吳琳，張?zhí)K寧

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，沈陽(yáng) 110004)

非小細(xì)胞肺癌組織EGFR、TTF-1、CK7表達(dá)及其意義

吳琳，張?zhí)K寧

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，沈陽(yáng) 110004)

目的 探討表皮生長(zhǎng)因子(EGFR)、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1(TTF-1)、細(xì)胞角蛋白7(CK7)在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法 選擇89例NSCLC患者手術(shù)切除腫瘤組織標(biāo)本為觀察組，60例肺良性腫瘤患者的肺組織標(biāo)本為對(duì)照組。采用免疫組化SABC法檢測(cè)兩組EGFR、TTF-1、CK7表達(dá)。分析觀察組EGFR、TTF-1、CK7表達(dá)與NSCLC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果 觀察組EGFR、TTF-1、CK7陽(yáng)性表達(dá)率均高于對(duì)照組，P均<0.05；觀察組EGFR、TTF-1、CK7表達(dá)與腫瘤類型、分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)。與患者性別、年齡、腫瘤體積無(wú)關(guān)(P均>0.05)。Spearman秩相關(guān)分析顯示，觀察組EGFR表達(dá)與TTF-1、CK7表達(dá)呈正相關(guān)(rs分別為0.339、0.627，P均<0.05)，TTF-1表達(dá)與CK7表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.591，P<0.05)。結(jié)論 EGFR、TTF-1、CK7可能參與了NSCLC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，檢測(cè)EGFR、TTF-1、CK7表達(dá)有助于NSCLC的早期診斷和病情評(píng)估。

非小細(xì)胞肺癌；表皮生長(zhǎng)因子；甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1；細(xì)胞角蛋白7

