廖昂+鄧啟明+董林玲+余燕飛+刁奇志+丁強(qiáng)

[摘要] 目的 研制基于石墨烯/多壁碳納米管檢測(cè)風(fēng)疹病毒IgM抗體（RV-IgM）的電化學(xué)傳感器，并對(duì)其分析性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。 方法 將風(fēng)疹抗原固定于經(jīng)氧化態(tài)石墨烯（GS）、殼聚糖（CHI）、多壁碳納米管（MWCNT）、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（[BMIM][PF6]-NH2）、金納米離子、硫堇納米材料等生物材料層層修飾的絲網(wǎng)印刷電極表面，并用辣根過(guò)氧化物酶進(jìn)行封閉制得研究所用的電化學(xué)傳感器。使用循環(huán)伏安法對(duì)層層修飾后的傳感器電極進(jìn)行測(cè)試，并對(duì)傳感器進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定傳感器的最佳實(shí)驗(yàn)條件。在最佳實(shí)驗(yàn)室條件下，對(duì)傳感器的分析性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。 結(jié)果 裸電極經(jīng)多種生物材料層層組裝后，電極峰電流逐漸增大；包被抗原及辣根過(guò)氧化物酶后，電極響應(yīng)電流減弱。傳感器的最佳pH值及H2O2濃度分別為7.0和8.0 mmol/L，最佳孵育溫度及時(shí)間分別為35.0℃和30 min。傳感器檢測(cè)RV-IgM的重復(fù)性精密度及日間精密度分別為3.4%、4.9%；線性范圍為0.1～300 pg/mL，檢出限為40 fg/mL；回收率為97.5%，抗干擾性強(qiáng)。 結(jié)論 在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，組裝電化學(xué)傳感器與目前現(xiàn)有的檢測(cè)風(fēng)疹病毒方法比較，具有靈敏度高、精密度和正確度較好、且快速簡(jiǎn)便、可定量的優(yōu)點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] 石墨烯/多壁碳納米管；電化學(xué)傳感器；風(fēng)疹病毒；IgM抗體

[中圖分類號(hào)] R511.203 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）05（b）-0177-04

[Abstract] Objective To develop a electrochemical sensor based on multiwalled carbon nanotube-graphene for detection of the rubella virus IgM antibody and to evaluate its analytical performance. Methods Oxidized graphene （GS）， chitosan （CHI）， multi-wall carbon nano-tubes （MWCNT）， 1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate （six-[BMIM][PF6]-NH2）， gold nanoparticles and thionine biological nanomaterial were used as materials to modify screen printing electrode by layer-by-layer self-assembly and then rubella antigen was immobilized on the assembled electrode surface， afterwards coated by horseradish peroxidase and eventually formed the electrochemical sensor used in this study. The layer-by-layer assembled electrode was scanned by cyclic voltammetry to detect its electrochemical performance. The optimum experimental conditions of the sensor were obtained by optimization experiments. The analytical performance of the sensor was evaluated under the optimum experimental conditions. Results After the bare electrode was assembled with above-mentioned materials， the peak current and conductivity of the electrode gradually increased， and the response current gradually decreased after being coated by antigen and horseradish peroxidase. The optimum pH value and H2O2 concentration were 7.0 and 8.0 mmol/L respectively. The optimum incubation temperature and time were 35.0℃ and 30 minutes respectively. The repeatability precision and inter-day precision of the detection of rubella virus IgM antibody were 3.4% and 4.9% respectively， the linear range was 0.1-300 pg/mL， the detection limit was 40 fg/mL， the recovery rate was 97.5%. And at the same time， the sensor had a good anti-interference performance. Conclusion Under the optimum experimental conditions， the assembled electrochemical sensor for detection of rubella virus has the advantages of higher sensitivity， better precision and accuracy， the rapid and simple operation and also quantifiability compared with the existing methods.

[Key words] Multiwalled carbon nanotube/grapheme； Electrochemical sensor； Rubella virus； IgM antibody

婦女妊娠期間，由于內(nèi)分泌及免疫狀態(tài)的改變，感染風(fēng)疹病毒風(fēng)險(xiǎn)也相應(yīng)增加，從而引起流產(chǎn)或胎兒畸形，甚至死胎[1]。雖然風(fēng)疹病毒疫苗的普及對(duì)預(yù)防其感染起到了重要作用，但體內(nèi)抗體會(huì)隨著時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低。目前我國(guó)每年仍約有4萬(wàn)名新生兒患先天性風(fēng)疹綜合征。目前，檢測(cè)風(fēng)疹病毒的實(shí)驗(yàn)室方法主要為酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法和化學(xué)發(fā)光法，但這兩種方法均存在靈敏度較低、檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)且不能實(shí)時(shí)檢測(cè)的缺點(diǎn)。近年來(lái)電化學(xué)免疫傳感器因其高靈敏度、高特異性、可定量等優(yōu)點(diǎn)逐步應(yīng)用于疾病的診斷，檢測(cè)病毒抗原的檢測(cè)限可達(dá)到30 pg/mL[2]，因此研制用于檢測(cè)風(fēng)疹病毒IgM抗體（RV-IgM）的電化學(xué)免疫傳感器可彌補(bǔ)目前實(shí)驗(yàn)方法的不足。

