曹覓+許麗琴+劉清忠+齊旭升

[摘要] 目的 觀察藻藍蛋白對大鼠急性心肌缺血再灌注損傷的保護作用。 方法 將48只SPF級SD大鼠左冠狀動脈前降支用絲線結(jié)扎30 min后恢復灌注的方法建立急性心肌缺血再灌注損傷模型，術(shù)后隨機分為模型對照組和藻藍蛋白A、B組，另取8只不造模作為空白對照組。藻藍蛋白A、B兩組用藻藍蛋白混懸液[100、400 mg/（kg·d）]灌胃給藥治療10 d，空白對照組和模型對照組等量生理鹽水灌胃。檢測靜脈血總超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性及大鼠左心室缺血區(qū)心肌組織丙二醛（MDA）含量，免疫組化技術(shù)檢測各組大鼠心肌細胞內(nèi)誘導型一氧化氮合酶（iNOS）的表達，圖像分析法檢測冠狀動脈細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子P21和P27的表達。 結(jié)果 經(jīng)藻藍蛋白治療后，藻藍蛋白A、B兩組T-SOD和GSH-PX活性明顯提高，MDA顯著降低，冠狀動脈P21和P27基因高表達，iNOS陽性細胞數(shù)明顯減少，與模型組和本組成模后比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；藻藍蛋白A、B組組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。 結(jié)論 藻藍蛋白通過促進蛋白依賴激酶抑制因子P21和P27 基因表達，提高T-SOD和GSH-PX酶活性，抑制缺血心肌產(chǎn)生iNOS及脂質(zhì)過氧化反應對心肌細胞的破壞，降低心肌細胞病理性血管重構(gòu)而達到心肌保護作用。

[關(guān)鍵詞] 大鼠；藻藍蛋白；急性缺血再灌注；蛋白依賴激酶抑制因子P21、P27

[中圖分類號] R332；R542.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）05（b）-0025-04

[Abstract] Objective To observe the protective effects of phycocyanin on myocardium in rats with acute myocardial ischemia reperfusion injuries （MIRI）， and explore the mechanism. Methods The model of acute myocardial ischemia reperfusion injury was established by ligating the left anterior descending coronary artery of 48 SPF SD rats with 30 min after reperfusion， then they were divided into 3 groups： model control group， phycocyanin group A and group B， another 8 rats were selected as normal control group. Rats in phycocyanin group A and group B were treated with phycocyanin by intragastric administration [100， 400 mg/（kg·d）] for 10 d， rats in model control group and normal control group were treated with the same does of 0.9% sodium chloride solution by intragastric administration. The activity of T-SOD and GSH-PX were detected in the tail venous blood， the content of MDA in myocardium was detected， the expression of iNOS in cardiac myocytes was detected by immunohistochemistry. The expression of cyclin dependent kinase inhibitor P21 and P27 in coronary artery was detected by image analysis. Results Compared with model control group and after modelling， the activity of T-SOD and GSH-PX in group A and group B improved significantly， the content of MDA reduced significantly， the expression of cyclin dependent kinase inhibitor P21 and P27 in coronary artery improved significantly， the expression of iNOS in cardiac myocytes reduced significantly， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Phycocyanin group A were compared with Phycocyanin group B， the differences were not statistically significant （P > 0.05）. Conclusion Phycocyanin can protect myocardium with MIRI by promoting P21 and P27 gene expression， improving T-SOD and GSH-PX enzyme activity， controlling iNOS and lipid peroxidation of ischemic myocardium and reducing the myocardial cell pathological vascular remodeling.

[Key words] Rat； Phycocyanin； Acute myocardial ischemia reperfusion injuries； Cyclin dependent kinase inhibitor P21， P27

急性心肌缺血再灌注損傷是引起致死性心臟疾病的主因，在搶救和治療過程中造成心肌組織損傷的主要因素不是缺血本身，而是缺血區(qū)心肌組織在恢復血供后，血液中的氧與受損心肌細胞或壞死心肌細胞的溶解物質(zhì)反應后形成的氧自由基破壞組織細胞并造成的缺血再灌注損傷[1]。在缺血組織中具有清除自由基的抗氧化酶類如總超氧化物歧化酶（T-SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）酶合成能力發(fā)生障礙時均會加劇自由基對缺血后再灌注組織的損傷，表現(xiàn)為急性心肌細胞壞死、凋亡、線粒體功能障礙、冠狀動脈細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子P21和P27低表達，最終引起心肌細胞病理性血管重構(gòu)而導致心肌功能抑制[2-3]。在臨床上急性心肌梗死、冠脈搭橋、冠脈溶栓、梗死心肌再通等治療均有可能發(fā)生缺血后再灌注損傷，使用超氧化物歧化酶（SOD）清除自由基可減輕缺血再灌流組織損傷而對心肌起到保護作用[4]。研究表明，藻藍蛋白具有抗炎、抗過敏、維持機體穩(wěn)態(tài)、清除自由基等眾多的藥理活性[5-6]。目前關(guān)于藻藍蛋白對組織缺血再灌注損傷主要局限在腦缺血再灌注損傷方面，且對其有肯定的治療作用，但對急性心肌缺血再灌注損傷卻鮮有研究，本研究選用大鼠建立急性急性心肌缺血再灌注損傷模型，重點觀察藻藍蛋白對引起心肌細胞病理性血管重構(gòu)的P21、P27和誘導型一氧化氮合酶（iNOS）的表達及抗脂質(zhì)過氧化的影響，研究藻藍蛋白對大鼠急性心肌缺血再灌注損傷的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級SD大鼠56只，鼠齡7周，體重（180.0±0.1）g，設(shè)空白對照組（8只）；余下48只隨機分為模型對照組，藻藍蛋白A、B組，每組各16只。大鼠購自湖北省實驗動物中心，合格證：SYXK（鄂）2016-0031。

