程 雪 史 炯 陳潔宇 余慧萍 樊祥山

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·基礎(chǔ)研究·

Lgr5表達(dá)及Kras突變與結(jié)直腸癌臨床病理特征的相關(guān)性研究

程 雪 史 炯 陳潔宇 余慧萍 樊祥山

目的 探討Lgr5表達(dá)及Kras基因突變與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系。方法 采用免疫組織化學(xué)方法，檢測539例結(jié)直腸癌患者癌組織中Lgr5的表達(dá)，應(yīng)用聚合酶連反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增DNA直接測序法檢測Kras基因第12、13密碼子突變，并分析其與臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 在539例結(jié)直腸癌中，Lgr5總體表達(dá)率為66.79%(360/539)，在不同組織學(xué)類型、分化程度及病理分期分組中,其表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與腫瘤分化(γ=0.102，P=0.018)、腫瘤分期(γ=0.093，P=0.030)、浸潤深度(γ=0.131，P=0.002)及是否有脈管和神經(jīng)的侵犯(γ=0.087，P=0.044)呈正相關(guān)性；Kras基因突變總突變檢出率為37.29%(201/539)，Kras基因突變與性別及結(jié)腸部位有關(guān)(P<0.05)，女性及右半結(jié)腸的突變率較高。Lgr5表達(dá)與Kras基因突變間無相關(guān)性。結(jié)論 Lgr5表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，提示Lgr5可能是治療的潛在靶點(diǎn)。Kras基因突變在女性及右半結(jié)腸癌中檢出率較高，突變類型與Lgr5表達(dá)無顯著相關(guān)性。

Lgr5；Kras；結(jié)直腸癌

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:871～874)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是我國最常見的消化道腫瘤之一，是全球癌癥相關(guān)死亡的第四常見病因[1]。本文回顧性的研究結(jié)直腸癌中Lrg5表達(dá)情況及其與Kras突變之間的關(guān)系，進(jìn)一步分析Lrg5在不同臨床病理特征病變中的差別，為結(jié)直腸癌預(yù)后預(yù)測尋找可能的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選取2014年6月至2016年3月在南京鼓樓醫(yī)院手術(shù)根治性切除的結(jié)直腸癌標(biāo)本539例，其中男性319例，女性220例，年齡15～91歲(63.05±13.35)歲，年齡<60歲198例，≥60歲341例；左半結(jié)腸癌180例，右半結(jié)腸癌151例，直腸癌208例，患者術(shù)前均未行放、化療。患者臨床病理分期按第七版AJCC結(jié)直腸癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期66例，Ⅱ期198例，Ⅲ期237例，Ⅳ期38例。T1 14例，T2 73例，T3 391例，T4 61例；腫瘤最大徑≤3 cm 113例，3～5 cm 283例，>5 cm 143例；腫瘤組織學(xué)類型：腺癌495例，粘液腺癌41例，印戒細(xì)胞癌3例；細(xì)胞分化程度：高分化7例，中分化380例，低分化152例；脈管內(nèi)見癌栓164例，神經(jīng)見癌組織侵犯233例，其中123例脈管及神經(jīng)組織同時見癌組織侵犯；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移270例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移269例；無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移501例，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移38例。所有病例均經(jīng)兩位?？撇±磲t(yī)師復(fù)閱確診。

1.2 主要試劑及儀器

兔抗人Lgr5/GPR49單克隆抗體為美國abcam公司產(chǎn)品，抗體稀釋度為1∶150。二抗試劑盒是鼠兔通用型二抗，為DAKO公司產(chǎn)品。BenchMark GK全自動免疫組化染色儀購自Roche公司。樣本基因組DNA的提取試劑盒OMEGA FFPE DNA Kit為OMEGA公司產(chǎn)品。測序PCR反應(yīng)使用的BigDye V 3.1儀器購自ABI公司，引物設(shè)計(jì)、測序依試劑盒說明進(jìn)行。

1.3 免疫組織化學(xué)