肺癌是臨床常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，具有發(fā)病率和病死率高的特點(diǎn)，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占原發(fā)性肺癌的85%[1]。隨著環(huán)境污染的加劇和人口老齡化的到來(lái)，肺癌發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)。NSCLC是肺癌最常見(jiàn)的病理類型之一。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早期評(píng)估NSCLC患者的病情對(duì)制定科學(xué)合理的治療方案，改善預(yù)后，提高患者生命質(zhì)量有重要價(jià)值。隨著分子生物學(xué)研究的快速發(fā)展，腫瘤標(biāo)志物用于輔助診斷惡性腫瘤成為研究熱點(diǎn)。研究表明[2]，表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1(TTF-1)是肺腺癌的一個(gè)特異性較高的血清學(xué)標(biāo)志物，TTF-1表達(dá)升高參與了肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，亦與肺腺癌的病情嚴(yán)重程度、預(yù)后有關(guān)[3]。細(xì)胞角蛋白7(CK-7)在乳腺癌、肺腺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率升高，且參與了二者的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[4]。但是目前尚未見(jiàn)有關(guān)NSCLC組織中EGFR、TTF-1、CK7表達(dá)變化及其臨床意義的相關(guān)研究。2015年1月～2016年12月，我們觀察了NSCLC患者腫瘤組織中EGFR、TTF-1、CK-7表達(dá)變化，現(xiàn)分析結(jié)果，探討EGFR、TTF-1、CK-7在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取同期收治的89例NSCLC患者為觀察組，其中男62例，女27例；年齡33～78(58.7±6.5)歲。按照2010年美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)第8版[5]和國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)第7版[6]肺癌診斷、病理分型和臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，本組腺癌57例，鱗癌32例；腫瘤直徑<3 cm者27例，≥3 cm者62例；分化程度為中低分化51例，高分化38例；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期44例，Ⅲ～Ⅳ期45例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移56例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)纖維支氣管鏡檢查以及病理組織學(xué)檢查確診為NSCLC；②術(shù)前未接受過(guò)放化療；③術(shù)后生存3個(gè)月以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠期以及哺乳期婦女；②心臟功能不全者；③肝、腎功能障礙者；④合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤以及可能影響本研究結(jié)果的疾病患者。另選取同期收治的60例肺良性腫瘤患者為對(duì)照組，其中男39例，女21例；年齡30～81(56.2±7.6)歲。兩組年齡、性別分布具有可比性。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 腫瘤組織EGFR、TTF-1、CK-7表達(dá)檢測(cè) 分別取兩組手術(shù)切除的腫瘤組組織標(biāo)本，石蠟包埋并切片。采用免疫組化鏈霉親和素生物素過(guò)氧化物酶復(fù)合物(SABC)法檢測(cè)EGFR、TTF-1、CK-7表達(dá)。具體步驟：組織切片行乙醇水化，以濃度為0.1 mol/L PBS浸洗5 min，重復(fù)3次；將1份30%的過(guò)氧化氫與10份蒸餾水混合后，室溫下將組織切片靜置10 min，滅活內(nèi)源性酶，然后PBS浸洗3次；熱修復(fù)組織切片，每間隔10 min重復(fù)1次，共2次，冷卻后采用濃度為0.1 mmo/L PBS浸洗3次。將5%的牛血清白蛋白封閉液(A液)滴加在切片上，在室溫下保存20 min；滴加工作濃度為1∶100的一抗(EGFR單克隆抗體、TTF-1單克隆抗體、CK7單克隆抗體)，4 ℃下過(guò)夜。以0.1 mmol/L PBS浸洗3次，于切片上滴加工作濃度為1∶100的二抗(生物素化山羊抗小鼠IgG，B液)，37 ℃放置20 min。以0.1 mmol/L PBS浸洗3次，滴加試劑SABC(C液)后在37 ℃環(huán)境下放置20 min。以0.1 mmol/L PBS浸洗5 min，重復(fù)4次，最后取1 mL蒸餾水并在其中滴加顯色劑DAB中A、B、C試劑1滴，充分混勻后將切片加入其中并在室溫下進(jìn)行顯色反應(yīng)，光鏡下觀察染色結(jié)果。主要試劑EGFR單克隆抗體、TTF-1單克隆抗體、CK7單克隆抗體均購(gòu)自于福州邁新公司，即用型免疫組化SABC法檢測(cè)試劑盒購(gòu)于武漢博士德公司(生產(chǎn)批號(hào)：SA1021)。 結(jié)果判定： EGFR陽(yáng)性染色主要存在于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜中，呈棕黃色或棕褐色顆粒；TTF-1陽(yáng)性染色主要存在于細(xì)胞核中，呈黃色或棕黃色顆粒；CK7陽(yáng)性染色主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，呈黃色或棕黃色顆粒。由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師進(jìn)行雙盲閱片。采用半定量方法判斷兩組標(biāo)本EGFR、TTF-1、CK-7染色結(jié)果。分別對(duì)鏡下陽(yáng)性染色細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度給予評(píng)分。陽(yáng)性染色細(xì)胞百分比：每張切片上觀察5個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性染色細(xì)胞百分比(陽(yáng)性染色細(xì)胞/1 000×100%)，陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5%～<25%為1分，25%～<50%為2分，50%～<75%為3分，75%～100%為4分。陽(yáng)性染色強(qiáng)度：無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩者計(jì)分相乘，0分者為陰性，≥1分為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組EGFR、TTF-1、CK7陽(yáng)性表達(dá)率比較 觀察組及對(duì)照組EGFR陽(yáng)性表達(dá)率分別為59.55%(53/89)、18.33%(11/60)，TTF-1表達(dá)陽(yáng)性率分別為53.93%(48/89)、11.67%(7/60)，CK7陽(yáng)性表達(dá)率分別為57.30%(51/89)、16.67%(10/60)；兩組比較P均<0.05。

2.2 觀察組EGFR、TTF-1、CK7表達(dá)的相關(guān)性 經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析，觀察組EGFR表達(dá)與TTF-1、CK7表達(dá)呈正相關(guān)(r分別為0.339、0.627，P均<0.05)，TTF-1表達(dá)與CK7表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.591，P<0.05)。

2.3 NSCLC組織EGFR、TTF-1、CK7表達(dá)與NSCLC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 EGFR、TTF-1、CK7陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤類型分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)(P均<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑均無(wú)關(guān)(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 NSCLC組織EGFR、TTF-1、CK7表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系[例(%)]