1 儀器與材料

1.1 儀器

電化學(xué)工作站購(gòu)自上海辰華公司，H-7500透射電子顯微鏡為日本日立公司生產(chǎn)，一次性絲網(wǎng)印刷電極購(gòu)自臺(tái)灣ZensorR&D公司。

1.2 材料

多壁碳納米管（MWCNT）（批號(hào)20131123）購(gòu)自成都有機(jī)化學(xué)品有限公司；石墨烯（批號(hào)20140315）購(gòu)自先豐納米科技有限公司；1-丁基-3甲基-6氟磷酸鹽購(gòu)自上海晨杰化學(xué)品有限公司；殼聚糖（CHI）、辣根過(guò)氧化物酶、過(guò)氧乙酸購(gòu)自上海生工生物科技有限公司；硫堇、氯金酸（批號(hào)20150308）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。風(fēng)疹抗原（批號(hào)20151103）購(gòu)自美國(guó)Meridian公司，風(fēng)疹I(lǐng)gM標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)20151016）購(gòu)自NIBSC。所有試劑均為分析純等級(jí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 電化學(xué)免疫傳感器的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[3-5]制備離子液體-石墨烯（GS-[BMIM][PF6]），將GS-[BMIM][PF6]與生物保護(hù)劑CHI、MWC-NT混合，得到MWCNT-CHI-GS-[BMIM][PF6]納米復(fù)合材料，取該混合物滴加在絲網(wǎng)印刷電極中的工作電極表面，自然干燥1 d。隨后將金納米離子及硫堇先后滴在MWCNT-CHI-GS-[BMIM][PF6]修飾的絲網(wǎng)印刷電極表面，37℃自然干燥1 d，如此反復(fù)3次。最后在電極表面滴加8 ng的風(fēng)疹抗原包被液，自然風(fēng)干過(guò)夜，用蒸餾水進(jìn)行沖洗，去除未固定的抗原，滴加5 μL 0.25% HRP溶液進(jìn)行封閉，放置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 傳感器的性能檢測(cè)

分別對(duì)石墨烯及納米金進(jìn)行透射電鏡掃描。對(duì)層層修飾后的電極在含有0.1 mol/L氯化鉀的5 mmol/L Fe（CN）63-/4-溶液中使用循環(huán)伏安法從0.1～0.7 V進(jìn)行掃描（掃描速度為0.05 V/s），得到不同的循環(huán)伏安圖。

2.1.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

分別在不同的pH值溶液、不同濃度的H2O2溶液中對(duì)傳感器電極的響應(yīng)電流進(jìn)行檢測(cè)，響應(yīng)電流最大，峰值電流的增幅最大時(shí)的pH值及H2O2濃度為最佳，以及在不同的孵育溫度、孵育時(shí)間，電極響應(yīng)電流最低的孵育溫度及時(shí)間為最佳。

2.1.4 電化學(xué)免疫傳感器的分析性能測(cè)試

在以上實(shí)驗(yàn)所得最佳實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)組裝的電化學(xué)傳感器進(jìn)行性能測(cè)試。

2.1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及檢測(cè)限的檢測(cè) 使用研制的電化學(xué)傳感器，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)不同濃度的RV-IgM標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作線性回歸分析。同樣條件下對(duì)空白實(shí)驗(yàn)液進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)3次，計(jì)算出檢測(cè)限。

2.1.4.2 精密度測(cè)試 一天之內(nèi)檢測(cè)濃度為100 U/mL RV-IgM 3次，連續(xù)檢測(cè)5 d，分別計(jì)算批內(nèi)及批間精密度。

2.1.4.3 準(zhǔn)確度驗(yàn)證 取0.1 mL濃度為100 U/mL的RV-IgM標(biāo)準(zhǔn)品作為回收實(shí)驗(yàn)管及不含RV-IgM的生理鹽水作為空白管，使用研制的傳感器分別對(duì)實(shí)驗(yàn)管及空白管連續(xù)檢測(cè)3次，取均值作為回收實(shí)驗(yàn)濃度及本底濃度，標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為標(biāo)準(zhǔn)濃度，計(jì)算回收率，回收率=回收濃度/標(biāo)準(zhǔn)濃度×100%。

2.1.4.4 干擾實(shí)驗(yàn) 分別將0.1 mL濃度為10 μg/mL的單純孢疹病毒IgG、類風(fēng)濕因子和人乳頭狀瘤病毒IgG作為干擾物加入0.9 mL濃度為100 U/mL RV-IgM溶液中，作為實(shí)驗(yàn)管，不含干擾物的同濃度的RV-IgM溶液作為對(duì)照管，進(jìn)行測(cè)量。