標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，脫水，常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚切片。連續(xù)切片分別用于HE染色，Lgr5免疫組化染色。免疫組化染色采用EnVision法，操作步驟嚴(yán)格按照儀器操作說明書進(jìn)行。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鏡下觀察。Lgr5陽性著色部位定位于細(xì)胞膜/質(zhì)。免疫組織化學(xué)評分：400×高倍顯微鏡下隨機(jī)選擇5個視野，對免疫組織化學(xué)標(biāo)記定位準(zhǔn)確的陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并計(jì)算陽性細(xì)胞率：胞質(zhì)、陽性細(xì)胞率≤25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，≥75%為4分；染色強(qiáng)度為1，2，3分；最后計(jì)算乘積。免疫組織化學(xué)評分：0分記“-”為陰性，1～12分記“+”為陽性。

1.4 Kras基因檢測

選取腫瘤細(xì)胞豐富的蠟塊，切2 μm切片一張進(jìn)行HE染色用于劃定腫瘤細(xì)胞豐富區(qū)域；切取5 μm切片10張，經(jīng)烤片、脫蠟、水化處理，按照HE切片所劃定的區(qū)域，刮取選定的腫瘤細(xì)胞。對樣本基因組DNA進(jìn)行提取，目的DNA片段的PCR擴(kuò)增和純化，測序片段的PCR擴(kuò)增和純化，目的片段堿基序列的檢測，對結(jié)果進(jìn)行判讀。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用卡方檢驗(yàn)分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性研究使用Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 Lgr5表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)直腸癌中Lgr5總體表達(dá)率為66.79%(360/539)，Lgr5表達(dá)與組織學(xué)類型、分化程度及病理分期顯著相關(guān)(P<0.05)，與其他臨床病理特征無關(guān)。見表1。

表1 Lgr5蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系(例，%)

2.2 Kras基因第12、13密碼子的突變

539例結(jié)直腸癌患者中201例患者Kras基因總突變檢出率為37.29%(201/539)，第12密碼子突變169例，突變檢出率31.35%(169/539)，第13密碼子突變32例，突變檢出率5.94%(32/539)。不同病理特征結(jié)直腸癌Kras基因突變情況，見表2。

由表2和表3可知，539例結(jié)直腸癌中Kras基因突變與患者性別及結(jié)腸癌部位相關(guān)(P<0.05)，女性及右半結(jié)腸的突變率較高。

表2 539例結(jié)直腸癌Kras基因突變情況的比較/例

表3 331例左右結(jié)腸癌中Lgr5表達(dá)和Kras基因突變情況比較(例，%)

2.3 Lgr5表達(dá)與Kras基因突變的相關(guān)性

由表4可知，Lgr5表達(dá)與Kras基因突變無相關(guān)性。Spearman相關(guān)性分析顯示：Lgr5表達(dá)與腫瘤分化(γ=0.102，P=0.018)、腫瘤分期(γ=0.093，P=0.030)、腫瘤浸潤深度(γ=0.131，P=0.002)及是否有脈管和神經(jīng)的侵犯(γ=0.087，P=0.044)呈正相關(guān)。腫瘤分化程度與腫瘤大小(γ=0.123，P<0.001)、是否有脈管和神經(jīng)的侵犯(γ=0.172，P<0.001)，腫瘤分期(γ=0.237，P<0.001)、腫瘤浸潤深度(γ=0.213，P<0.001)、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(γ=0.289，P<0.001)及腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(γ=0.088，P=0.040)均呈正相關(guān)。脈管和神經(jīng)是否有侵犯與腫瘤分期(γ=0.375，P<0.001)、浸潤深度(γ=0.330，P<0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(γ=0.334，P<0.001)及腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(γ=0.169，P<0.001)呈正相關(guān)。腫瘤組織學(xué)非腺癌組與腺癌組比較，腫瘤分化程度較差(γ=0.418，P<0.001)、腫瘤較大(γ=0.166，P<0.001)及腫瘤浸潤深度較深(γ=0.156，P<0.001)。

表4 Lgr5表達(dá)與Kras基因突變的相關(guān)性/例

3 討論

結(jié)直腸癌是大腸黏膜上皮發(fā)生的惡性腫瘤，是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一[2]，但目前結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。