3 討論

肺癌早期篩查技術(shù)的應(yīng)用以及個(gè)體化的治療方案降低了肺癌的死亡率，但其5年生存率仍低于15%，高復(fù)發(fā)率是目前臨床攻克肺癌的難點(diǎn)[8,9]。NSCLC發(fā)病隱匿，早期缺乏特異性的臨床癥狀和體征，大部分患者確診時(shí)已處于中晚期，或已發(fā)生轉(zhuǎn)移，延誤了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)[10]。隨著對(duì)肺癌分子生物學(xué)的深入研究，腫瘤分子標(biāo)志物用于輔助診斷惡性腫瘤成為研究熱點(diǎn)。目前常用到的腫瘤標(biāo)志物包括糖類抗原、胚胎抗原、腫瘤相關(guān)的酶、細(xì)胞角蛋白以及癌基因等[11]。尋找特異性和敏感性高的腫瘤標(biāo)志物有助于早期診斷并評(píng)估NSCLC患者的病情，從而為制定患者的針對(duì)性、個(gè)體化治療方案提供指導(dǎo)[12]。

EGFR是ErbB家族成員中的跨膜糖蛋白，是一種酪氨酸激酶型受體。研究發(fā)現(xiàn)，50%～80%的NSCLC患者腫瘤組織中存在不同程度的EGFR高表達(dá)[13]；EGFR基因突變率高達(dá)49.1%[14]。病理生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，EGFR的過(guò)度表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的血管生成、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。TTF-1分子量為38 kD，是由14q13染色體上的NKX2-1基因所編碼，用于調(diào)節(jié)組織特異性表面活性載脂蛋白A、B、C、Clara細(xì)胞抗原以及T1α表達(dá)的蛋白質(zhì)。TTF-1在人類胚肺以及成年肺中可持續(xù)表達(dá)，是維持肺正常發(fā)育和功能的重要蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，TTF-1異常表達(dá)與肺部多種疾病密切相關(guān)，而在肺腺癌組織中TTF-1呈特異性高表達(dá)，可作為鑒別診斷原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性肺腺癌的重要標(biāo)志物[15]。CK7主要表達(dá)于大多數(shù)的正常組織腺上皮以及移行上皮細(xì)胞中，其在乳腺、卵巢以及肺等腺癌組織中呈陽(yáng)性表達(dá)，是鑒別診斷惡性腫瘤的重要免疫標(biāo)志物；CK7對(duì)肺腺癌診斷的敏感性和特異性較高，分別為98.36%和86.42%[16]。

本研究觀察組EGFR、TTF-1、CK7陽(yáng)性表達(dá)率均高于對(duì)照組，提示NSCLC組織中EGFR、TTF-1、CK7呈不同程度的高表達(dá)，三者可用于NSCLC的輔助診斷。研究發(fā)現(xiàn)，TTF-1、CK7表達(dá)與腫瘤病理類型有關(guān)，肺腺癌組織中TTF-1、CK7陽(yáng)性表達(dá)率高于肺鱗癌[11]，本研究得到相似結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織分化程度低、臨床分期晚以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者上述標(biāo)志物的陽(yáng)性表達(dá)率分別高于分化程度高、臨床分期早以及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。提示EGFR、TTF-1、CK7可能介導(dǎo)并參與了NSCLC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，檢測(cè)EGFR、TTF-1、CK7表達(dá)可能有助于NSCLC的早期診斷和病情評(píng)估。有報(bào)道，TTF-1、CK7陽(yáng)性表達(dá)與患者性別和腫瘤大小有關(guān)[11]，本研究結(jié)果與之不符，可能與本研究選取的樣本量相對(duì)較小有關(guān)。本研究相關(guān)分析結(jié)果顯示，觀察組癌組織EGFR與TTF-1、CK7表達(dá)呈正相關(guān)，TTF-1與CK7呈正相關(guān)，提示三者聯(lián)合檢測(cè)有助于NSCLC的早期診斷及病情評(píng)估。

綜上所述，NSCLC組織中EGFR、TTF-1、CK7表達(dá)上調(diào)。EGFR、TTF-1、CK7可能參與了NSCLC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。EGFR、TTF-1、CK7表達(dá)情況可為NSCLC的早期診斷和病情評(píng)估提供依據(jù)。

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張?zhí)K寧(E-mail: zhangsn@sj-hospital.org)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.20.015

R730.51

B

1002-266X(2017)20-0049-03

2017-01-28)