馬艷，宋娜，牛建一，丁剛

(1 濰坊醫(yī)學院，山東濰坊261042；2 聊城市人民醫(yī)院；3 濰坊醫(yī)學院附屬益都中心醫(yī)院)

原發(fā)性PD患者SMPD1基因3、4號外顯子突變及其臨床意義

馬艷1，宋娜2，牛建一3，丁剛3

(1 濰坊醫(yī)學院，山東濰坊261042；2 聊城市人民醫(yī)院；3 濰坊醫(yī)學院附屬益都中心醫(yī)院)

目的 探討SMPD1基因3、4號外顯子突變與原發(fā)性帕金森病(PD)的關系。方法 選擇臨床確診的原發(fā)性PD患者103例(PD組)、體檢健康者103例(對照組)，按照SMPD1基因序列和相關文獻設計引物，采用PCR技術(shù)對SMPD1基因3、4號外顯子進行擴增，并將PCR產(chǎn)物進行序列測序和突變分析。結(jié)果 經(jīng)對測序結(jié)果序列比對發(fā)現(xiàn)，兩組SMPD1基因存在p.A402T位點突變，均為雜合突變，即基因型為GA型。其中，PD組SMPD1基因p.A402T位點突變概率為11.65%(12/103)，對照組為0.97%(1/103)，兩組比較P<0.01。生物信息學分析顯示，該突變導致其編碼的溶酶體酶SMase穩(wěn)定性降低。Mutation Taster和PolyPhen2軟件檢測結(jié)果顯示，SMPD1基因存在p.A402T位點致病性突變。結(jié)論 原發(fā)性PD患者SMPD1基因存在p.A402T位點突變，該位點突變可能增加PD的發(fā)病風險。

帕金森病；SMPD1基因；p.A402T突變

帕金森病(PD)又稱震顫性麻痹，是一種僅次于阿爾茨海默病的常見神經(jīng)退行性疾病，多見于60歲以上老年人。其臨床癥狀主要表現(xiàn)為靜止性震顫、行動遲緩、肌強直和姿勢不穩(wěn)[1]?，F(xiàn)已證實，原發(fā)性PD(本研究以下稱PD)的發(fā)病與某些基因突變有關。在德系猶太人群中LRRK2、GBA初始突變與PD的發(fā)病關系密切，而LRRK2基因p.G2019S和GBA初始突變的概率分別為15%、20%[2，3]。SMPD1基因突變最早報道能夠引起一種常染色體隱性遺傳性溶酶體貯積病——尼曼匹克病。最近研究發(fā)現(xiàn)，SMPD1基因突變可引起溶酶體功能喪失，導致體內(nèi)的α突觸核蛋白聚合和路易小體沉積，從而導致PD[4，5]。在猶太人群中，PD的發(fā)病與SMPD1基因p.L302P[4]、c.996delC(fsP330)[6]位點突變有關，特別是p.L302P位點，但在中國人群中并未發(fā)現(xiàn)p.L302P位點突變[5,7]；另有研究發(fā)現(xiàn)，在中國人群中SMPD1基因p.R591C位點突變和Leu-Ala(Val)重復變異與PD的發(fā)病有關[8,9]。以上研究提示，PD可能在不同區(qū)域、不同種族中具有遺傳異質(zhì)性。本研究分析103例PD患者SMPD1基因3、4號外顯子突變情況，旨在為進一步尋找中國PD患者SMPD1基因外顯子上可能的致病突變位點。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年6月～2016年6月聊城市人民醫(yī)院和益都中心醫(yī)院收治的PD患者103例(PD組)，其中，男67例、女36例，發(fā)病年齡50～78歲(66.5±11.39)歲。PD均為散發(fā)；其診斷符合英國BrainBank標準[10]：運動遲緩且至少具備肌強直、靜止性震顫或姿勢平衡障礙(并非由于原發(fā)的視覺、前庭、小腦或本體感覺造成)中的一項。排除繼發(fā)性PD、帕金森疊加綜合征和其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病，甲亢及其他遺傳性疾病。同期另選與PD組性別、年齡匹配的體檢健康者103例(對照組)，男67例、女36例，年齡(65.4±12.1)歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2 SMPD1基因3、4號外顯子測序及突變分析