Lgr5廣泛分布于人體組織中，在大腦、脊髓、毛囊、乳腺、眼睛、胃腸道、肝臟、胰腺及生殖器官等均有表達(dá)[3]，并且在CRC中陽性表達(dá)率較癌旁正常組織中顯著增高[4-5]。在本研究中，Lgr5在CRC中的總體表達(dá)率為66.79%，并且與腫瘤的分化、腫瘤的分期、腫瘤的浸潤深度及是否有脈管和神經(jīng)的侵犯呈正相關(guān)。這說明Lgr5與腫瘤的發(fā)生進(jìn)展有關(guān)，也提示Lgr5可能是治療的潛在靶點(diǎn)。另外，也有研究小組研究提示Lgr5過表達(dá)參與CRC的出芽侵襲和轉(zhuǎn)移過程[6]。Lgr5是CRC干細(xì)胞的標(biāo)記物，在正常黏膜中也可見少量表達(dá)，但本研究未對正常組織和轉(zhuǎn)移灶中的Lgr5的表達(dá)進(jìn)行評估，所以沒有觀測到其在正常組織及侵襲和轉(zhuǎn)移中的表達(dá)。CRC患者中約有20%～45%存在Kras基因突變[7]。本研究中CRC患者Kras總突變檢出率37.29%，與其他研究結(jié)果基本一致。并且發(fā)現(xiàn)Kras基因突變與性別和發(fā)生部位相關(guān)，多見于女性及右半結(jié)腸。Lgr5在CRC的的陽性表達(dá)率[4-5,9-10]以及Kras基因的突變[8，10]與不同臨床病理特征中的相關(guān)性在各個學(xué)者的研究中不盡相同。這可能與標(biāo)本的處理方法、選取的抗體的克隆號和基因測序的儀器、檢測的基因片段、實(shí)驗(yàn)使用的方法、結(jié)果判讀的標(biāo)準(zhǔn)以及選取的標(biāo)本來源地區(qū)的不同有關(guān)。

另外，腫瘤組織學(xué)類型中其他類型分組與腺癌組比較，具有腫瘤分化程度較差，大小較大及浸潤深度較深的特點(diǎn)。同時腫瘤分化越差，腫瘤越大，分期越差，浸潤越深，越容易脈管、神經(jīng)侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

根據(jù)本研究，我們可以看出，Lgr5的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理之間存在一定的相關(guān)性，特別是與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，提示Lgr5可能是治療的潛在靶點(diǎn)，但是本研究未能闡明Lgr5表達(dá)與結(jié)直腸腫瘤干細(xì)胞之間的關(guān)系以及分子機(jī)制，并且對于Kras基因突變的研究只針對第12和第13密碼子，并不全面。Lgr5以及Kras基因突變在不同臨床病理特征中表達(dá)期待進(jìn)一步研究，為分子靶向治療提供更準(zhǔn)確的依據(jù)。

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(編輯：吳小紅)

Correlation of Lgr5 Expression and Kras Gene Mutations with Clinicopathological Features of Colorectal Cancer

CHENGXue,SHIJiong,CHENJieyu,etal.

NanjingDrumTowerHospitalAffiliatedtoMedicalSchoolofNanjingUniversity,Nanjing,210008

Objective To investigate the correlation of Lgr5 expression and Kras gene mutations with clinicopathological features of colorectal cancer(CRC).Methods The expression of Lgr5 in 539 cases of CRC were detected by immunohistochemistry.Genomic DNA was extracted and mutations of Kras gene (codon 12 and 13) were detected by polymerase chain reaction(PCR).Then to explore their relationship with the clinical pathologic features.Results In 539 cases of CRC,Lgr5 expression rate was 66.79%(360/539).Lgr5 expression had statistical significance in different histological type,differentiation degree and pathalogical staging groups(P<0.05).Lgr5 expression was positively correlated with differentiation degree(γ=0.102,P=0.018),pathalogical staging(γ=0.093,P=0.030),infiltration depth(γ=0.131,P=0.002) and whether a vasculai or nerve involvement (γ=0.087,P=0.044).The total Kras gene mutation detection rate was 37.29%(201/539).Kras gene mutation was related in sex and the site of colon groups.The mutation detection rate of female and the right colon cancer were higher than male and the left colon cancer.There was no correlation between Lgr5 expression and Kras gene mutation.Conclusion Lgr5 expression is related with colorectal carcinoma and may be a potential target for therapy.Kras gene mutation has high detection rate in female and right colon cancer,and has no significant correlation with Lgr5 expression.

Lgr5;Kras;Colorectal cancer

國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(編號：81101815)

210008 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京鼓樓醫(yī)院(程 雪，史炯，陳潔宇，余慧萍，樊祥山)；210004 南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京婦幼保健院(程 雪)

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.06.001

R735.3+7

A

1001-5930(2017)06-0871-04

2016-07-19

2016-10-09)