1.2 儀器及試劑

BL-420S生物機能實驗記錄系統(tǒng)（成都泰盟）；BW-BM1103小動物呼吸機（上海軟隆科技發(fā)展有限公司）。藻藍蛋白（浙江賓美生物科技有限公司，批號：11016 152）；戊巴比妥鈉（上海哈靈生物科技有限公司，批號：160224）；GSH-PX、T-SOD和MDA測試盒（南京建成生物工程研究所，批號：BA8350、A003-6、A003-1）。兔抗P21、P27多克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：LS-C211591、LS-C211597）。

1.3 造模與治療

參照文獻[7]方法，用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，模型對照組、藻藍蛋白A、B組三組大鼠均采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支30 min后恢復灌注的方法造成大鼠急性心肌缺血再灌注損傷模型造模?？瞻讓φ战M不手術(shù)造模。造模過程中注意不要損傷胸膜，并用BW-BM1103小動物呼吸機控制呼吸以免造成氣胸。造模成功標準：在結(jié)扎左冠狀動脈前降支前接好Ⅱ?qū)?lián)導線，結(jié)扎后記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖（BL-420S生物機能實驗記錄系統(tǒng)），以心電圖出現(xiàn)T波高聳、ST段明顯抬高或上移、期前收縮等典型心電圖改變?yōu)槟Ｐ蛷椭瞥晒8]。成模后2 h，藻藍蛋白A和B兩組用藻藍蛋白混懸液[按100、400 mg/（kg·d）]灌胃給藥治療10 d，空白對照組和模型對照組灌等量生理鹽水。

1.4檢測指標及方法

1.4.1 酶及脂質(zhì)代謝產(chǎn)物測定 給藥10 d后分別從尾靜脈血取靜脈血0.1 mL，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定T-SOD、GSH-PX活性，取血后處死大鼠，取左心室缺血心肌組織檢測MDA含量[9]。

1.4.2 免疫組化染色檢測 各組在成模后2 h各取6只，治療10 d時取所有存活動物處死，迅速取心并用生理鹽水沖洗干凈，甲醛固定24 h后乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片（厚5 μm），HE染色后做病理觀察。然后取上述切片，常規(guī)脫蠟，水化，室溫下用0.03的過氧化氫反應10 min，蒸餾水沖洗干凈；然后置于0.01 mol/L的枸櫞酸緩沖液中加熱至沸騰，冷卻15 min后再次加熱至沸騰，自然冷卻后用PBS沖洗3 min；加一抗、二抗，37℃孵育1 h，辣根過氧化物酶標記后37℃孵育20 min，蘇木紫復染（10 s），400倍光鏡下片狀棕黃色顆粒為iNOS陽性表達[10]。觀察時每張切片隨機選4個視野，每視野內(nèi)分別計100個心肌細胞中iNOS陽性細胞數(shù)。檢測P21和P27的表達時，先將缺血區(qū)心肌組織提取蛋白并定量，分別用兔抗P21、P27多克隆抗體孵育1 h，加辣根過氧化酶標記，孵育1 h后用DAB顯色，用圖像分析儀掃描以確定P21、P27光密度（蛋白灰度值OPTDI）值[11]。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，組間差異則采用兩樣本均數(shù)Dunnett檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義

2 結(jié)果

2.1 大鼠治療后心肌及冠狀動脈病理觀察

在治療10 d時模型對照組，藻藍蛋白A、B組各存活6、10、9只，藻藍蛋白A、B組存活率高于模型對照組（P < 0.05）。對存活大鼠病理觀察發(fā)現(xiàn)，模型對照組心肌纖維縱橫紋模糊，肌纖維肥大、溶解、斷裂且纖維間出現(xiàn)顆粒及脂肪樣變性。光鏡下可觀察到冠狀動脈平滑肌細胞組織切片邊緣呈典型的“峰-谷”現(xiàn)象，血管內(nèi)皮剝脫、并有新生內(nèi)膜，血管管壁損傷、狹窄，出現(xiàn)明顯的病理性血管重構(gòu)，提示造模成功。藻藍蛋白A、B組大鼠心肌纖維較模型對照組縱橫紋比較清晰，排列相對整齊，肌纖維間質(zhì)仍可見少量纖維細胞增生、輕度肥大。光鏡下也可觀察到冠狀動脈平滑肌細胞組織切片邊緣無“峰-谷”現(xiàn)象，無血管內(nèi)皮剝脫、新生內(nèi)膜較模型對照組減少69%，冠狀動脈管腔增大，病理性血管重構(gòu)明顯好轉(zhuǎn)。藻藍蛋白A、B組組間病理觀察比較無明顯區(qū)別。