1.2.1 DNA提取 收集所有研究對象肘正中靜脈血5 mL，置于含EDTA的抗凝管中，混勻，置于-80 ℃冰箱保存。采用血液基因組DNA提取試劑盒提取全血基因組DNA，然后將提取的DNA溶于50～100 μL無菌ddH2O中。NanoDrop2000超微量分光光度計檢測DNA的純度和濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增 查詢文獻[11]設計SMPD1基因3、4號外顯子擴增引物，并根據(jù)SMPD1基因序列(GenBank NC 000011.10)進行修正，兩個外顯子通用一個引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。上游引物：5′-ACTGTGAGCTCCTTGCAGGT-3′，下游引物：5′-TGCTCAAGGGAATTTTCAGC-3′，擴增產(chǎn)物片段長度667 bp。PCR反應體系共25 μL：Taq DNA聚合酶1 μL，DNA模板(50～100 ng/μL)1 μL，上下游引物各0.5 μL，10×PCR緩沖液(含有MgCl2)2.5 μL和2.5 mmol/L dNTP 1 μL，無菌ddH2O補足至25 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃充分延伸5 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物基因測序 取PCR產(chǎn)物5 μL+6×Loading Dye 1 μL混勻，行1%瓊脂糖凝膠電泳，D100Marker作為標準對照。紫外分光光度計確認擴增產(chǎn)物質(zhì)量，將質(zhì)量符合要求(條帶大小正確，無雜帶)的未純化PCR產(chǎn)物委托上海生工生物工程股份有限公司進行基因突變測序。

1.2.4 基因序列比對 采用NCBI網(wǎng)站提供的Blast軟件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行比對。根據(jù)比對結(jié)果判別基因有無突變。

1.2.5 生物信息學分析 采用SIFT(Scale Invariant Feature Transform，http://sift.jcvi.org/)、I-Mutant2.0(http://folding.biofold.org/i-mutant/i-mutant2.0.html)和MUpro(http://mupro.proteomics.ics.uci.edu/)進行生物信息學分析，檢驗SMPD1基因上新的突變點對其編碼的溶酶體酶SMase穩(wěn)定性的影響。使用Mutation Taster(http://www.mutationtaster.org/)和PolyPhen2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)檢測突變點的致病性。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。基因頻率和基因型分析采用基因計數(shù)法，計數(shù)資料以比例和率(%)表示，兩組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 PCR擴增產(chǎn)物的電泳條帶呈單一明亮條帶且清晰無雜質(zhì)，目的條帶大小為667 bp。見插頁Ⅳ圖6。

2.2 PCR產(chǎn)物測序突變分析 基因庫中SMPD1基因p.A402T位點共有3種基因型：GG(野生純合子)、GA(雜合子突變)、AA(純合子突變)。經(jīng)對測序結(jié)果序列比對發(fā)現(xiàn)，兩組SMPD1基因存在p.A402T位點突變，均為雜合突變，即基因型為GA型。見插頁Ⅳ圖7。其中PD組SMPD1基因p.A402T位點突變概率為11.65%(12/103)，對照組為0.97%(1/103)，兩組比較P<0.01。

2.3 生物信息學分析 SMPD1基因p.A402T突變很可能編碼的溶酶體酶SMase穩(wěn)定性降低(在I-Mutant2.0軟件和MUpro軟件上完成)，影響蛋白質(zhì)的功能(在SIFT軟件上完成)。Mutation Taster軟件檢測結(jié)果顯示，SMPD1基因p.A402T存在致病突變位點；PolyPhen2軟件檢測結(jié)果顯示，HumDiv為0.999，HumVar為0.939。見插頁Ⅳ圖8、表1。

