基因穩(wěn)定性，給予細胞提供額外的ATP，及時清除受損細胞和回收失活蛋白[6]。當(dāng)機體代謝壓力達到一定程度時，可過度激活自噬，從而促使細胞凋亡、死亡，此點能夠證實，對于腫瘤細胞而言，自噬具有較為重要的意義，大部分腫瘤細胞均存在凋亡障礙，由此說明，下調(diào)的自噬能夠營造良好的腫瘤生長環(huán)境，且本次研究中，也證實了自噬特異性底物P62的積累，能夠促進腫瘤的生長[7]。同時本次研究還可發(fā)現(xiàn)，腎細胞中較低的自噬相關(guān)蛋白的表達和較少的自噬數(shù)量，能夠表明自噬在腎透明細胞癌中的發(fā)展、發(fā)生意義，提示自噬水平在腫瘤組織中下調(diào)[8]。

目前臨床上，對于自噬的調(diào)控機制尚未闡述清楚，部分學(xué)者認(rèn)為調(diào)節(jié)自噬的閥門為mTOP復(fù)合物活性[9]。Beclin 1被臨床學(xué)者認(rèn)為其是自噬體起始的階段成分之一，屬于一種腫瘤抑制因子，有研究表明，自噬體的形成是由于Beclin 1的嚴(yán)重缺乏。本次研究中發(fā)現(xiàn)，Beclin 1和mTOP在腫瘤組織表達中均存在改變現(xiàn)象，其提示著自噬水平下調(diào)[10]。而本次研究也發(fā)現(xiàn)ATG7和LC3也發(fā)生一定意義的改變，其主要提示著機體存在潛在的調(diào)控位點[11]。無論是遺傳性腎癌還是散發(fā)性腎癌，VHL（VON HIPPEL-LINDAU）基因突變起到較為重要作用，VHL基因突變是導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)因子的聚集，而mTOR通路上調(diào)的主要原因為缺氧誘導(dǎo)因子聚集，因此腎癌自噬調(diào)低的主要原因為VHL基因突變[12]。

自噬在腫瘤治療中存在較多爭議，有研究報道，自噬通過基因敲除和藥物抑制，能夠改善化療藥物耐受性，助于疾病的恢復(fù)，在機體內(nèi)存在長期影響性，但此項結(jié)果有待進一步考察[13]。近年來，臨床發(fā)現(xiàn)多種mTOR抑制劑已開始廣泛應(yīng)用于臨床，且常用于治療晚期腎癌患者，其主要療效為通過調(diào)節(jié)自噬來達到治療效果[14]。通過分析多項研究報道，發(fā)現(xiàn)目前已有多項化合物已被證實，能夠促使腫瘤自噬性細胞的凋亡，包括一種特異性對VHL缺乏腎腫瘤的小分子化合物，其促使自噬性細胞死亡稱為潛在治療方案，但具體療效，還有待證實[15]。

在腎癌患者中，自噬相關(guān)基因的表達與癌癥分期、分級有關(guān)，主要體現(xiàn)為LC3含量的表達，有研究報道，在卵巢癌患者中，LC3的表達與病理分級和病理類型物統(tǒng)計學(xué)意義，其證明在不同腫瘤類型中，自噬的表達存在差異性的[16]。而本次研究中，LC3蛋白表達量與分期、分級存在差異性，從分期角度分析，轉(zhuǎn)移性腎癌患者和進展性腎癌患者比局限性腎癌患者的LC3蛋白更低，其證實了自噬活體的降低與腎透明細胞癌的侵襲、發(fā)生、發(fā)展起到一定作用性，總而言之，自噬的抑制能夠作為進展期腎癌的一個標(biāo)志物[17-18]。

本次實驗主要結(jié)合了免疫組織化學(xué)技術(shù)和組織芯片，從而證實了自噬相關(guān)蛋白和腫瘤組織變化有關(guān)，其中ATG7、LC3、Beclin 1呈現(xiàn)為下調(diào)趨勢[19]，P62、P-mTOR在腫瘤組織中呈現(xiàn)為上調(diào)，結(jié)合電鏡，可了解到腫瘤細胞內(nèi)自噬體數(shù)量少于正常組織[20]，而此種下調(diào)與多種自噬相關(guān)蛋白表達有關(guān)，結(jié)果提示自噬在腎透明細胞癌中表達水平下調(diào)，同時為潛在、新型的治療方式提供了實驗基礎(chǔ)[21]。

總而言之，Beclin 1、ULK1、ATG7、P-mTOR、LC3、P62是影響自噬相關(guān)蛋白下調(diào)的主要原因，而自噬蛋白在腎透明細胞癌中具有重要利用價值，且主要呈現(xiàn)為下調(diào)狀。

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（收稿日期：2017-04-11） （本文編輯：鄧朝陽）