2.2 藻藍蛋白對大鼠活性酶及脂質(zhì)代謝產(chǎn)物的影響

與空白對照組比較，模型對照組成模后和治療10 d T-SOD和GSH-PX活性明顯降低，MDA顯著提高（P < 0.05）。藻藍蛋白A、B組治療10 d時T-SOD和GSH-PX活性明顯提高，MDA顯著降低，與模型對照組和同組成模后比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。藻藍蛋白A、B組組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表1。

2.3 藻藍蛋白對大鼠P21和P27表達的影響

模型對照組成模后和治療10 d后P21和P27均低表達，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。藻藍蛋白A、B組成模后低表達，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），治療10 d高表達，與模型對照組、空白對照組和同組成模后比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。藻藍蛋白A、B組組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表2。

2.4 藻藍蛋白對大鼠心肌細胞中iNOS表達的影響

模型對照組成模后和治療10 d后iNOS陽性細胞數(shù)增多，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P <0.05）。藻藍蛋白A、B組成模后iNOS增多，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），治療10 d顯著降低，與模型對照組、同組成模后比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），但未治療降到正常水平，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。藻藍蛋白A、B組組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表3。

3 討論

醫(yī)學工作者在治療心肌缺血性疾病時，如何防止或減輕急性心肌缺血再灌注損傷造成猝死等嚴重不良事件的發(fā)生而做出了大量研究工作，其研究的重點在于尋找高效、低毒、有效的抑制脂質(zhì)過氧化反應、清除自由基、維持機體穩(wěn)態(tài)、降低心肌細胞病理性血管重構(gòu)而達到心肌保護作用的藥物。研究表明，血管平滑肌細胞的過度增殖是動脈粥樣硬化和冠狀動脈介入治療后再狹窄等血管增殖性疾病的主要病理機制[12]。P21和P27作為細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子，對細胞周期起到負調(diào)控作用，其表達增強可抑制血管平滑肌過度增殖，對心肌細胞及血管平滑肌病理性重構(gòu)起關(guān)鍵調(diào)控作用[13-14]。iNOS作為一氧化氮誘導酶，高表達可產(chǎn)生大量一氧化氮，引起細胞DNA損傷及線粒體呼吸抑制，造成血管內(nèi)皮細胞嚴重損傷，而脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA會加重心肌損傷[15-16]。T-SOD和GSH-PX酶是清除清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化反應的重要的酶[17-18]。研究表明，藻藍蛋白具有口服無毒性、可清除羥自由基和氫過氧自由基的抗氧化活性[19-20]。故在本研究中，選擇了以上引起心肌病理構(gòu)象改變的重要影響因素不研究藻藍蛋白對急性心肌缺血再灌注損傷的影響。

本研究結(jié)合組織病理觀察，發(fā)現(xiàn)藻藍蛋白A、B組大鼠心肌細胞及冠狀動脈平滑肌細胞病理性血管重構(gòu)現(xiàn)象明顯好于模型對照組，且經(jīng)藻藍蛋白治療后，藻藍蛋白A和B兩組T-SOD和GSH-PX活性明顯提高，MDA顯著降低，冠狀動脈 P21和P27 基因高表達，iNOS陽性細胞數(shù)明顯減少。因此，本研究證實藻藍蛋白具有抗冠狀動脈平滑肌內(nèi)皮細胞過度增殖性管腔狹窄的作用，這一現(xiàn)象應與藻藍蛋白通過上調(diào)細胞周期關(guān)鍵抑制因子 P21和P27的基因表達，抑制血管平滑肌過度增殖有關(guān)。另外，藻藍蛋白還通過抑制iNOS表達來降低一氧化氮對心肌細胞DNA 損傷及線粒體呼吸抑制作用，減輕血管內(nèi)皮細胞損傷。藻藍蛋白還可提高T-SOD和GSH-PX活性，促進急性心肌缺血再灌注清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應而對心肌起到保護作用。

綜上所述，藻藍蛋白可提高T-SOD和GSH-PX酶活性、清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應對心肌細胞的破壞，并通過促進蛋白依賴激酶抑制因子P21和P27 基因表達、抑制缺血心肌產(chǎn)生iNOS，降低由此導致的心肌細胞病理性血管重構(gòu)而達到心肌保護作用，有進一步開發(fā)成為抗缺血再灌注損傷的藥物價值。

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（收稿日期：2017-01-21 本文編輯：蘇 暢）