2.1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPPS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，將干擾實(shí)驗(yàn)的含干擾物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)管測(cè)量結(jié)果分別與對(duì)照管測(cè)量結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，P < 0.05，則干擾可接受。

2.2 結(jié)果

2.2.1 電鏡掃描結(jié)果

MWCNT-GS-Chit-[BMIM][PF6]納米復(fù)合材料經(jīng)透射電子顯微鏡掃描結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2.2 傳感器的性能檢測(cè)結(jié)果

納米材料經(jīng)層層修飾電極后，以0.05 V/s掃描速度對(duì)電極進(jìn)行掃描，得到的循環(huán)伏安圖見(jiàn)圖2，可見(jiàn)隨著修飾材料的增加，電極電流逐漸增強(qiáng)。

2.2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

對(duì)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系的最佳pH值、H2O2濃度、抗體的孵育時(shí)間及溫度的選擇進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得出：最佳pH值為7.0，最佳H2O2濃度為8.0 mmol/L，最佳孵育溫度為35.0℃，最佳孵育時(shí)間為30 min。見(jiàn)圖3～6。

2.2.4 電化學(xué)免疫傳感器的分析性能測(cè)試結(jié)果

2.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測(cè)限 回歸方程為Y = 0.2776X+5.4813，相關(guān)系數(shù)為0.98，線性范圍為0.1～300 pg/mL，檢測(cè)限為40 fg/mL。見(jiàn)圖7。

2.2.4.2 電化學(xué)免疫傳感器精密度測(cè)量結(jié)果 計(jì)算得出重復(fù)性精密度、批間精密度、日間精密度分別為3.4%、4.1%、4.9%。

2.2.4.3 電化學(xué)免疫傳感器正確度測(cè)量結(jié)果 回收實(shí)驗(yàn)濃度及本底濃度均值分別為97.8、0.03 U/mL，由此計(jì)算的回收濃度（回收實(shí)驗(yàn)濃度-本底濃度）及回收率分別為97.5 U/mL及97.5%。

2.2.4.4 抗干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果 對(duì)照管濃度為（89.96±3.52）U/mL，含單純孢疹病毒IgG、類風(fēng)濕因子和人乳頭狀瘤病毒IgG干擾物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)管濃度分別為（90.52±3.51）、（89.87±3.12）、（90.78±3.76）U/mL，對(duì)照管濃度與以上實(shí)驗(yàn)管濃度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P > 0.05）。

3 討論

CHI含大量羥基和氨基，對(duì)生物大分子及有機(jī)小分子具有較強(qiáng)的吸附能力，且具有良好的生物相容性、滲透性及成膜性，但導(dǎo)電性能較差，而石墨烯是目前已知最薄的二維材料，與MWCNT一樣具有較高的比表面積（2630 m2/g）及導(dǎo)電性能[8-9]，但其不溶于水，易聚集。本研究使用[BMIM][PF6]-NH2與石墨烯反應(yīng)，解決了這個(gè)問(wèn)題，得到溶解均勻的離子液體石墨烯。加入石墨烯、MWCNT及納米金可彌補(bǔ)CHI導(dǎo)電性較差的缺陷。從層層修飾電極的循環(huán)伏安圖可以看出：未組裝前裸電極由于缺乏電子媒介體，CV圖為一對(duì)平坦的氧化還原峰曲線，通過(guò)層層修飾后，電極的峰電流逐漸增大，結(jié)果證明電極通過(guò)層層修飾后具有良好的電化學(xué)特性。由于不適合的pH值及H2O2濃度會(huì)影響抗原及抗體的活性，同樣，抗體孵育溫度及時(shí)間會(huì)影響抗原抗體結(jié)合效率，從而影響整個(gè)實(shí)驗(yàn)的效果。因此，需對(duì)以上條件進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。本研究結(jié)果顯示，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，傳感器電極的響應(yīng)電流與RV-IgM濃度的對(duì)數(shù)值具有較好的負(fù)相關(guān)關(guān)系。與現(xiàn)有檢測(cè)方法比較，具有較高的靈敏度（檢測(cè)限為40 fg/mL）、較好的精密度和正確度[11-12]。如使用成品的組裝電極，整個(gè)檢測(cè)時(shí)間可縮短至30～40 min，所以該方法不失為一種檢測(cè)RV-IgM的良好方法。但組裝好的成品免疫電極的穩(wěn)定性也許會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果有所影響，目前我們未做這方面的研究，如果成品免疫電極在4℃的穩(wěn)定性能能超過(guò)半年，則可廣泛應(yīng)用于RV-IgM的臨床檢測(cè)。

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（收稿日期：2017-01-21 本文編輯：張瑜杰）