表1 SMPD1基因突變的軟件預測情況

注：SIFT得分<0.05為有害突變；PolyPhen2得分越接近1，突變致病性越高。

3 討論

PD是一種以運動障礙為主要表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其主要病理學特征是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元進行性變性和脫失，以及細胞內(nèi)以泛素和α-突觸核蛋白為主要成分的路易小體的形成。迄今為止，PD的病因和發(fā)病機制尚未完全清楚，越來越多的研究認為，遺傳因素在其發(fā)病中具有重要作用。據(jù)GWAS報道，很多易感基因或候選基因可導致PD的發(fā)病風險升高[12,13]，這些易感基因或候選基因通過不同路徑損害細胞的新陳代謝。在PD發(fā)病機制中，細胞的溶酶體自我吞噬通路(ALP)即是其中的一種重要途徑[14]。多巴胺能神經(jīng)元胞質(zhì)中異常蛋白質(zhì)的積累可能是由于正常ALP通路功能紊亂引起，最終導致細胞凋亡和PD的臨床表現(xiàn)。GBA和SMPD1編碼的溶酶體酶在維持ALP通路的正常功能方面具有重要作用[14,15]。有研究已發(fā)現(xiàn)，SMPD1基因p.L302P位點突變使PD的發(fā)生率提高了9倍[4]，此為ALP通路在PD發(fā)病機制中的作用提供了額外證據(jù)。

SMPD1基因位于11p15.1～p15.4，全長共4 685 bp，包含6個外顯子和5個內(nèi)含子。其編碼產(chǎn)物是由629個氨基酸組成的鞘磷脂酸性二酯酶1(SMase)，其是一種溶酶體酶，可裂解鞘磷脂膽堿磷酸頭基，由此生成的神經(jīng)酰胺在壓力條件下作為第二信使啟動凋亡反應。溶酶體是降解α突觸核蛋白的主要的細胞器[16]，PD的病理特點是蛋白質(zhì)(以α突觸核蛋白為主)聚集形成路易小體[17]。SMPD1與GBA均是溶酶體基因，GBA和SMPD1基因編碼的溶酶體分解酶GCase和SMase是否以類似的方式參與PD的發(fā)病機制尚無定論。有研究發(fā)現(xiàn)，他們有一個共同特點，即酶法分解的最終產(chǎn)物均是神經(jīng)酰胺。神經(jīng)酰胺代謝途徑缺失能改變?nèi)苊阁w酶的性能和功能，從而導致α突觸核蛋白的積累和路易小體的形成，繼而導致PD發(fā)病。PANK2和PLA2G6基因參與神經(jīng)酰胺引起的神經(jīng)退行性疾病(PANK2和PLA2G6分別引起1型和2型大腦鐵沉積性神經(jīng)退行性變)，其中也有路易小體的形成[16]，進一步證實上述結(jié)論。

近年研究發(fā)現(xiàn)，GBA突變可引起葡萄糖神經(jīng)酰胺的聚集，從而阻止α突觸核蛋白的降解，集聚的α突觸核蛋白可促進其低聚物形成和神經(jīng)毒性作用[17,18]；α突觸核蛋白積累可阻礙GCase從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到溶酶體的轉(zhuǎn)運，進一步損害溶酶體GCase的活性，從而增加路易小體的形成。因此，GCase活性的喪失創(chuàng)建了一個溶酶體功能減弱和α突觸核蛋白積累的正反饋回路，最終導致神經(jīng)退化。與GCase缺乏類似，SMase缺乏與α突觸核蛋白相互作用從而促進神經(jīng)毒性，繼而導致PD的發(fā)展。

本研究在SMPD1基因上發(fā)現(xiàn)了一個新的突變點p.A402T，即該基因402號位點上的丙氨酸被蘇氨酸取代，從而改變了其編碼的蛋白質(zhì)酶作用和活性。SIFT系統(tǒng)表明，該突變能夠改變蛋白質(zhì)的功能，I-Mutant2.0軟件和MUpro軟件對SMPD1基因p.A402T突變的評估亦支持上述結(jié)論。表明SMPD1基因p.A402T位點突變能夠降低SMase的穩(wěn)定性，該位點突變具有致病性。此外，本研究在PD患者中發(fā)現(xiàn)在尼曼匹克病中未出現(xiàn)過的p.A402T突變，這可能與篩選的中國尼曼匹克病病例數(shù)量有限有關。SMPD1突變引起的PD并不伴有獨特的PD臨床特點，其臨床表現(xiàn)與GBA以及其他基因突變攜帶者表現(xiàn)相似。目前無法估計SMPD1基因突變在全世界PD發(fā)病機制中的作用，但這個發(fā)現(xiàn)為進一步了解PD潛在的發(fā)病機制具有重要意義。

綜上所述，PD患者SMPD1基因存在p.A402T位點突變，該位點突變可能增加PD的發(fā)病風險。今后我們將加大樣本對SMPD1基因進行檢測，并對p.A402T位點進一步研究，為PD發(fā)病機制和治療提供新的線索和潛在的藥物作用靶點。

[1] 湯森路透.疾病綜述：帕金森病[J].國際藥學研究雜志，2015，42(3)：338-345.

[2] Swan M, Doan N, Ortega RA, et al. Neuropsychiatric characteristics of GBA-associated Parkinson disease[J]. J Neurol Sci, 2016(370):63-69.

[3] Healy DG, Falchi M, O′Sullivan SS, et al. Phenotype, genotype, and worldwide genetic penetrance of LRRK2-associated Parkinson′s disease: a case-control study[J]. Lancet Neurol, 2008,7(7):583-590.

[4] Gan-Or Z, Ozelius LJ, Bar-Shira A, et al. The p.L302P mutation in the lysosomal enzyme gene SMPD1 is a risk factor for Parkinson disease[J]. Neurology, 2013,80(17):1606-1610.

[5] Zeidan YH, Hannun YA. The acid sphingomyelinase/ceramide pathway: biomedical significance and mechanisms of regulation[J]. Curr Mol Med, 2010,10(5):454-466.

[6] Dagan E, Schlesinger I, Ayoub M, et al. The contribution of Niemann-Pick SMPD1 mutations to Parkinson disease in ashkenazi jews[J]. Parkinsonism Relat Disord, 2015,21(9):1067-1071.

[7] Li K, Tang BS, Yang NN, et al. Association study between SMPD1 p.L302P and sporadic Parkinson′s disease in ethnic Chinese population[J]. Int J Clin Exp Med, 2015,8(8):13869-13873.

[8] Foo JN, Liany H, Bei JX, et al. Rare lysosomal enzyme gene SMPD1 variant (p.R591C) associates with Parkinson′s disease[J]. Neurobiol Aging, 2013,34(12):2890.

[9] Mao CY, Yang J, Wang H, et al. SMPD1 variants in Chinese Han patients with sporadic Parkinson′s disease[J]. Parkinsonism Relat Disord, 2017(34):59-61.

[10] da Veiga Pereira L, Desnick RJ, Adler DA, et al. Regional assignment of the human acid sphingomyelinase gene (SMPD1) by PCR analysis of somatic cell hybrids and in situ hybridization to 11p15.1-p15.4[J]. Genomics, 1991,9(2):229-234.

[11] Simonaro CM, Desnick RJ, Mcgovern MM, et al. The demographics and distribution of type B Niemann-Pick disease: novel mutations lead to new genotype/phenotype correlations[J]. Am J Hum Genet, 2002,71(6):1413-1419.

[12] Lill CM, Roehr JT, Mcqueen MB, et al. Comprehensive research systematic meta-analyses in Parkinson′s disease genetics: The PDGene database[J]. PLoS Genet, 2012,8(3):e1002548.

[13] Nalls MA, Plagnol V, Hernandez DG, et al. Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson′s disease: a meta-analysis of genome-wide association studies[J]. Lancet, 2011,377(9766):641-649.

[14] Sharma N. Lysosomal enzyme defects and Parkinson disease[J]. Neurology, 2013,80(17):1544-1545.

[15] Trinh J, Farrer M. Advances in the genetics of Parkinson disease[J]. Nat Rev Neurol, 2013,9(8):445-454.

[16] Bras J, Singleton A, Cookson MR, et al. Emerging pathways in genetic Parkinson′s disease: potential role of ceramide metabolism in Lewy body disease[J]. Febs J, 2008,275(23):5767-5773.

[17] Dehay B, Martinez-Vicente M, Caldwell GA, et al. Lysosomal impairment in Parkinson′s disease[J]. Mov Disord, 2013,28(6):725-732.

[18] Deng H, Xiu X, Jankovic J. Genetic convergence of Parkinson′s disease and lysosomal storage disorders[J]. Mol Neurobiol, 2015,51(3):1554-1568.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.20.026

R742.5

B

1002-266X(2017)20-0079-03

2017-02-09)